具体的基因组区域及相关分子鉴定enChIP隔离

该程序的总体目标是分离保留分子相互作用的特定基因组区域，以鉴定与基因组区域相互作用的分子。这种方法可以帮助回答基因组功能领域的问题，例如转录和表观遗传调控。该技术的主要优点是它能够直接识别与特定基因组区域相互作用的分子。

演示该程序的是我实验室的助理教授 Toshitsugu Fujita。按照文本方案，设计感兴趣的 DNA 结合分子。这需要生成目标 gBlock 序列并将其插入逆转录病毒中，例如，产生与三个 FLAG-dCas9 复合的向导 RNA。

或者，可以生成三个识别靶序列的 FLAG-TAL 蛋白。然后，按照文本方案用准备好的逆转录病毒感染细胞。确认工程化 DNA 结合分子的表达并建立细胞系。

现在，继续用甲醛交联细胞。将 2000 万个转染细胞悬浮在 30 mL 常规培养基中，并加入 810 μL 37% 甲醛，最终浓度为 1%在 37 摄氏度下孵育混合物 5 分钟。5 分钟后，加入 3.1 mL 1.25 摩尔甘氨酸以终止交联反应。

让细胞在室温下静置 10 分钟，然后再继续。接下来，在冷冻离心机中以 300 G 离心细胞管 5 分钟。小心弃去上清液，并通过混合和离心在 30 毫升 PBS 中洗涤细胞沉淀。

进行两次 PBS 洗涤。如果需要，固定细胞的洗涤沉淀可以储存在零下 80 摄氏度。继续，从细胞中收集染色质。

将它们悬浮在 10 毫升裂解缓冲液中，并在冰上孵育 10 分钟。然后，使用冷冻离心机收集细胞并小心丢弃上清液。现在，将细胞沉淀悬浮在细胞核裂解缓冲液中，并在冰上孵育 10 分钟。

在孵育过程中，每隔几分钟短暂涡旋混合物。再次，通过离心收集细胞。现在，用 10 毫升 PBS 洗涤沉淀，然后再次离心去除洗涤液。

这会产生染色质组分，如果需要，可以快速冷冻并在零下 80 摄氏度下储存。将染色质沉淀悬浮在 800 μL 改良裂解缓冲液 3 中，然后将悬浮液转移到较小的 1.5 mL试管中。现在，以 3 级功率连续工作为超声处理探针供电。

要对染色质进行碎裂，请在 10 秒的超声处理和 20 秒的冰上之间手动循环。在每 5 个或第 6 个循环中，将冰相延长至 2 分钟，以免样品过热。执行此超声处理循环 10 到 18 次，使探针尖端远离试管底部，以避免样品起泡。

超声处理后，通过快速冷冻离心收集样品。然后，将含有片段化染色质的上清液转移到新试管中并丢弃沉淀。请参阅文本协议，了解如何评估碎片。

为了准备免疫沉淀，首先将抗体与 Dynabeads 偶联。该免疫沉淀被放大到来自 2000 万个细胞的样品。向片段化的染色质中加入 1/5 体积的改良裂解缓冲液 3 和 Triton X-100，以获得 1% Triton 的最终浓度。

接下来，将混合物添加到与正常小鼠 IgG 偶联的磁珠中。在冷藏的旋转器上孵育反应物一小时。然后，在磁铁架上从溶液中吸取珠子 3 分钟。

然后，收集上清液。将上清液转移到与抗 FLAG 抗体偶联的磁珠管中。在 4 摄氏度的旋转器上运行该偶联反应过夜。

第二天早上，将磁铁贴在试管上 3 分钟以收集珠子。然后，吸出上清液并丢弃。现在，清洗珠子。

将它们悬浮在 1 毫升低盐缓冲液中，并在 4 摄氏度的旋转器上孵育 5 分钟。孵育后，分离磁珠磁化并弃去上清液。再次用低盐缓冲液重复此洗涤步骤。

使用相同的技术，使用高盐缓冲液再进行两次洗涤。继续使用该方法在氯化锂缓冲液中洗涤珠子两次。最后，用 TBS-IGEPAL CA-630 洗涤珠子一次。

完成 7 个洗涤步骤后，将微珠悬浮在 200 μL 洗脱缓冲液中，并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。然后，通过磁化吸引珠子并将上清液收集到新管中。重复此洗脱步骤以提高产量。

然后，纯化约 5% 的 DNA 以估计产量。首先将大部分洗脱液混合到沉淀反应中。在零下 20 摄氏度下沉淀染色质过夜。

第二天，离心样品并弃去上清液。用 70% 乙醇毫升冲洗沉淀，然后重复离心 10 分钟。然后，弃去上清液，将沉淀悬浮在 40 微升 2x 样品缓冲液中。

现在，将悬浮液涡旋整整五分钟。然后，在 100 摄氏度下孵育 30 分钟以变性并逆转交联。煮沸后，在 SDS-PAGE 凝胶上运行 40 μL 样品。

通常采用 4% 到 20% 的梯度。运行凝胶，直到染料在孔下方移动 1 厘米。然后，给凝胶染色，切成五块，长约 2 毫米。

稀释凝胶块中的蛋白质并将其用于质谱分析。文本方案中涵盖了 RNA 的纯化，然后进行测序分析。总体而言，使用 enChIP 可以纯化高达 10% 的目标基因组区域。

这里看到的是靶向 IRF-1 基因启动子区域的分析产量与非特异性 Sox2 基因座的比较。另一个例子是靶向端粒与非特异性 γ-satellite 基因座。enChIP SILAC 以干扰素 γ 特异性方式鉴定了几种与 IRF-1 启动子相关的蛋白。

还通过 enChIP 结合质谱法鉴定端粒结合蛋白。然后使用 enChIP RNA 测序鉴定与端粒相关的 RNA。经过开发，这项技术为转录和表观遗传调控领域的研究人员在各种生物系统中探索此类机制铺平了道路。