利用计算机辅助视频和数字图像分析量化鱼类对急性水体铜暴露的游泳行为反应

本实验的总体目标是演示如何量化白鲟在亚致死浓度水溶性铜暴露下的行为反应。该方法有助于回答生态毒理学领域的一些关键问题，例如污染物的亚致死暴露如何影响鱼类的游泳行为。该方法可为白鲟的保护工作提供重要信息。

该方法也可轻松应用于其他鱼类、两栖类和无脊椎动物。此技术的主要优势在于其反应高度敏感，可提供毒性的早期指示，并且与生物体的存活密切相关。如果操作者不熟悉行为学测量，最初使用该方法时可能会有一定挑战。

本方案将由我的合著者 Holly Puglis 进行示范。首先，配制两升五水合硫酸铜（分析纯）水溶液。接着，平衡稀释系统和暴露用容器。

将自动注射器分配器的进样管插入原液瓶中。然后，将自动泵的加样体积设置为1毫升，并打开稀释仪。该系统可制备五种浓度的50%梯度稀释系列及一个对照。

通过四通分流器，将这些溶液输送至四个平行暴露室。接下来，启动冷水机的泵，以维持水浴温度在15摄氏度。现在，使用稀释系统的自动定时器，将其设置为每30分钟循环一次。

水箱中的水位通过立管排水装置维持。准备暴露室时，在其侧面开一个四厘米的孔，并用30微米的不锈钢网覆盖该孔。务必选择每10克鱼至少能容纳一升水的暴露室。

例如，一条89日龄的白鲟体重约为373毫克，因此可在28厘米×13.5厘米×25厘米的方形实验舱中进行测试。在实验开始、中期和结束时，分别采集24毫升测试溶液样品用于化学分析。使用连接在塑料注射器上的吸管进行采样。

将吸管更换为孔径0.45微米的聚醚砜滤膜，通过该滤膜过滤4毫升测试水样，弃去此滤液。随后，将剩余的20毫升水样过滤至经酸清洗过的聚乙烯瓶中。

用16摩尔的硝酸将样品酸化至体积百分比1%。这些样品可保存长达三个月。一旦确认测试暴露条件，每个重复测试腔室中 stocking 三条鲟鱼，鱼体总重大约每腔室升172毫克。

使用无刺激性网具收集鲟鱼，并将其转移至小桶中。总共需要144条鱼，以从六种测试溶液中获取数据。在96小时暴露期间，不要喂食鱼类。

必须每天进行持续观察，以记录死亡率和异常行为。最佳观察时间为上午，且观察者 ideally 应对实验条件设盲。失去平衡定义为鱼类无法在水体中维持直立姿势。

静止不动定义为鱼类无法自主移动或游动，除非受到刺激才会活动。同时记录其他任何异常现象，例如嗜睡、过度活跃、呼吸频率增加或减少、体色变化、震颤、痉挛、腹部膨胀、在水体中的位置异常，以及任何其他不寻常的游动模式。死亡的鱼类应立即移除。

每天还需使用手持式测定仪测量两个水样中的溶解氧浓度。在96小时暴露结束时，录制游泳行为分析视频。将测试区域置于暴露容器内。

务必选择一个足够大的测试区域，以便鱼类能够自由游动。在每个测试区域正上方，将手持摄像机安装在三脚架上。随后，从经处理的鱼类中随机选取最多三尾存活个体。

使用小型网兜将三条鱼转移至测试区域。让鱼在该区域内适应约30分钟。在鱼适应环境的同时，调整图像焦点，尽量减少因水体流动造成的反光干扰，并增强鱼体与背景之间的对比度，调节视野以确保鱼体不被遮挡。

待鱼适应环境后，开始录制并采集两分钟的视频数据。视频拍摄完成后，对鱼实施安乐死并妥善处理。将视频文件转换为数字分析软件所需的格式后，打开追踪软件，在主界面的“创建新实验”选项下选择“新建默认实验”。

填写提示信息，然后点击确定。接着，在“设置”下的“实验设置”选项中，选择视频源为视频文件，并将区域数量设置为1个。

将每个区域的受试对象数量设置为三个。接下来，在“追踪特征”下选择中心点检测，并选择所需的单位。然后，在“设置”中选择试验列表选项，并点击屏幕顶部的“添加视频”。

在对话框中选择字母顺序。单击“浏览”，导航至视频所在的文件夹，选中相关文件，然后单击“打开”。

选择视频文件后，继续在软件中定义实验范围。首先，单击屏幕顶部的“添加变量”，在标签框中输入“浓度”，在描述框中输入“铜浓度，单位为微克每升”。

接下来，在类型下拉列表中选择“数值”。单击预定义值框，在对话框中选择“定义单个值”选项。输入实验所用的浓度，每输入一个数值后单击“添加”。

然后，取消勾选“允许其他值”选项，然后单击“确定”。在范围框的下拉菜单中选择“试验”。在提供的框中输入每次试验的适当浓度。

点击屏幕顶部的“添加变量”按钮。在标签框中输入“replicate”，在描述框中输入“replicate number”。

在类型下拉列表中选择“数值”。然后，点击预定义值框，在对话框中选择“定义单独值”选项。输入一、二、三和四，并取消勾选“允许其他值”选项。

然后，单击“确定”。现在，在范围框的下拉菜单中选择试验选项。为每次试验输入相应的重复次数。

下一步是设置实验区域空间。首先在“设置”选项卡下选择实验区域设置，并将第一个设置命名为“试验一”。在对话框中，选择“抓取背景图像”选项，然后点击“浏览”。

找到第一次试验的视频文件并点击打开。视频显示后，点击“抓取背景图像”对话框中的抓取按钮。接下来，点击屏幕顶部附近“arena settings”（区域设置）下方的白色圆形图标，并调整出现的圆形以圈定游泳区域。

然后，点击 arena 设置下的校准标尺图标。使用单击-按住-拖动的方式选择 arena 区域。现在，在校准距离的真实世界距离框中输入 10.5。

然后，单击“确定”。如有必要，调整校准线，使其贯穿圆形实验区域的整个直径。在实验区域设置框中单击“验证实验区域设置”选项，并解决任何未通过验证的设置问题。

现在，重复此过程，直到为每次试验定义所有区域。接下来，设置鱼类检测参数。首先，在屏幕左侧的实验探索工具栏中，从“设置”选项下选择检测设置。

然后，在检测设置的“方法”下拉菜单中选择动态减影。同时，在对话框中的“受试者识别”下为每个受试者选择一种填充颜色。接下来，选择“选择视频”，并找到第一组试验的视频文件。

在检测设置的一个对话框中，将视频下的采样率输入框填写为 5.9941。在同一对话框中，点击检测下参考图像选项的设置。然后，在参考图像对话框中，点击开始学习 C 选项。

当参考图像对话框中的图像显示无动物时，单击该对话框内采集设置下的“使用动态参考图像”，然后关闭此对话框。现在，在检测设置对话框的“检测中的对象”下拉菜单中选择“较暗”。对于检测下的暗对比度，将较小数值设为33，较大数值设为153。

然后，单击右下角的“保存更改”。现在，确认该软件正在成功追踪动物，而非阴影或碎片。单击回放控制对话框中的播放按钮，并根据需要调整暗对比度数值。

务必保存所做的任何调整。软件现已设置为从视频中采集数据，因此下一步任务是追踪每次试验中的鱼类。首先，在屏幕左侧的实验资源管理器工具栏中，从设置选项下选择采集。

接下来，点击采集设置对话框中的“跟踪下一个计划试验”按钮，并确认正确的试验、视频和实验区域设置均在采集设置对话框的设置下方显示。然后，在采集控制对话框中勾选“检测确定速度”选项。点击带有白色方框内绿色圆圈的按钮，以开始采集过程。

重复此过程，直到所有试验均已被追踪。现在，可以对被追踪的对象（即鱼类）进行分析。首先，点击屏幕左侧实验资源管理器工具栏中“分析”选项下的数据剖面。

然后，在组件工具栏的嵌套选项中选择时间。在时间对话框的“选择轨道时间间隔”设置下，将“到”值调整为两分钟，然后单击确定。接着，将嵌套框从屏幕右侧的数据配置文件区域中拖动到起始框与结果框之间。

在屏幕左侧的实验浏览器工具栏中，查看分析选项下的分析配置文件，然后点击。接着，在因变量工具栏的距离和时间标题下，点击速度。点击添加，然后在因变量工具栏的距离和时间标题下，点击移动距离。

然后，在“移动距离”对话框中点击“添加”，并在因变量工具栏的“个体行为”标题下点击“移动”。在“移动”对话框中，查看“离群值滤波”标题下的设置，将平均时间间隔调整为1。接着，在“阈值”标题下，将启动速度调整为2.00，停止速度调整为1.75。

在“计算统计”标题下，勾选“移动”和“不移动”的两个复选框。然后，点击“添加”，并在屏幕左侧实验资源管理器工具栏的“结果”选项下，点击“分析输出”。接着，点击“计算”。

计算出因变量后，单击屏幕顶部的“导出”按钮。在“导出分析结果”对话框中选择目标文件夹，然后从文件类型下拉菜单中选择 Excel。接着，单击“确定”。

最后，点击屏幕顶部文件选项卡下的保存实验。关闭数字追踪软件。将数据导入电子表格文件，并使用商业统计分析软件包进行分析。

暴露于不同浓度的铜仅72小时后，孵化后两天的鲟鱼便表现出多种可观察到的异常。游泳行为受到明显影响。视频数据有助于明确这种行为障碍。

在进一步的测试中，孵化后30天的鲟鱼对96小时的铜暴露表现出敏感性。随着铜浓度的增加，游泳速度、运动时间以及移动距离均显著减少。随着铜浓度的增加，游泳路径也有所减少。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在毒性测试中量化生物行为。该技术可为环境管理者提供一种利用行为定义的标准来记录环境损害并指导生态修复的方法。在实施该程序时，重要的是要记住，在记录行为观察结果时必须保持一致性。

通过遵循此流程，还可以量化摄食和攻击性等其他行为，以进一步探究污染物暴露对生存的长期影响。