Name: 使用计算机辅助视频和数字图像分析量化鱼游泳行为应对水铜的急性接触 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: 学习使用计算机辅助视频分析技术量化白鲟幼鱼在亚致死铜浓度暴露下的游泳行为变化。该方法为生态毒理学研究提供敏感的早期毒性指标，可应用于其他鱼类及水生生物的行为评估。

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感谢美国地质调查局哥伦比亚环境研究中心的生态学部门、毒理学部门和环境化学部门工作人员提供的技术和分析支持。部分资金由 Teck American Incorporated 提供，通过美国环境保护局（USEPA）第10区与美国地质调查局（USGS）的协议资助，资金来源于美国环保局通过内政部中央危险物质基金向美国地质调查局提供的拨款。

1. 为幼鲟暴露于水体铜浓度设置稀释系统
<ol>
	<li>使用改良的Mount和Brungs流水系统设置暴露实验12 稀释系统遵循美国材料与试验协会（ASTM International）的指南13,14,15.</li>
	<li>根据先前的测试结果，选择25 µg/L作为高铜浓度，因在4–6 µg/L时已观察到效应。使用试剂级五水硫酸铜(II)（&#62;98% 纯度）并配制测试用储备液。 
	注意: 暴露实验的示例浓度系列为 25、12.5、6.25、3.125、1.0625 和 0 µg/L。采用从 25 µg/L 开始的 50% 倍比稀释法，可覆盖已观察到引起行为功能障碍的浓度范围。</li>
	<li>在暴露开始前48小时，使用容量瓶配制测试储备液，并设置自动注射分配器向稀释系统混合室加标供液。</li>
	<li>使用电子表格模板确定将多少质量的化学物质加入1 L去离子水中，当稀释器混合室加入1 ml测试储备液时，可使铜浓度达到25 µg/L。 
	注意: 图1 展示了用于稀释剂毒性测试的化学品储备液配制用电子表格模板示例。</li>
	<li>使用分析天平称取195 mg分析纯五水合硫酸铜(II)，倒入1 L容量瓶中，加入1 L去离子水混匀，得到48.65 mg/L的储备液。</li>
	<li>将自动注射器分配器的进样管插入测试储备液中，设置加标体积为1 ml，打开稀释器电源开关，运行48小时，使溶液在放养鲟鱼前充分平衡至相应的铜浓度。</li>
	<li>连接一个管路内四通分流器16 将水流分配至稀释器水浴中的四个平行暴露室的每条输送管路。通过重力供给水源。当稀释器通电后，启动循环，打开电磁阀，使水流入稀释水箱。将冷水机组设定为15°C，并开启水泵以循环稀释器水浴中的水。 
	注意: 该过程由自动定时器控制。</li>
	<li>将稀释器设置为使用自动定时器每30分钟循环一次，每次循环向每个重复测试腔室输送250 ml测试水，相当于每天向每个腔室添加12次体积的测试水。</li>
	<li>根据鲟鱼的大小选择暴露试验舱，以维持可接受的装载率，即 &#60;任何时间、任何容器中每升水体的鱼类湿重为10克。例如，若对30日龄（dph）的白鲟（平均体重0.17克）进行暴露实验，使用12 × 21.5 cm的容器2 侧面带有4 cm孔洞的玻璃罐，孔洞处覆盖30微米不锈钢网筛，以允许测试水流通。暴露用玻璃罐中测试水的体积为1 L。</li>
	<li>使用50 ml塑料注射器，从每种浓度中分别采集两份50 ml水样，共12份样品，将测试水样分装至100 ml玻璃烧杯中，利用标准商用设备测定溶解氧（DO）、温度、电导率、pH、碱度、硬度、总氨、主要阳离子、主要阴离子和溶解有机碳，并遵循仪器制造商的说明操作。 
	注意: 应在暴露开始和结束时采集样本。</li>
	<li>为进行化学分析而采集子样品时，使用一支25 ml塑料注射器，通过连接在注射器上的吸管（而非针头）从暴露室中吸取约24 ml测试水样。</li>
	<li>从注射器上取下吸管，并在塑料注射器上安装一个内含0.45 µm孔径聚醚砜膜的聚丙烯滤器滤芯。</li>
	<li>将4 ml测试水推过滤膜，弃去。</li>
	<li>将剩余的20 ml测试水通过滤膜注入已用酸清洗的聚乙烯瓶中，并加入高纯度、16 M硝酸酸化至体积分数1%，可保存长达3个月。 
	注意: 应在暴露开始、中期和结束时采集样品进行化学分析，以确认铜浓度。</li>
	<li>采用美国环境保护局方法 6020a 进行电感耦合等离子体质谱化学分析17</li>
	<li>在采集完所有水样且稀释系统开始循环后，随机将10尾鲟鱼放入每个重复试验腔室中。使用小孔径、无损伤的网从养殖池中捕捞鲟鱼，并将其置于装有养殖用水的小桶中。暴露试验开始时共需240尾鱼。</li>
	<li>暴露期间不要喂食鱼类。 
	注意: 请参阅 图1 稀释仪布局的可视化设置。</li>
	<li>每天观察测试情况，持续至暴露期结束，记录鱼类死亡率并监测其游泳行为。 
	注意: 其他需要观察的终点指标包括嗜睡、失去平衡、呼吸变化、体色改变、鱼在水体中的位置、躲藏行为，以及任何其他可通过视觉识别的异常现象。 
	注意：为了保持一致性，每天在同一时间读取检测结果。</li>
	<li>使用市售的数字追踪软件程序测量并量化游泳活动（鱼类运动所花费的时间、速度和移动距离）。</li>
</ol>
2. 暴露期间的观察与死亡率统计
<ol>
	<li>目视检查每个测试室，使用行为检查表记录死亡率及异常行为的观察结果表1在96小时暴露期间，每天大致相同的时间（最好在早晨）记录数据表上的数据。 
	注意: 与对照组相比，在表现上显著、非典型、主观感受上以及定性方面明显不同的行为被视为异常。理想情况下，观察者应不了解处理分组情况。 
	注意: 失去平衡定义为鱼类无法在水体中保持直立姿态，不动性定义为鱼类无法移动或游动，除非受到刺激。其他异常现象，如嗜睡、过度活跃、呼吸频率增加或减少、体色变化、震颤、痉挛、腹部膨胀、在水体中的位置异常以及任何其他不寻常的游动模式，也应记录在数据表上。 
	注意: 参见视频1以了解异常行为的示例。</li>
	<li>每天记录并清除死亡的鲟鱼。</li>
	<li>使用手持式溶解氧（DO）探头测量仪测量溶解氧 原位 在每种暴露浓度下取两个重复样本，记录水温，并填写在数据表上。</li>
</ol>
3. 录制游泳活动视频
<ol>
	<li>使用安装在三脚架上的手持摄像机，从测试容器正上方拍摄视频数据样本，以记录行为异常。</li>
	<li>为量化游泳活动，截取一段直径13 cm、高13 cm的PVC管作为测试区域（图1）。将PVC管置于稀释系统中各相应铜浓度暴露水箱内。使用PVC管内部区域作为测试区域，因其空间足够鲟鱼自由游动。</li>
	<li>在96小时暴露结束后，从每个铜浓度组中随机选取5尾存活的鲟鱼用于测量游泳活动，并使用小孔径网捞将其放入测试区域。 
	注意：在较高测试浓度下，若鲟鱼死亡率较高，则应使用所有剩余存活个体进行游泳活动测量，此时数量可能少于5尾。</li>
	<li>将鱼放入测试区域后，使其适应环境30分钟。 
	注意：视频的准确无误分析要求鱼体与背景之间具有高对比度，且背景结构尽量简单，以免遮挡或掩盖鱼体影像。鱼体图像必须清晰对焦，且不得有水面反光或因水流运动引起的图像畸变，因此必须关闭稀释系统。</li>
	<li>30分钟后，打开摄像机并设置为录像模式，持续记录2分钟的游泳活动。</li>
	<li>完成视频录制后，对鱼实施安乐死以确定其行为表现。</li>
	<li>将鲟鱼置于高浓度三卡因甲磺酸盐（MS222）水溶液中至少10分钟，直至鳃盖运动完全停止。 
	注意：建议使用浓度不低于250 mg/L，某些物种可能需要更高浓度。</li>
	<li>将已安乐死的鲟鱼放入塑料自封袋中，置于冷冻柜中暂存，待后续处理。关闭摄像机，并将所有视频文件转移至计算机，使用数字追踪软件进行后期处理。</li>
</ol>
4. 来自视频回放的游泳活动测量指标
<ol>
	<li>定位待分析实验的数据表和视频数据文件。将视频文件转换为数字分析软件可兼容的格式。</li>
	<li>将所有待处理文件上传至软件。通过点击图标打开追踪软件。点击 &#34;新的默认实验&#34; 在……之下 &#34;创建新实验&#34; 主屏幕上的选项。</li>
	<li>输入实验名称 &#34;新实验&#34; 屏幕上出现的对话框。选择实验文件的保存位置，然后单击 &#34;好的&#34;选择 &#34;实验设置&#34; 选项位于下方 &#34;设置&#34;.选择 &#34;从视频文件&#34; 下 &#34;视频来源&#34;.</li>
	<li>选择 &#34;1&#34; 用于 &#34;竞技场数量&#34;选择 &#34;3&#34; 用于 &#34;每个实验区域的受试者数量&#34;选择 &#34;中心点检测&#34; 下 &#34;追踪特征&#34;选择所需的单位。</li>
	<li>选择 &#34;试验列表&#34; 选项下方 &#34;设置&#34;点击 &#34;添加视频&#34; 屏幕顶部。选择 &#34;字母顺序&#34; 下 &#34;排序顺序&#34; 选项开启 &#34;添加视频&#34; 屏幕上出现的对话框。单击 &#34;浏览&#34;. 导航至视频文件所在的文件夹。</li>
	<li>高亮所有视频文件。点击 &#34;开放&#34;. 点击 &#34;添加变量&#34; 屏幕顶部。输入 &#34;浓度&#34; 进入 &#34;标记&#34; 盒。输入 &#34;铜浓度（微克/升）&#34; 进入 &#34;描述&#34; 盒子</li>
	<li>选择 &#34;数值的&#34; 从下拉列表中选择 &#34;类型&#34;. 点击 &#34;预设值&#34; 盒。选择 &#34;定义单个值&#34; 选项在 &#34;预定义数值&#34; 出现的对话框</li>
	<li>输入 &#34;0&#34;, &#34;3&#34;, &#34;6&#34;, &#34;13&#34;, &#34;25&#34;，以及 &#34;50&#34; 在 &#34;预设值&#34; 空间。单击 &#34;在每次数字相加时添加 >>"。取消勾选 &#34;允许其他值&#34; 选项。点击 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>选择 &#34;试验&#34; 从下拉菜单中 &#34;范围&#34; 方框。在提供的方框中输入各次试验的适当浓度。点击 &#34;添加变量&#34; 屏幕顶部。输入 &#34;重复&#34; 进入 &#34;标记&#34; 盒。输入 &#34;重复次数&#34; 进入 &#34;描述&#34; 盒。选择 &#34;数值的&#34; 从下拉列表中选择 &#34;类型&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;预设值&#34; 盒。选择 &#34;定义单个值&#34; 选项中的 &#34;预定义数值&#34; 对话框。输入 &#34;1&#34;, &#34;2&#34;, &#34;3&#34; 和 &#34;4&#34; 在 &#34;预设值&#34; 空间。单击 &#34;在每次数字相加时添加 >>"。取消勾选 &#34;允许其他值&#34; 选项.点击 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>选择 &#34;试验&#34; 从下拉菜单中 &#34;范围&#34; 方框。在提供的方框中为每次试验输入相应的重复数。选择 &#34;竞技场设置&#34; 在……下方 &#34;设置&#34; 屏幕顶部的标签。命名第一个设置 &#34;试验1&#34;. 点击 &#34;获取背景图像&#34; 选项来自 &#34;Arena 设置（试验 1）&#34; 对话框</li>
	<li>点击 &#34;浏览&#34; 在 &#34;抓取背景图像&#34; 对话框。找到试验1的视频文件，然后单击 &#34;打开&#34;. 点击 &#34;抓取&#34; 选项中的功能 &#34;抓取背景图像&#34; 视频出现后的对话框。点击屏幕顶部附近的白色圆形图标 &#34;竞技场设置&#34;.</li>
	<li>移动出现的圆形，使整个游泳区域被圆圈完全包围。当确定区域范围时，边界处将显示刻线标记。单击 &#34;校准刻度&#34; 屏幕顶部下方的图标 &#34;竞技场设置&#34;单击竞技场的一侧边缘，按住鼠标并拖动至竞技场的对侧边缘，然后松开鼠标左键。</li>
	<li>进入 &#34;10.5&#34; 在 &#34;真实世界距离&#34; 框内 &#34;校准距离&#34; 出现的对话框。单击 &#34;好的&#34;如有必要，调整校准线，使其贯穿圆形实验区域的整个直径。</li>
	<li>点击 &#34;验证 Arena 设置&#34; 选项开启 &#34;Arena 设置（试验 1）&#34; 对话框。如果设置未通过验证，请解决相关问题。右键单击 &#34;竞技场设置&#34; 在……下方 &#34;设置&#34; 选项从 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏并选择 &#34;新方法&#34; 从菜单中。</li>
	<li>重复步骤 4.11–4.15，直至为每次试验创建好相应的实验区域设置。务必为每次试验选择相应的视频文件。选择 &#34;检测设置&#34; 在……下方 &#34;设置&#34; 选项从 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏。</li>
	<li>选择 &#34;动态减影&#34; 从下拉菜单中 &#34;方法&#34; 在 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 出现的对话框中，为每位受试者选择不同的填充颜色 &#34;受试者识别&#34; 在 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框</li>
	<li>选择 &#34;选择视频&#34; 并找到试验1的视频。点击 &#34;打开&#34;选择 &#34;5.9941&#34; 从 &#34;采样率&#34; 盒下 &#34;视频&#34; 在 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框。单击 &#34;设置&#34; 对于 &#34;参考图像&#34; 选项位于下方 &#34;检测&#34; 在 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框</li>
	<li>点击 &#34;开始学习 (C)&#34; 选项在 &#34;参考图像&#34; 对话框。等待程序学习参考图像。一旦图像在 &#34;参考图像&#34; 对话框在没有动物的情况下出现，单击 &#34;使用动态参考图像&#34; 在……下方 &#34;采集参数设置&#34; 在对话框内。</li>
	<li>点击 &#34;关闭&#34;选择 &#34;较暗&#34; 从下拉菜单中选择 &#34;受试者是&#34; 在……下方 &#34;检测&#34; 在 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框。设置较小的数值以 &#34;33&#34; 以及更大的数量 &#34;153&#34; 用于 &#34;暗对比度&#34; 下 &#34;检测&#34; &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框</li>
	<li>点击 &#34;保存更改&#34; 右下角 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框。点击播放按钮 &#34;播放控制&#34; 对话框，并确认软件正在成功追踪动物，而非阴影或碎片。调整数值以 &#34;暗对比度&#34; 根据需要。</li>
	<li>一旦开始追踪合适，单击 &#34;保存更改&#34; 右下角 &#34;检测设置：检测设置 1&#34; 对话框。选择 &#34;采集&#34; 下 &#34;设置&#34; 选项从 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏。</li>
	<li>点击 &#34;追踪下一次计划的试验&#34; 在 &#34;采集参数设置&#34; 对话框。确认下方显示的试验、视频和区域设置正确无误 &#34;设置&#34; 在 &#34;采集参数设置&#34; 对话框</li>
	<li>检查 &#34;检测决定速度&#34; 选项中的功能 &#34;采集控制&#34; 对话框。点击白色方框内的绿色圆形按钮，开始采集过程。重复步骤 4.22–4.23，直至所有试验均已完成追踪。</li>
	<li>点击 &#34;数据图谱&#34; 下 &#34;分析&#34; 选项从 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏。选择 &#34;时间&#34; 下 &#34;筑巢&#34; 选项在 &#34;组分&#34; 工具栏。调整 &#34;至&#34; 到 &#34;0:02:00&#34; 在……之下 &#34;选择轨迹时间间隔&#34; 标题中的 &#34;时间&#34; 对话框。单击 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>拖动 &#34;巢&#34; 盒子之间 &#34;开始&#34; 盒和 &#34;结果 1&#34; 框中的 &#34;数据图谱&#34; 屏幕右侧区域。单击 &#34;分析概况&#34; 在……之下 &#34;分析&#34; 选项从 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏。点击 &#34;速度&#34; 在……之下 &#34;距离与时间&#34; 标题中的 &#34;因变量&#34; 工具栏</li>
	<li>点击 &#34;添加&#34; 在 &#34;速度&#34; 对话框。点击 &#34;移动距离&#34; 在……之下 &#34;距离与时间&#34; 方向在 &#34;因变量&#34; 工具栏。点击 &#34;添加&#34; 在 &#34;移动距离&#34; 对话框。单击 &#34;运动&#34; 在……之下 &#34;个体行为&#34; 方向在 &#34;因变量&#34; 工具栏</li>
	<li>调节 &#34;平均间隔&#34; 到 &#34;1&#34; 在……之下 &#34;异常值滤波器&#34; 方向在 &#34;运动&#34; 对话框。调整 &#34;起始速度&#34; 到 &#34;2.00&#34; 和 &#34;停止速度&#34; 到 &#34;1.75&#34; 在……之下 &#34;阈值&#34; 标题中的内容 &#34;运动&#34; 对话框</li>
	<li>同时勾选两个方框 &#34;移动&#34; 和 &#34;不移动&#34; 在……之下 &#34;计算统计量&#34; 方向在 &#34;运动&#34; 对话框。单击 &#34;添加&#34; 在底部 &#34;运动&#34; 对话框。单击 &#34;分析输出&#34; 在……下方 &#34;结果&#34; 选项在 &#34;实验探索器&#34; 屏幕左侧的工具栏。点击 &#34;计算&#34; 屏幕顶部</li>
	<li>因变量计算完成后，单击 &#34;导出&#34; 屏幕顶部。选择目标文件夹 &#34;导出分析结果&#34; 对话框。选择 &#34;Excel&#34; 从 &#34;文件类型&#34; 下拉菜单中的 &#34;导出分析结果&#34; 对话框。点击 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;保存实验&#34; 在……之下 &#34;文件&#34; 屏幕顶部的标签。关闭数字追踪软件。将数据导入电子表格文件，并使用商业统计分析软件包进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

对任何商品、公司或产品名称的使用仅用于描述性目的，并不意味着美国政府的认可。

由于暴露于污染物而导致的行为变化常被用作亚致死毒性的终点指标，但这类变化往往难以测量。通常，行为反应通过视觉观察和人工数据分析来测定，这需要大量时间进行处理。然而，随着技术的进步，量化游泳活动的方法已转向使用录像技术18和运动分析或数字追踪软件，从而显著减少了数据处理与分析所需的时间。在对所采集视频数据进行分析时，若采用人工方式量化游泳参数将极为耗时，因此利用视频记录结合鱼类追踪软件为分析鲟鱼游泳行为提供了更有效且高效的方法。尽管本实验重点描述了鱼类的游泳行为，但通过简单修改，该方法也可适用于其他生物，如两栖动物和水生无脊椎动物。根据所关注的具体行为终点指标，实验设计和摄像系统可相应调整，以配合几乎任何 commercially available 追踪软件包使用。
本方法以溶解铜为例进行演示，但同样适用于其他水相污染物或特征，如温度或含氧量。本文所开发和展示的实验方案采用简单的数码摄像机作为记录设备。数字文件可轻松传输至计算机，并上传至运动分析软件。该方法正不断被修改和完善，以优化定量分析流程。为确保分析软件能够识别并追踪每一条鱼，视频质量必须达到高清标准。任何与鱼体颜色对比度不足的背景都会在数据文件处理过程中引发问题。二维视频追踪的另一个常见问题是当鱼类游动路径交叉时难以区分个体。该问题可通过手动方式进行校正，即在路径交叉期间识别每条鱼，并在软件中连接相应的路径片段。或者，也可将每个重复实验单元的总体活动量作为群体平均值进行测定。多个独立的实验单元（每个单元仅含一条鱼）可在同一视野内同时拍摄，以分别计算各条鱼的运动情况。
目前我们已升级为在暴露室上方使用一系列头顶监控摄像头，这些摄像头连接到高清数字视频记录设备（HD-DVR）。然而，任何能够录制高清MPEG-4视频的摄像系统均可使用。HD-DVR可设置为在指定时间开始录制，并可编程连续工作长达7天。这种无需人工干预的自动化方法可同时捕获多个视频，从而在尽量减少可能影响鱼类行为的外界干扰的同时，保持实验的一致性。HD-DVR系统连接至内部网络，因此文件传输相对简便。尽管自动化摄像系统在量化游泳行为方面是一项显著改进的技术，但仍建议进行人工视觉观察，以作为记录毒性测试期间行为异常的补充支持信息。
早在20世纪60年代初，就有大量文献记载了鱼类因暴露于金属而引起的异常行为19,20,21。研究表明，铜可导致鱼类活动水平发生变化，例如蓝鳃太阳鱼22 （Lepomis macrochirus rafinesque）出现活动减少，以及溪鳟23 （Salvelinus fontinalis）的运动行为和摄食活动发生改变。至少部分幼鱼依赖嗅觉来探测并躲避捕食者，而铜引起的化学感受功能剥夺可能会影响其对警戒化学物质的识别相关行为24,25,26。铜暴露会损伤嗅觉上皮，从而影响感觉机制，可能导致方向感丧失、行为回避、摄食减少以及其他依赖嗅觉引导的行为异常27。这些行为改变与暴露实验中所观察到的现象一致。
在亚致死浓度的水溶性铜暴露期间，白鲟的游泳行为受到显著影响。这些结果说明了在铜的亚致死浓度下行为如何受到影响，并可将行为变化用作毒性胁迫的指示指标。基于视频的分析方法在量化游泳行为方面被证明是有效的，同时也为暴露于铜的鲟鱼所遭受的严重效应提供了定性的视觉记录。该分析软件还能够量化其他多种行为终点指标，请参见Table 1中的列表。暴露系统可进行改造，以实时监测每个行为终点，并可用于量化与暴露于不同关注污染物相关的行为差异。
在水生毒理学研究中，行为终点的使用日益广泛，在评估污染物影响时应予以考虑，因为适应性行为功能对于确定环境损害至关重要9。环境污染物对鱼类行为的影响通常具有主观性且难以评估，尤其是在缺乏标准方法的情况下处理亚致死终点时更为困难。
通过这些方法定量的游泳活动可被严格监测，对生物体无损伤且产生的应激最小，并可重复进行。游泳行为是亚致死毒性的一个有效且一致的指标，应纳入测试方案中，以提高标准毒性测试的敏感性5。

了解污染物暴露如何影响行为有时极具挑战性且具有主观性。行为通常被定义为一系列通过中枢神经系统运作的、可被直接观察到的、涉及整个机体的活动，这些活动使生物体能够生存、生长和繁殖。由于接触有毒物质而导致的行为改变，是环境胁迫最敏感的指标之一，其敏感性通常比存活率高10至100倍1。大多数研究集中于鱼类的游动活动、呼吸运动及觅食行为2,3,4。在毒性测试中，游动活动是最常用于判断污染物引起行为变化的亚致死终点指标5。游动相关参数包括运动频率与持续时间、速度与移动距离、转向频率与角度、在水体中的位置以及游动模式。根据《水生毒理学基础》一书中Rand在第九章提出的标准，游动活动是在评估生物对有毒物质敏感性时衡量游泳行为的有效指标6。
本文以毒理学研究为例，阐述了在仅水暴露条件下，针对不同早期发育阶段的白鲟（Acipenser transmontanus）评估铜对其早期生命阶段的毒性，并结合鲟鱼游泳行为进行分析，同时展示了量化游泳行为的方法。
在以往的研究中，急性或慢性铜暴露的最初几天内即出现明显的不良行为反应，且随着暴露时间的延长和浓度的增加，反应逐渐加重7,8,9。这些行为反应的发生程度和时间很可能足以限制生物的长期存活，因此考虑到其对种群补充失败的潜在影响，值得引起关注10。为了准确解读这种敏感性的意义，研究人员建立了金属暴露的方法和操作流程，以量化行为损伤随铜浓度变化的时间进程和严重程度。
通过分析暴露室中鲟鱼的俯视视频样本，建立了行为功能与发育的测试方案。在暴露期间，视频样本为不同铜处理组的发育和功能提供了定性评估。在暴露于水体铜浓度的过程中，对行为和寻找庇护所的活动进行了评估，以确定产生效应的时间，并表征影响寻找庇护所、嗜睡、游泳协调性、平衡和呼吸等功能障碍的时间序列。此外，从每个重复组中随机选取部分鲟鱼进行视频记录，以定量记录其自发游泳活动。这些终点指标包括运动持续时间或运动时间、游泳速度和移动距离5,11，采用 commercially available 数字图像分析软件进行测量。该软件可定义视野内每帧图像的轮廓，并据此确定每个图像的质心。随后，软件可通过逐帧追踪每个质心的位置，确定其运动轨迹。
本研究遵守《动物福利法》法规（9 CFR）的所有适用条款，以及机构制定的有关实验生物在培养和实验过程中人道待遇的所有指南。研究结束后，所有鱼类均根据美国地质调查局哥伦比亚环境研究中心机构动物护理和使用委员会批准的适当指南实施安乐死。

<table><tbody><tr><td>五水硫酸铜(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>关注污染物</td></tr><tr><td>注射器分配器</td><td>Hamilton MicroLab 600 Series</td><td></td><td>用于添加化学物质的装置</td></tr><tr><td>2 L 容量瓶</td><td></td><td></td><td>储存储备液的容器</td></tr><tr><td>24 个 1.5 L 玻璃广口瓶</td><td></td><td></td><td>2 日龄鲟鱼的测试容器</td></tr><tr><td>摄像机</td><td>Sony Handycam HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字追踪软件</td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-17&quot; 平板显示器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 个监控摄像头</td><td>Model CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-16 通道数字录像设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶解氧测定仪</td><td>YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 探针</td><td>Orion&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨测定仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨探针</td><td>Orion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷却装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环水泵</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用计算机辅助视频和数字图像分析量化鱼类对急性水体铜暴露的游泳行为反应

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

水生生物对环境污染物的行为反应可能是生存、生长或繁殖等其他效应的前兆。然而，这些反应可能较为细微，测量起来具有挑战性。本文以幼年白鲟（Acipenser transmontanus）在铜暴露条件下的实验为例，阐述了利用计算机辅助视频和数字图像分析技术来量化行为反应的方法。在以往的研究中，已观察到早期生命阶段的白鲟在急性及慢性铜暴露期间出现严重的游泳行为障碍。鲟鱼的行为迅速受损，严重到在自然环境中其生存将面临威胁，例如可能被水流冲向下游，或极易被捕食者捕获。本研究的目的是展示在一系列急性铜暴露实验中用于量化游泳活动的实验方案，以确定在早期生命阶段发育过程中产生效应的时间，并阐明这些行为反应对于这类脆弱早期生命阶段鱼类生存的重要意义。由于死亡率随时间呈连续变化，明确铜对游泳能力产生影响的起始时间，有助于我们理解其对种群水平效应的潜在影响。所采用的技术方法可轻松适用于其他生物与胁迫因子的实验设计。

人工处理视觉观测数据表明，在暴露于不同铜浓度仅72小时后，以孵化后2天（dph）的鲟鱼为起始实验对象，其异常率随铜浓度增加而上升（图2）。视频样本记录了铜暴露对鲟鱼游泳行为造成的严重干扰（视频2），并有助于据此界定其行为功能受损情况。在另一示例中，30 dph的鲟鱼对铜暴露表现出敏感性，仅依据死亡率计算，其96小时半数致死浓度（LC50）为40.3 µg/L。然而，当将亚致死行为终点（如失去平衡和活动能力丧失）与死亡率一并考虑时，敏感性显著提高，估计的96小时半数效应浓度（EC50）范围为2.4至5.0 µg/L。视频记录捕捉到了这些亚致死效应，进一步验证了暴露期间人工观察所记录的行为异常。使用数字追踪软件显著缩短了分析游泳活动所需的后期处理时间。随着铜浓度的增加，鱼类的游泳速度、运动时间以及移动距离均显著下降（图3）。游泳轨迹范围也随铜浓度升高而减小（图4）。
<img alt="化学毒性测试制备表格；包含稀释公式、目标浓度设置。" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：用于确定测试储备液浓度的电子表格模板的计算机截图。 稀释器毒性测试所用化学储备液的配制是基于目标浓度，通过电子表格模板计算确定的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示水产养殖池中水处理水平的实验设置：对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组。" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：稀释系统设置与实验设计。 不同生命阶段的白鲟暴露于铜。根据鱼体大小选择用于暴露实验的稀释系统规格。（a）早期生命阶段的鲟鱼使用小型稀释系统进行暴露；（b）较晚生命阶段的鲟鱼使用大型稀释系统进行暴露。
<img alt="铜毒性对鱼类的影响：柱状图显示运动持续时间、距离和速度下降。" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：早期生命阶段的白鲟（Acipenser transmontanus）经72小时铜暴露后的游泳行为结果（从孵化后30天[dph]的鱼开始）。游泳活动指标（a）30 dph白鲟的运动持续时间；（b）游泳速度；以及（c）移动距离，随着铜浓度增加而在暴露96小时的白鲟中下降。星号表示与对照组相比存在显著差异，误差线代表标准差。
<img alt="铜毒性对行为的影响；柱状图；铜浓度与异常行为百分比的关系。" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：早期生命阶段的白鲟（Acipenser transmontanus）经 96 小时铜暴露实验的结果（起始暴露时间为孵化后第 2 天 [dph] 的鱼体）。在 96 小时暴露期间经 72 小时处理后，存活的白鲟（2 dph）表现出平衡能力丧失和运动抑制现象，且随铜浓度增加而加剧。星号表示与对照组相比存在显著差异，误差线代表标准差。
<img alt="白鲟的游动路径，对照组与高铜处理组，实验示意图，行为分析。" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：早期生命阶段白鲟（Acipenser transmontanus）经96小时铜暴露后的游动路径示例（起始实验鱼为孵化后30天[dph]）。 使用数字追踪软件记录的白鲟游动路径，分别来自（a）对照组重复实验（n = 5 条鱼）和（b）高浓度处理组（50 µg/L）重复实验（n = 3 条鱼），暴露时间为96小时。需注意，游动路径的数量并不完全代表实验腔室内鱼的数量，因为部分鱼处于不活动状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>可量化参数</td>
			<td>观察性参数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>速度</td>
			<td>嗜睡/过度活跃</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>移动距离</td>
			<td>失去平衡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>在区域中停留的时间</td>
			<td>痉挛/震颤/倒置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>区域转换次数—生物体在选定区域之间移动的次数</td>
			<td>在水体中的位置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>朝向目标点—计算动物运动路径朝向兴趣点的偏差</td>
			<td>呼吸频率（快/慢）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>朝向—计算选定身体部位的运动方向</td>
			<td>体色变化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转向角—两次采样间朝向的变化差值</td>
			<td>躲藏行为</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>角速度—通过将转向角除以采样间隔计算得出</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蜿蜒度—通过将转向角除以移动距离计算得出，用于比较不同移动速度下动物的转向行为</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>移动持续时间</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>运动状态—计算被检测为动物的整个区域发生变化的持续时间，即使其中心点保持不变</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>旋转—当选定的身体部位累计转向角达到360°时完成一次完整旋转。反向转动小于阈值的情况将被忽略</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>连续运动性—计算被检测动物整体区域的运动百分比，即使其中心点保持不变</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>个体间距离—计算所有作用个体与选定接收个体之间的距离</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>接近性—计算作用个体处于或远离接收个体的持续时间</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>相对运动</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>加权净运动—作用个体朝向（正值）或远离（负值）接收个体的运动，按两者间距离进行加权</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>远离的加权运动—作用个体远离接收个体的运动，按两者间距离进行加权</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>接近的加权运动—作用个体朝向接收个体的运动，按两者间距离进行加权</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试验控制状态—试验控制元素中两个事件之间，或单个元素内的时段</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试验控制事件—在您于试验控制中定义的元素内发生的某一事件发生的时刻</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过数字追踪软件量化的行为终点。 这些终点可用于个体或群体，并可作为暴露期间通过视觉观察评估行为障碍的检查清单。
<img alt="鱼类在水族箱中游动；观察其在水生环境中的行为与运动。" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="视频 1"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi">视频1：患病白鲟异常行为的可视化定义. （右键单击以下载）</a> 每日使用观察清单记录异常情况。在暴露期间，最常见的异常表现为失去平衡和无法移动。改编自 Calfee 等7
<img alt="培养皿中水生生物的行为；水生实验装置；运动分析。" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="视频 2"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">视频 2：白鲟游泳行为示例的可视化记录。（右键单击可下载）</a> 随着铜浓度升高，白鲟的游泳活动显著减少。本视频中展示的白鲟分别来自对照组、中低浓度组和高浓度组，均为96小时水溶性铜暴露实验结束时的个体。 尽管白鲟仍然存活，但与对照组相比，处理组中的鱼类明显表现出严重的行为障碍。改编自 Calfee et al.7

评估环境污染物对鱼类行为的影响通常具有主观性和挑战性，尤其是在涉及亚致死效应终点时。本文描述了利用视频技术等方法，在96小时急性暴露于不同浓度铜的过程中及之后，定量分析早期生命阶段白鲟（Acipenser transmontanus）游泳行为的实验方案。

水生生物对环境污染物的行为反应可能是其生存、生长或繁殖等其他效应的先兆。

本实验的总体目标是演示如何量化白鲟在亚致死浓度水溶性铜暴露下的行为反应。该方法有助于回答生态毒理学领域中的关键问题，例如污染物的亚致死暴露如何影响鱼类的游泳行为。该方法可为白鲟的保护工作提供重要信息。该方法也可轻松应用于其他鱼类、两栖类和无脊椎动物。此技术的主要优势在于其反应高度敏感，可提供毒性的早期指示，并且与生物体的存活密切相关。如果操作者不熟悉行为学测量，最初使用该方法时可能会有一定挑战性。本实验方案将由我的合著者 Holly Puglis 进行示范。首先，配制两升五水合硫酸铜（分析纯）水溶液。接着，平衡稀释系统和暴露用容器。将自动注射器分配器的进样管插入原液瓶中。然后，将自动泵的加样体积设置为1毫升，并打开稀释仪。该系统可制备五种浓度的50%梯度稀释系列及一个对照。通过四通分流器，将这些溶液输送至四个平行暴露室。接下来，启动冷水机的泵，使水浴温度维持在15摄氏度。然后，使用稀释系统上的自动定时器，将其设置为每30分钟循环一次。水箱中的水位通过立管排水装置维持。准备暴露室时，在其侧面开一个四厘米的孔，并用30微米的不锈钢网覆盖该孔。务必选择每10克鱼至少能容纳一升水的暴露室。例如，一条89日龄的白鲟体重约为373毫克，因此可在28厘米×13.5厘米×25厘米的方形实验舱中进行测试。在实验开始、中期和结束时，分别采集24毫升测试溶液样品用于化学分析。使用连接在塑料注射器上的吸管进行采样。将吸管更换为孔径0.45微米的聚醚砜滤膜，通过滤膜分配4毫升测试水样，弃去该部分水样。随后，将剩余的20毫升水样过滤至一个经酸清洗过的聚乙烯瓶中。用16摩尔的硝酸将样品酸化至体积百分比1%。这些样品可保存长达三个月。一旦确认测试暴露条件，每个重复测试容器中 stocking 三条鲟鱼，使鱼的密度约为每升容器体积172毫克。使用无刺激性网具收集鲟鱼，并将其转移至小桶中。总共需要144条鱼，以获取六种测试溶液的数据。在96小时暴露期间，不喂食鱼类。必须每天进行持续观察，以记录死亡率和异常行为。最佳观察时间为上午，且观察者 ideally 应对实验条件保持盲态。失去平衡定义为鱼类无法在水体中维持直立姿势。静止不动定义为鱼类无法自主移动或游动，除非受到刺激才会活动。同时记录其他任何异常现象，例如嗜睡、过度活跃、呼吸频率增加或减少、体色变化、震颤、痉挛、腹部膨胀、在水体中的位置异常，以及任何其他不寻常的游动模式。发现死亡的鱼类应立即移除。每天还需使用手持式测定仪测量两个水样中的溶解氧浓度。在96小时暴露结束时，录制游泳行为视频用于分析。将测试区域置于暴露容器内。务必选择一个足够大的测试区域，以便鱼类能够自由游动。在每个测试区域正上方，将手持摄像机安装在三脚架上。然后，从经处理的鱼类中随机选取最多三尾存活个体。使用小型网兜将三条鱼转移至测试区域。让鱼在该区域内适应约30分钟。在鱼适应环境的同时，调整图像焦点，尽量减少因水体流动造成的反光干扰，并增强鱼体与背景之间的对比度，调节视野以确保鱼体不被遮挡。待鱼适应环境后，开始记录并采集两分钟的视频数据。视频拍摄完成后，对鱼实施安乐死并妥善处理。将视频文件转换为数字分析软件所需的格式后，打开追踪软件，在主界面的“创建新实验”选项下选择“新建默认实验”。填写提示信息后，点击确定。然后，在设置中的实验设置选项下，选择视频源为视频文件，并将竞技场数量设置为1。将每个区域的受试对象数量设置为三个。接下来，在“追踪特征”下选择中心点检测，并选择所需的单位。然后，在“设置”中选择试验列表选项，并点击屏幕顶部的“添加视频”。在对话框中选择字母顺序。单击浏览，导航至视频所在的文件夹，选中相关文件，然后单击打开。选择视频文件后，继续在软件中定义实验范围。首先，单击屏幕顶部的“添加变量”，在标签框中输入“浓度”，在描述框中输入“铜浓度，单位为微克每升”。接下来，在类型下拉列表中选择“数值”。点击预定义值框，在对话框中选择“定义单个值”选项。输入实验所用的浓度，每添加一个数值后点击“添加”。然后，取消勾选“允许其他值”选项，点击确定。在范围框的下拉菜单中选择“试验”。在提供的输入框中，为每次试验输入相应的浓度。点击屏幕顶部的“添加变量”按钮。在标签框中输入“replicate”，在描述框中输入“replicate number”。在类型下拉列表中选择“数值”。然后，点击预定义值框，并在对话框中选择“定义单个值”选项。输入一、二、三和四，并取消勾选“允许其他值”选项。然后，单击“确定”。现在，在范围框的下拉菜单中选择试验选项。为每次试验输入相应的重复次数。下一步是设置实验区域空间。首先在“设置”选项卡下选择实验区域设置，并将第一个设置命名为“试验一”。在对话框中，选择“抓取背景图像”选项，然后点击“浏览”。找到第一次试验的视频文件并点击打开。视频显示后，点击“抓取背景图像”对话框中的抓取按钮。接着，点击屏幕顶部附近“arena settings”（区域设置）下方的白色圆形图标，并调整出现的圆形以圈定游泳区域。然后，点击 arena 设置下的校准标尺图标。使用单击-按住-拖动的操作来选择 arena 区域。现在，在校准距离的真实世界距离框中输入 10.5。然后，点击“确定”。如有必要，调整校准线，使其贯穿圆形实验区域的整个直径。在实验区域设置框中点击“验证实验区域设置”选项，并解决任何未通过验证的设置问题。现在，重复此过程，直到为每次试验定义所有区域。接下来，设置鱼类检测参数。首先，在屏幕左侧的实验探索工具栏中，从“设置”选项下选择检测设置。然后，在检测设置的“方法”下拉菜单中选择动态减影。同时，在对话框中的“受试者识别”下为每个受试者选择一种填充颜色。接下来，选择“选择视频”，并找到第一次试验的视频文件。在检测设置的一个对话框中，将视频下的采样率输入框填写为 5.9941。在同一输入框中，点击检测下参考图像选项的设置。然后，在参考图像对话框中，点击开始学习 C 选项。当参考图像对话框中的图像不再显示动物时，单击该对话框内采集设置下的“使用动态参考图像”，然后关闭此对话框。接着，在检测设置对话框的“检测中的对象”下拉菜单中选择“较暗”。对于检测下的暗对比度，将较小数值设置为33，较大数值设置为153。然后，单击右下角的“保存更改”。现在，确认该软件正在成功追踪动物，而非阴影或碎片。单击回放控制对话框中的播放按钮，并根据需要调整暗对比度数值。务必保存所做的任何调整。软件现已设置为从视频中采集数据，因此下一步任务是跟踪每次试验中的鱼类。首先，在屏幕左侧的实验资源管理器工具栏中，从设置选项下选择采集。接下来，单击采集设置对话框中的“跟踪下一个计划试验”按钮，并确认正确的试验、视频和实验区域设置均已显示在采集设置对话框的设置下方。然后，在采集控制对话框中勾选“检测确定速度”选项。单击带有白色方框内绿色圆圈的按钮，以开始采集过程。重复此过程，直到所有试验均已被追踪。现在，可以对被追踪的对象（即鱼类）进行分析。首先，点击屏幕左侧实验资源管理器工具栏中“分析”选项下的数据剖面。然后，在组件工具栏的嵌套选项中选择时间。在时间对话框的“选择轨道时间间隔”设置下，将“到”值调整为两分钟，然后单击确定。接着，将嵌套框从屏幕右侧数据配置文件区域的起始框与结果框之间拖动。在屏幕左侧的实验浏览器工具栏中，找到分析选项下的分析配置文件并点击。然后，在因变量工具栏的距离和时间标题下，点击速度。点击添加，并在因变量工具栏的距离和时间标题下，点击移动距离。然后，在“移动距离”对话框中点击“添加”，在因变量工具栏的“个体行为”标题下点击“运动”。在“运动”对话框中，查看“离群值滤波”标题下的设置，将平均时间间隔调整为1。接着，在“阈值”标题下，将启动速度调整为2.00，停止速度调整为1.75。在“计算统计”标题下，勾选“移动”和“不移动”的两个复选框。然后，单击“添加”，并在屏幕左侧实验资源管理器工具栏的“结果”选项下，单击“分析输出”。接着，单击“计算”。计算出因变量后，单击屏幕顶部的“导出”按钮。在“导出分析结果”对话框中选择目标文件夹，并从文件类型下拉菜单中选择 Excel，然后单击“确定”。最后，点击屏幕顶部文件选项卡下的保存实验。关闭数字追踪软件。将数据导入电子表格文件，并使用商业统计分析软件包进行分析。暴露于不同浓度的铜仅72小时后，孵化后两天的鲟鱼便表现出多种可观察到的异常。游泳行为受到明显影响。视频数据有助于界定这种行为障碍。在进一步的测试中，孵化后30天的鲟鱼对96小时的铜暴露表现出敏感性。随着铜浓度的增加，游泳速度、运动时间以及移动距离均显著减少。随着铜浓度的增加，游泳路径也有所减少。观看本视频后，您应能够充分理解如何在毒性测试中量化生物行为。该技术可为环境管理者提供一种利用行为定义的标准来记录环境损害并指导生态修复的方法。在实施该实验流程时，重要的是在记录行为观察结果时始终保持一致性。通过遵循此流程，还可以量化摄食和攻击性等其他行为，以进一步探究污染物暴露对生存能力的长期影响。

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