干细胞样 非洲爪蟾 用于研究早期神经发育特征的胚胎外植体 体外 和 在体 内

本方案的总体目标是利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）囊胚腔顶壁或动物极帽外植体，在体外和体内条件下研究神经发育背后的分子机制和细胞过程。这些方法有助于解答发育生物学和干细胞生物学领域中的关键问题，例如细胞命运的决定、细胞迁移，以及神经细胞的细胞自主性和非细胞自主性特性。所介绍的技术为探索关键神经细胞行为的基本机制提供了简单、经济、多功能且高效的工具。

这些检测方法可用于测试神经命运决定因子在重编程诱导性多能干细胞以及成熟神经来源细胞衍生化筛选中的作用。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为这些技术需要较高的手动操作技巧。当我思考分析细胞分离行为时，首次提出了这些方法的设想。

为了展平安装非洲爪蟾（xenopus laevis）前部神经管，使用塑料移液管将经过固定、脱水和再水化的胚胎转移至一个直径60毫米、盛满PBT的培养皿中。接着，在视柄水平处，将一对精细镊子插入眼与神经管之间，分离双眼。然后，小心地将镊子插入头部后方覆盖神经管的外胚层下方，仔细剥离外胚层。

完成适当的NC2杂交标记后，将胚胎转移至一个新的60毫升培养皿中，其中盛有PBT，并使用精细镊子粗略分离胚胎的前部神经管。然后，小心地从神经管下方去除松散附着的脊索。如有必要，去除耳泡及中胚层的其余部分。

当所有神经管附属结构均被切断后，将前部神经管从胚胎中分离出来。随后，将分离出的神经管转移至含有50%甘油和PBS的1.5毫升锥形管中，在4摄氏度下孵育过夜。经过90%甘油中第二次过夜处理后，将神经管转移至载玻片上少量甘油中，并使用钨针沿背侧和腹侧中线解剖神经管。

然后使用覆盖有玻璃盖玻片的加强环，将神经管的两侧固定在含有90%甘油和PBS的溶液中。为了制备用于动物帽外植体诱导的珠子，使用P200微量移液器将半份BSA处理的树脂珠转移至新的1.5毫升离心管中。随后，在4°C条件下，用200微升含有目标实验分子的培养基替换新管中的无菌蒸馏水，孵育两小时。

孵育结束后，将囊胚或早期原肠胚胚胎转移至含有钙和镁并补充了0.2% BSA的PBS中。接着，在体视显微镜下，用一对镊子的侧面夹住卵黄膜，并用另一对镊子从胚胎的植物极一侧缓慢剥离卵黄膜，注意不要损伤动物极一侧。然后，使用精细镊子从每个胚胎的动物极切下一个小方块。

使用经牛血清白蛋白（BSA）包被的移液枪头，将帽状结构转移至Terasaki多孔板的各个孔中，孔内预先加入0.5X改良Barth's生理盐水，并使带有色素的动物极一侧与孔的圆底接触。使用P20微量移液器，从处理管中挑选颜色最深的粉红色珠子，用镊子将每颗珠子置于一个帽状结构上，并将其居中放置。放置完最后一颗珠子后，将多孔板置于浸湿的滤纸上方，并用塑料容器盖住，随后进行孵育。

为制备解离并重新聚集的动物帽外植体，按前述方法分离15至30个动物帽。使用精细镊子从动物极切取一小块组织。将动物帽转移至含有无钙霍尔特弗雷特氏生理盐水的琼脂糖包被孔中，使色素面朝上。

数分钟后应观察到组织解离。使用精细镊子将色素层与其余组织分离，然后用P20微量移液器弃去色素。

当大部分色素层已被去除且细胞完全离散后，轻轻晃动培养板使细胞居中，用 P1000 微量移液器尽可能吸除培养基，注意不要触碰细胞。然后，向孔中加入 1 毫升含钙的 Holtfreter 平衡盐溶液。将离散的动物极帽转移至 1.5 毫升离心管中。

离心沉淀细胞后，使用 P1000 微量移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 20 微升含钙的霍尔特弗雷特盐溶液（Holtfreter's saline）中。在室温下孵育 3 至 6 小时，使细胞重新聚集。随后，缓慢加入 1 毫升 3/4 NAM，轻柔地使外植块从管底脱离，并使用塑料移液管将外植块分配至各个未包被的培养板中。

将动物极帽外植体移植到非洲爪蟾神经板上时，首先用3%琼脂糖和3/4 NAM包被60毫米培养皿，并在其中制作小孔。接着，将早期神经胚胚胎转移至含有钙和镁的PBS中，并补充0.2% BSA，以去除卵黄膜。然后，用新鲜的3/4 NAM填充包被了琼脂糖的解剖培养皿，并将胚胎转移至解剖培养皿中，使背侧朝上。

现在，将一个重聚集的动物帽外植体转移至解剖培养皿中，当移液管尖端穿过NAM表面后，让外植体依靠重力缓慢沉入培养皿底部。随后在体视显微镜下，用圆头镊子固定胚胎，同时使用钨针在神经板上为外植体做切口。使用圆头镊子和眉刀切下一小块重聚集的动物帽外植体。

利用组织碎片确定移植物外植体的大小。该图显示了非洲爪蟾（X laevis）和热带爪蟾（X tropicalis）在整体双NC2杂交后第30、32和35期的前部神经管平铺标本，如前所述制备。从这些图像中可以观察到，与浸有补充了音猬因子（sonic hedgehog）基因C端片段的条件培养基珠子接触的细胞中可检测到非洲爪蟾音猬因子的表达，而与经对照培养基处理的珠子接触的细胞中则无表达。

在如上所述进行解离和重新聚集后，将含有前部化动物帽细胞的这些外植体与表达 Otx2 的前部化动物帽细胞混合。如观察所示，表达 Otx2 的细胞并未与不表达 Otx2 的细胞发生分离，两类细胞在外植体中自由地相互混合。

相比之下，在将表达 Otx2 的细胞与表达 BAR HL-2、Otx2 和 IRX3 的细胞混合的外植体中，多基因表达细胞形成了紧密的细胞簇，未在外植体重新聚集后均匀扩散。如上所述，当由共表达 BAR HL-2、Otx2 和 IRX3 的细胞与表达 sonic hedgehog N-末端的细胞组成的混合外植体被移植到非洲爪蟾胚胎的前部神经板时，这些外植体表现出内源性 sonic hedgehog 表达，并与前部神经上皮细胞发生分离。而当仅由表达 Otx2 和 sonic hedgehog N-末端的细胞组成的混合外植体被移植到非洲爪蟾神经板时，移植的细胞既未表达 sonic hedgehog，也未与其邻近细胞发生分离。

一旦掌握，将动物帽外植体移植到胚胎神经板上可在两到三小时内完成，具体时间取决于移植胚胎的数量。这是一种非常可靠且极具价值的技术。在进行该操作时，必须格外注意避免细菌和真菌污染。

在完成移植操作后，可进行其他方法，如整体原位杂交，以追踪移植细胞的命运和行为。神经管器官发生过程中所涉及的发育程序在很大程度上是保守的，尤其是在脊椎动物中。因此，在两栖类中获得的信息加深了我们对脊椎动物发育过程中细胞和分子机制的理解。