Name: 具体的基因组区域及相关分子鉴定enChIP隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 了解enChIP技术用于分离特定基因组区域并鉴定相关蛋白质和RNA的方法。该技术通过工程化DNA结合分子实现染色质免疫沉淀，为转录调控和表观遗传学研究提供可靠工具。

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本工作由武田科学振兴财团（T.F.）；旭硝子财团；上原纪念生命科学财团（H.F.）；仓敷纪念日立科技财团（T.F. 和 H.F.）；日本文部科学省科学研究费补助金青年研究（B）（#25830131）、科学研究费补助金（C）（#15K06895）（T.F.）；以及创新领域研究费补助金“转录周期”（#25118512 &amp;#38; #15H01354）、科学研究费补助金（B）（#15H04329）、探索研究费补助金（#26650059）和“基因组支持”（#221S0002）（H.F.）资助。

1. 靶向识别目标位点的工程化DNA结合分子的设计
<ol>
	<li>使用CRISPR复合物进行enChIP时，利用CRISPRdirect网络工具（http://crispr.dbcls.jp）在目标基因组区域中鉴定候选gRNA靶序列，方法如前所述18。该网络工具可在目标区域内返回形式为5'-N20NGG-3'的23 bp基因组位点。</li>
	<li>通过商业服务合成包含U6启动子序列以及5'-N20NGG-3'中5'-N20序列的gBlock（见图2）19,20。为便于亚克隆，在gBlock外侧加入适当的限制性内切酶位点。</li>
	<li>将gBlock插入适当的载体中，方法如前所述16。目前已有多种可用于gBlock的逆转录病毒载体（见材料）。</li>
	<li>使用TAL蛋白进行enChIP时，设计可识别目标位点的TAL蛋白。通过商业服务构建编码TAL蛋白的质粒。构建表达载体，使其包含与一个或多个标签（如3×FLAG）融合的TAL蛋白，方法如前所述15。</li>
</ol>
2. enChIP 分析用细胞的建立
<ol>
	<li>按照先前所述方法14-17，在待分析的细胞中表达3×FLAG-dCas9和gRNA（基于CRISPR的方法）或3×FLAG-TAL（基于TAL蛋白的方法）。
	<ol>
		<li>若转染效率较高，可采用瞬时转染。含有3×FLAG-dCas9和CMV启动子的表达载体可获取（见材料）。</li>
		<li>若瞬时转染效率较低，可考虑使用常规方法建立稳定转染细胞系。除前述用于gBlock的逆转录病毒载体外，3×FLAG-dCas9的逆转录病毒载体也可获取（见材料）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抗FLAG抗体（Ab）通过免疫印迹分析，确认转染细胞中3×FLAG-dCas9或3×FLAG-TAL蛋白的表达，方法如前所述14-17。 
	注意：这些带标签蛋白的表达也可通过抗FLAG-FITC进行细胞内染色，随后进行FACS分析来确认。细胞内染色方案可从我们的主页下载（http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html）。</li>
	<li>通过标准RT-PCR技术确认gRNA的表达。</li>
	<li>为定量鉴定与目标基因组区域相互作用的蛋白质，可考虑结合使用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）分析与enChIP（enChIP-SILAC）。 
	注意：SILAC分析所用培养基可从商业供应商购买。SILAC在检测特异性相互作用方面具有强大优势。
	<ol>
		<li>将细胞培养于SILAC重介质中。以SILAC轻介质培养的细胞作为阴性对照。每种SILAC介质（重或轻）至少使用5 × 107个细胞。为实现高效标记，需在SILAC重介质中同时添加L-Lysine-2HCl, 13C6和L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4。注意：至少需要五次细胞分裂才能完成蛋白质标记。
		<ol>
			<li>例如，将稳定表达3×FLAG-dCas9和gRNA的人类纤维肉瘤HT1080细胞在37 °C、5% CO2条件下，使用含透析胎牛血清的DMEM SILAC培养基进行培养，分别添加L-Lysine-2HCl加L-Arginine-HCl（轻介质）或13C6 L-Lysine-2HCl加13C615N4 L-Arginine-HCl（重介质）（见材料）16。在500 ml培养基中加入50 mg轻或重的L-Lysine-2HCl和L-Arginine-HCl。</li>
			<li>在细胞达到汇合前进行胰酶消化并重新接种，以维持细胞处于指数生长期。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用甲醛交联细胞
<ol>
	<li>对于悬浮培养的细胞，取表达 3xFLAG-TAL 蛋白或 3xFLAG-dCas9 加 gRNA 的 2 × 107 个细胞，转移至 50 ml 离心管中，并用 30 ml 常规培养基重悬。若使用更多细胞，需按比例增加试剂体积和用量。对于 SILAC 实验，将重介质和轻介质中培养的细胞（各 5 × 107 个）混合，将总共 1 × 108 个细胞均分为 5 份，每管含 2 × 107 个细胞。</li>
	<li>向 30 ml 细胞悬液中加入 810 µl 37% 甲醛（终浓度为 1%），在 37 °C 下孵育 5 分钟。对于贴壁细胞，直接在培养皿中加入 810 µl 37% 甲醛至 30 ml 培养基中进行固定。</li>
	<li>加入 3.1 ml 1.25 M 甘氨酸溶液（终浓度为 127 mM）终止交联反应，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>通过离心收集细胞（4 °C，300 × g，5 分钟）。小心弃去上清液（含甲醛），并将其储存于适当的废液瓶中。
	<ol>
		<li>对于贴壁细胞，使用细胞刮刀将细胞刮下，收集至 50 ml 离心管中，并按本步骤所述方法收集细胞。</li>
		<li>对于 SILAC 实验，将重介质和轻介质中培养的细胞（各 5 × 107 个）刮下后混合，将总共 1 × 108 个细胞均分为 5 份，每管含 2 × 107 个细胞，并按本步骤所述方法收集细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每管用 30 ml PBS 洗涤细胞沉淀两次。小心弃去上清液（含甲醛），并将其储存于适当的废液瓶中。甲醛废液应按照化学品安全指南进行处理。固定后的细胞可冷冻并储存在 -80 °C。</li>
</ol>
4. 染色质的制备（每 2 × 107 个细胞）
<ol>
	<li>将固定后的细胞悬浮于 10 ml 细胞裂解缓冲液（10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTA、0.5% IGEPAL CA-630 和 1× 蛋白酶抑制剂）中，冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>将样品离心（830 × g，4 °C，8 分钟），小心弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物悬浮于 10 ml 核裂解缓冲液（10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、1% Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.5% 月桂酰肌氨酸和 1× 蛋白酶抑制剂）中。冰上孵育 10 分钟，每 2–3 分钟涡旋混匀一次。</li>
	<li>将样品离心（830 × g，4 °C，8 分钟），小心弃去上清液。</li>
	<li>用 10 ml PBS 洗涤沉淀物。沉淀物（染色质组分）可在液氮中迅速冷冻后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
5. 染色质超声处理（每 2 × 107 个细胞）
<ol>
	<li>将染色质组分重悬于800 µl改良裂解缓冲液3（10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTA、150 mM NaCl、0.1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和1×蛋白酶抑制剂）中，并转移至1.5 ml离心管。</li>
	<li>使用超声破碎仪（见材料部分）并按照以下条件进行染色质超声处理：输出功率：3；占空比：100%（连续）；时间：自由控制。进行10–18个循环的超声处理，每个循环超声10秒，冰上冷却20秒。为避免过度加热，每完成5–6个循环后将样品在冰上孵育2分钟。为避免产生泡沫，保持超声探针尖端位于管底上方0.5 cm处。</li>
	<li>将样品在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，随后将上清液转移至1.5 ml离心管中。超声处理后的染色质经液氮速冻后可保存于-80 °C。</li>
</ol>
6. 染色质片段化评估
<ol>
	<li>将10 µl片段化染色质与85 µl蒸馏水混合。</li>
	<li>加入4 µl 5 M NaCl，于65 °C孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>加入1 µl 10 mg/ml RNase A，于37 °C孵育45分钟。</li>
	<li>加入2 µl 0.5 M EDTA（pH 8.0）、4 µl 1 M Tris（pH 6.8）和1 µl 20 mg/ml蛋白酶K，然后于45 °C孵育1.5小时。</li>
	<li>取10 µl样品，在不含SYBR Green等染色染料的1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离。</li>
	<li>染色后观察凝胶，评估片段化染色质的长度分布。建议采用产生平均长度为0.5–2 kbp（范围0.2–4 kbp）的条件。</li>
	<li>使用酚-氯仿抽提法或DNA提取试剂盒（见材料）从剩余样品中纯化DNA。纯化所得DNA可作为输入DNA，用于估算enChIP分析的得率（见8.11）。</li>
</ol>
7. 抗体偶联Dynabeads的制备（每2 × 107个细胞）
<ol>
	<li>准备两个 1.5 ml 离心管，一个用于使用正常小鼠 IgG 进行预清除，另一个用于与抗 FLAG 抗体（Ab）孵育。向每管中加入 150 µl 蛋白 G 偶联磁珠（见材料部分）。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，静置 3 分钟。用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用含 0.01% Tween-20 的 1 ml PBS（PBS-T）重悬磁珠。将离心管置于磁力架上，静置 2 分钟。用移液器弃去上清液，然后重复该步骤一次。</li>
	<li>用含 0.1% BSA 的 1 ml PBS-T 重悬磁珠。</li>
	<li>向管中加入 15 µg 正常小鼠 IgG 或抗 FLAG 抗体，并在 4 °C 下旋转孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>短暂离心后，将离心管置于磁力架上，静置 3 分钟。用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用 1 ml PBS-T 重悬磁珠。反复倒置样品数次，短暂离心。将离心管置于磁力架上，静置 3 分钟，然后用移液器弃去上清液。再用 PBS-T 洗涤两次，共完成三次洗涤步骤。</li>
</ol>
8. 染色质免疫沉淀（每 2 × 107 个细胞）
<ol>
	<li>将5.3)步骤中制备的片段化染色质（约800 µl）与含5% Triton X-100的改良裂解缓冲液3（约200 µl，即体积的五分之一）混合，使Triton X-100的终浓度为1%。</li>
	<li>将染色质溶液加入已预先制备了与正常小鼠IgG偶联的蛋白G磁珠的离心管中，4 °C旋转孵育1小时。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，静置3分钟。</li>
	<li>将上清液转移至另一已预先制备了与抗FLAG抗体偶联的蛋白G磁珠的离心管中，4 °C旋转过夜（O/N）。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，静置3分钟，用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml低盐缓冲液（20 mM Tris (pH 8.0)、2 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.1% SDS和1×蛋白酶抑制剂）重悬磁珠，4 °C旋转5分钟；将离心管置于磁力架上，静置3分钟，用移液器弃去上清液，并重复洗涤一次。</li>
	<li>用高盐缓冲液（20 mM Tris (pH 8.0)、2 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X-100、0.1% SDS和1×蛋白酶抑制剂）洗涤磁珠两次。</li>
	<li>用LiCl缓冲液（10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTA、250 mM LiCl、0.5% IGEPAL CA-630、0.5%脱氧胆酸钠和1×蛋白酶抑制剂）洗涤磁珠两次。</li>
	<li>用TBS-IGEPAL CA-630缓冲液（50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.1% IGEPAL CA-630和1×蛋白酶抑制剂）洗涤磁珠一次。</li>
	<li>将磁珠重悬于200 µl洗脱缓冲液（50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.1% IGEPAL CA-630、1×蛋白酶抑制剂和500 µg/ml 3×FLAG肽）中，37 °C孵育20分钟；将离心管置于磁力架上，静置3分钟，将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，并重复洗脱步骤一次。</li>
	<li>取少量洗脱液（例如&#160;5%）通过酚-氯仿抽提法或DNA提取试剂盒（见材料部分）纯化DNA。纯化后的DNA可用于特异性引物组的PCR分析，通过与步骤6.7中制备的input DNA进行比较，评估enChIP分析的得率14,16。</li>
</ol>
9. SDS-PAGE、染色及质谱分析
<ol>
	<li>将洗脱液（400 µl）与 1 ml 2-丙醇、50 µl 3M 醋酸钠（pH 5.2）和 5 µl 20 mg/ml 糖原混合。在 -20 °C 下过夜沉淀染色质。</li>
	<li>离心样品（16,000 × g，4 °C，30 分钟），弃去上清液。用 1 ml 70% 乙醇冲洗沉淀，再次离心（16,000 × g，4 °C，10 分钟）。用移液器彻底弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 40 µl 2x 上样缓冲液（125 mM Tris（pH 6.8）、10% 2-巯基乙醇、4% SDS、10% 蔗糖和 0.004% 溴酚蓝）中。涡旋振荡 5 分钟以完全溶解沉淀，然后在 100 °C 下孵育 30 分钟以变性蛋白质并逆转交联。</li>
	<li>进行 SDS-PAGE 时，将 40 µl 样品上样至凝胶，电泳至染料迁移至加样孔下方约 1 cm 处。注意：我们通常使用 4–20% 的梯度凝胶，但也可使用其他浓度的凝胶。</li>
	<li>用考马斯亮蓝或银染法对凝胶进行染色。</li>
	<li>将凝胶切成五段（每段高 2 mm）。</li>
	<li>按照先前所述方法进行凝胶内酶解及质谱分析13-16。</li>
	<li>对于每个样品含 5 × 107 个细胞（总计 1 × 108 个细胞）的 SILAC 实验，将初始五个管中的沉淀重悬于 40 µl 2x 上样缓冲液中（无需按比例放大）。</li>
</ol>
10. RNA 的纯化及 RNA 测序分析
<ol>
	<li>在enChIP后纯化RNA时，除改良裂解缓冲液3和洗脱缓冲液外，在所有缓冲液中加入5 U/ml RNase抑制剂（见材料部分）；在改良裂解缓冲液3和洗脱缓冲液中则加入40 U/ml RNase抑制剂。</li>
	<li>将洗脱液（400 µl）与16 µl 5 M NaCl混合，于65 °C孵育2小时。</li>
	<li>向样品中加入1 ml基于酸性硫氰酸胍-苯酚的试剂（见材料部分），涡旋振荡15秒，室温孵育5–15分钟。将样品&#160;在12,000 × g、室温下离心15分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，加入5 µl对溴苯甲醚（p-bromoanisole），涡旋振荡15秒，室温孵育3–5分钟。将样品在12,000 × g、室温下离心10分钟。</li>
	<li>将上清液（约1 ml）转移至新的2 ml离心管中，加入1 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育10分钟。将混合液加载至RNA纯化试剂盒中的纯化柱（见材料部分），在12,000 × g、室温下离心1分钟。</li>
	<li>用RNA纯化试剂盒中的400 µl RNA洗涤缓冲液洗涤纯化柱。</li>
	<li>向纯化柱中加入80 µl DNase I反应混合液（包含5 µl DNase I（1 U/µl）、8 µl 10× DNase I反应缓冲液、3 µl无DNase/RNase水和64 µl RNA纯化试剂盒中的RNA洗涤缓冲液）（见材料部分）。37 °C孵育15分钟，然后在12,000 × g、室温下离心&#160;30秒。</li>
	<li>用RNA纯化试剂盒中的RNA预洗缓冲液（PreWash Buffer）以400 µl每次洗涤纯化柱，重复两次。</li>
	<li>用50 µl无DNase/RNase水洗脱RNA。所得RNA可用于RNA测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者已就enChIP技术申请专利（专利名称：“利用识别内源性DNA序列的DNA结合分子分离特定基因组区域的方法”；专利号：PCT/JP2013/74107）。H.F. 是Addgene咨询委员会成员。

本文描述了利用工程化DNA结合分子（如CRISPR系统和TAL蛋白）对特定基因组区域进行纯化，并鉴定与这些基因组区域结合的蛋白质和RNA的方法。工程化DNA结合分子与基因组的结合可能影响染色质结构，包括核小体定位，并可能破坏基因组功能，正如CRISPR干扰实验中所报道的那样21。为避免这些潜在的异常效应，我们提出了选择目标基因组区域的具体建议。首先，为避免可能抑制RNA聚合酶和转录因子的招募，以及干扰转录起始位点周围的核小体定位，对启动子区域进行分析时，应选择位于转录起始位点上游（5'方向）数百个碱基对的位置作为目标区域。相比之下，在分析具有明确边界的基因组区域（如增强子和沉默子）时，可以选择紧邻这些区域的基因组区域作为靶点，因为工程化DNA结合分子的结合影响其功能的可能性较小。此外，应尽量避免选择在不同物种间保守的基因组区域作为靶点，因为重要的DNA结合分子通常结合于进化上保守的区域，抑制其结合可能破坏目标基因组区域的功能。因此，必须始终验证在用于enChIP分析的已建立细胞中，目标基因组区域的功能是否得以维持。由于可轻松测试多个gRNA，而生成识别不同目标基因组区域的多种TAL蛋白或锌指蛋白则繁琐且成本较高，因此使用CRISPR的enChIP相比使用其他蛋白的enChIP更具优势。
已有研究表明，dCas9 会结合到脱靶位点，尽管其对这些位点的亲和力可能弱于目标位点22-25。为减少结合到脱靶位点的分子所造成的污染，有多种应对策略。首先，建议使用多个不同的向导RNA（gRNA），至少两个。在利用不同gRNA进行enChIP实验时，若某些分子在所有条件下均被检测到，则更可能是真实阳性结果。其次，通过比较enChIP的不同实验条件，有助于排除非特异性结合分子以及脱靶位点结合分子的干扰。此类比较组的示例包括：(i) 刺激处理阴性（-）与阳性（+）组，或 (ii) 不同细胞类型，例如T细胞与B细胞。最后，应对候选分子的结合情况进行定量分析，以确认其在目标位点上的特异性结合。建议制备仅表达dCas9但不表达gRNA的细胞作为阴性对照。
通过enChIP分析，我们成功鉴定出多个已知及新发现的与特定基因组区域相互作用的分子（表1-3）14-17。然而，该技术未能检测到某些已知与这些区域相互作用的其他蛋白质。例如，已有报道表明，在IFNγ刺激下，STAT1会与IRF-1启动子结合8，但在我们的enChIP-SILAC分析中，并未检测到STAT1被诱导与该基因组区域发生相互作用16。此外，在端粒的enChIP-MS分析中，我们未检测到由TRF-1和TRF-2组成的shelterin蛋白复合物15，而这些蛋白已被证实可与端粒相互作用26。上述差异可能由以下几个原因造成。首先，Stat1与IRF-1启动子的结合化学计量比可能极低。enChIP-MS（包括enChIP-SILAC）更倾向于检测在目标基因组区域上富集程度较高的蛋白质；因此，可能需要分析更多细胞才能检测到这类低丰度结合的蛋白质。质谱仪灵敏度的提升也将有助于高效检测化学计量比较低的结合蛋白。其次，某些蛋白质（可能包括Stat1和shelterin蛋白）本身可能是质谱分析的困难靶标。第三，在我们对端粒结合蛋白的分析中15，识别端粒的3×FLAG-TAL蛋白（3×FN-Tel-TAL）可能以竞争性方式阻碍了shelterin蛋白与端粒的结合。
与使用enChIP技术检测转录因子结合特定基因组区域的相对困难相比，我们已成功通过enChIP分析鉴定出组蛋白修饰酶等表观遗传调控因子。该技术的成功可能归因于表观遗传调控因子能够结合较广泛的基因组区域，因此每个基因组区域可提供更多的蛋白质用于质谱分析。由于表观遗传调控因子 increasingly 被认为是癌症等难治性疾病药物研发的重要靶点，enChIP技术将成为鉴定表观遗传药物靶点的有力工具。

理解基因组功能（如转录和表观遗传调控）的调控机制，需要鉴定与特定基因组区域相关的分子。尽管已有多种技术被开发用于特定基因组区域的生化分析1-7，但由于其固有缺陷，如应用范围有限（例如， 仅适用于高拷贝数位点或含有重复序列的位点，且耗时耗力过多。
为了便于对特定基因组区域进行生化分析，我们开发了两种位点特异性的染色质免疫沉淀（ChIP）技术，即插入式ChIP（iChIP）8-13和工程化DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）14-17。在iChIP中，通过插入外源性DNA结合蛋白（如LexA）的识别序列来标记目标位点，然后利用该标记的DNA结合蛋白进行亲和纯化以分离该位点。在enChIP中，则使用工程化的DNA结合分子（如锌指蛋白、转录激活因子样（TAL）蛋白以及规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）复合物）来标记目标位点（图1）。随后，通过亲和纯化这些标记的DNA结合分子来分离相应的基因组区域。
与iChIP相比，enChIP的一个优势在于无需插入外源DNA结合蛋白的识别序列。利用由催化失活形式的Cas9（dCas9）和向导RNA（gRNA）组成的CRISPR复合物对基因座进行靶向，比使用TAL或锌指蛋白通过iChIP或enChIP靶向这些区域要容易得多。本文中，我们描述了一种enChIP联合质谱和RNA测序（RNA-Seq）的逐步实验方案，用于分别鉴定与特定基因座相关的蛋白质和RNA。

<table><tbody><tr><td>gBlock 合成服务</td><td>Life Technologies</td><td>基因合成（GeneArt）</td><td></td></tr><tr><td>gBlock 合成服务</td><td>IDT（Integrated DNA Technologies）</td><td>gBlocks 基因片段</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-neo</td><td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-GFP</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td><td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td></tr><tr><td>TAL合成服务</td><td>Life Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;times;FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;times;FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;times;FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;times;FLAG-dCas9/pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG M2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗FLAG M2抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>用于SILAC的DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>其他培养基可从 Life Technologies 购买</td></tr><tr><td>用于SILAC的透析胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>用于SILAC的L-赖氨酸-2HCl</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>对于轻度培养基</td></tr><tr><td>用于SILAC的L-精氨酸盐酸盐</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>对于轻度培养基</td></tr><tr><td>L-赖氨酸-2HCl，13C6，用于SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>对于重介质</td></tr><tr><td>L-精氨酸-盐酸盐，13C6，15N4，用于SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>对于重介质</td></tr><tr><td>完整型，迷你型，无EDTA</td><td>罗氏诊断</td><td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪 UD-201</td><td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA 纯化 &amp;和浓缩器</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-蛋白G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RN酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>用于质谱分析的纳米液相色谱-串联质谱系统组件</td></tr><tr><td>纳米液相色谱</td><td>Advance，Michrom Bioresources</td><td></td><td>用于质谱分析的纳米液相色谱-串联质谱系统组件</td></tr><tr><td>HTC-PAL 自动进样器</td><td>CTC Analytics</td><td></td><td>用于质谱分析的纳米液相色谱-串联质谱系统组件</td></tr></tbody></table>

通过enchip技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。为了实现对与特定基因组目标区域相互作用的分子进行无偏倚的鉴定，我们近期开发了工程化DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术。本文描述了如何利用enChIP技术分离特定基因组区域并鉴定与其相关的蛋白质和RNA。首先，利用转录激活因子样（TAL）蛋白，或由无催化活性的Cas9蛋白与向导RNA组成的规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）复合物，对目标基因组区域进行标记。随后，通过超声处理对染色质进行交联和片段化。接着，通过免疫沉淀富集被标记的基因座，并逆转交联。最后，对与分离的染色质相关的蛋白质或RNA分别进行质谱分析或RNA测序分析。该方法可成功鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA。

总体而言，使用染色质免疫富集法（enChIP）可纯化1-30%的目标基因组区域。图3展示了针对端粒及干扰素（IFN）调节因子-1（IRF-1）基因启动子进行enChIP分析的代表性数据。作为典型结果的示例，表1列出了通过enChIP-SILAC鉴定出的以IFNγ特异性方式与IRF-1启动子相关联的蛋白质，表2列出了通过enChIP结合质谱分析（enChIP-MS）鉴定出的端粒结合蛋白，表3列出了通过enChIP-RNA-Seq鉴定出的与端粒相关联的RNA。
<img alt="展示DNA-蛋白质结合及分析方法的CRISPR与TAL基因组相互作用示意图。" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. enChIP技术概述。图中展示了使用CRISPR（A, B）和TAL（C, D, E）的enChIP方法。通过工程化的DNA结合分子（如TAL蛋白，或由无催化活性的Cas9（dCas）与向导RNA（gRNA）组成的CRISPR系统）对目标基因座进行标记。如有需要，可使用甲醛或其他交联剂固定分子间的相互作用。随后，通过超声处理或酶消化将固定的染色质片段化。利用亲和纯化技术富集标记的基因组区域。最后，逆转交联，通过下一代测序和质谱分析鉴定出与目标区域相互作用的分子（包括基因组区域、RNA和蛋白质）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA序列、基因编辑；颜色编码的核苷酸；CRISPR实验的载体设计。" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. gBlock序列。 显示了U6启动子（黑色）、引导序列前的G核苷酸（蓝色）、引导序列（gRNA间隔序列）（红色）、支架序列（绿色）以及终止子序列（橙色）。
<img alt="ChIP 检测图，输入百分比比较，IRF-1、Sox2、端粒、γ-卫星序列，基因表达分析。" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 代表性 enChIP 分析的得率。（A）靶标位点 IRF-1 和非靶标位点 Sox2 的输入百分比。（B）靶标端粒和非靶标 γ-卫星序列的输入百分比。该图已根据先前发表的研究15,16进行改编和修改。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类别</td>
			<td>蛋白质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转录</td>
			<td>DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo 同源物, PURβ, 
			活化的 RNA 聚合酶 II 转录激活因子 p15, 
			BTF3, Myb 结合蛋白 1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组蛋白去乙酰化, 
			共抑制因子组分</td>
			<td>RBBP4, PA2G4, TBL3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酰转移酶</td>
			<td>蛋白质精氨酸 N-甲基转移酶 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 拓扑异构酶</td>
			<td>DNA 拓扑异构酶 2α</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组蛋白</td>
			<td>组蛋白 H2A.Z, 组蛋白 H3.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 通过enChIP-SILAC鉴定出的以IFNγ特异性方式与人类IRF-1启动子区相关联的蛋白质示例。 该表格改编自先前发表的研究16。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类别</td>
			<td>蛋白质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>哺乳动物端粒结合蛋白</td>
			<td>PML、RPA、CDK1、PARP1、PCBP1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酵母中的端粒结合蛋白 
			或其他生物</td>
			<td>IMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>与端粒结合蛋白相互作用的蛋白质 
			端粒结合蛋白相关蛋白</td>
			<td>DNA聚合酶α（POLA1）[Cdc13p]， 
			ARMC6 [TRF2]，CTBP1 [FoxP2-POT1] 
			exportin-5 [TERT]，GNL3L [TRF1] 
			exportin-1 [TERT]，14-3-3 [TERT]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>定位于异染色质的蛋白质</td>
			<td>BEND3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>调控表观遗传修饰的蛋白质</td>
			<td>KDM5C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>端粒功能受其突变影响的蛋白质</td>
			<td>DNA聚合酶α（POLA1）、HAT1、Nup133 
			CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY 
			谷氨酸-半胱氨酸连接酶，谷氧还蛋白，SMRC1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 通过enChIP-MS鉴定出的与小鼠端粒相关的蛋白质示例。 该表格改编自先前发表的研究15。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类别</td>
			<td>RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>端粒酶组分</td>
			<td>Terc, Rmrp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>端粒RNA</td>
			<td>TERRAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核仁小 Cajal 体特异性RNA（scaRNA）</td>
			<td>Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H/ACA盒snoRNA</td>
			<td>Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/D盒snoRNA</td>
			<td>Snord17, Snord15a, Snord118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>长链非编码RNA（lncRNA）</td>
			<td>Neat1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3： 通过enChIP-RNA-Seq鉴定出的与小鼠端粒相关的RNA示例。 该表格改编自先前的出版物17。

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

特定基因组功能区域相关分子的鉴定对于理解基因调控机制至关重要……

本实验的总体目标是分离保留分子相互作用的特定基因组区域，以鉴定与该基因组区域相互作用的分子。该方法有助于回答基因组功能领域的相关问题，例如转录和表观遗传调控。该技术的主要优势在于能够直接鉴定与特定基因组区域相互作用的分子。演示该实验操作的是我实验室的助理教授 Toshitsugu Fujita。根据文本方案，构建目标 DNA 结合分子。这包括生成目标 gBlock 序列，并将其插入逆转录病毒中，例如用于产生与三个 FLAG-dCas9 结合的向导 RNA 复合物。或者，可生成三种识别目标序列的 FLAG-TAL 蛋白。随后，按照文本方案用制备好的逆转录病毒感染细胞。验证工程化 DNA 结合分子的表达，并建立细胞系。接下来，使用甲醛对细胞进行交联。将2000万转染的细胞重悬于30毫升常规培养基中，并加入810微升37%甲醛，使终浓度为1%。在37摄氏度下孵育5分钟。5分钟后，加入3.1毫升1.25摩尔甘氨酸以终止交联反应。将细胞在室温下静置10分钟后再进行后续操作。接着，将细胞管在预冷的离心机中以300 G离心5分钟。小心弃去上清液，并用30毫升PBS重悬细胞沉淀，通过混匀和离心进行洗涤。用 PBS 洗涤两次。如有需要，固定后的细胞沉淀可在 -80 °C 条件下保存。接下来，从细胞中收集染色质。将它们重悬于 10 毫升裂解缓冲液中，在冰上孵育 10 分钟。然后，使用预冷的离心机收集细胞，并小心弃去上清液。接着，将细胞沉淀重悬于核裂解缓冲液中，在冰上孵育 10 分钟。孵育期间每隔几分钟短暂涡旋混合液一次。再次通过离心收集细胞。随后用10毫升PBS洗涤沉淀，并通过另一次离心去除洗涤液。这一步将产生染色质组分，如有需要，可迅速冷冻并在负80摄氏度保存。接下来，将染色质沉淀重悬于800微升改良裂解缓冲液三中，并将悬液转移至较小的1.5毫升离心管中。然后，开启超声破碎探头，设置功率为三级，持续工作模式。为了片段化染色质，手动循环进行10秒超声处理和20秒冰上冷却。每进行5到6个循环后，将冰上冷却时间延长至2分钟，以防止样品过热。重复此超声循环10至18次，在操作过程中保持探针尖端不接触管底，以避免样品起泡。超声处理后，使用快速冷藏离心收集样品。然后，将含有片段化染色质的上清液转移至新管中，并弃去沉淀。有关如何评估片段化效果，请参见文字版实验方案。为进行免疫沉淀，首先将抗体与Dynabeads偶联。该免疫沉淀实验适用于来自2000万细胞的样品。向片段化的染色质中加入1/5体积含Triton X-100的改良裂解缓冲液三，使Triton的终浓度为1%。接下来，将混合物加入与正常小鼠 IgG 偶联的磁珠中。在旋转仪上于冷藏条件下孵育反应体系1小时。随后，将磁力架置于反应管上，吸附磁珠3分钟。然后，收集上清液。将上清液转移至连接有抗FLAG抗体的磁珠管中。在4°C条件下，于旋转仪上孵育过夜进行偶联反应。第二天早晨，将磁铁贴于管壁上3分钟，以收集磁珠。随后，用移液器吸去上清液并弃去。现在，清洗磁珠。将它们悬浮于1 mL低盐缓冲液中，在4°C下于旋转仪上孵育5分钟。孵育结束后，通过磁力分离收集珠子，并弃去上清液。再用低盐缓冲液重复洗涤步骤一次。采用相同技术，使用高盐缓冲液再进行两次洗涤。随后继续用该方法，用氯化锂缓冲液洗涤磁珠两次。最后，用 TBS-IGEPAL CA-630 洗涤磁珠一次。经过七次洗涤步骤后，将磁珠重悬于 200 微升洗脱缓冲液中，在 37 摄氏度孵育 20 分钟。然后通过磁力吸附磁珠，将上清液收集至新离心管中。重复此洗脱步骤以提高得率。然后，纯化约5%的DNA以估算产量。首先将大部分洗脱液加入沉淀反应中，于-20°C下过夜沉淀染色质。第二天，将样品离心并弃去上清液。用1毫升70%乙醇冲洗沉淀，再以10分钟离心重复一次。然后弃去上清液，将沉淀重悬于40 µL的2x上样缓冲液中。现在，将悬浮液涡旋振荡整整五分钟。然后，在100摄氏度下孵育30分钟，以变性并逆转交联。煮沸后，取40微升样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。通常采用4%至20%的梯度凝胶。电泳至染料迁移至加样孔下方约1厘米处。然后对凝胶进行染色，并将其切成约2毫米长的五段。将蛋白质从凝胶条带中稀释并用于质谱分析。RNA的纯化及其后续的测序分析详见文本方案。总体而言，使用enChIP技术可纯化多达10%的目标基因组区域。此处显示的是针对 IRF-1 基因启动子区域的分析产量，与非特异性 Sox2 位点进行比较的结果。另一个例子是端粒靶向与非特异性 γ-卫星位点的比较。通过 enChIP SILAC 鉴定出若干与 IRF-1 启动子相关联的蛋白质，这些蛋白质具有干扰素 γ 特异性。通过结合质谱分析的enChIP技术，还鉴定出了端粒结合蛋白。随后利用enChIP RNA测序技术鉴定了与端粒相关联的RNA。该技术问世后，为转录和表观遗传调控领域的研究人员探索各种生物系统中的相关机制铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

在此，我们提出一种用于 体外...

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

iChip 技术利用了一种廉价且简单的方法 原位 一种可提高从土壤中发现新型微生物效率的分离装置。新型微生物可用于土壤微生物组研究、天然产物发现等多种应用。...

利用iChip技术分离土壤微生物

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于鉴定长链非编码 RNA...

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

了解enChIP技术用于分离特定基因组区域并鉴定相关蛋白质和RNA的方法。该技术通过工程化DNA结合分子实现染色质免疫沉淀，为转录调控和表观遗传学研究提供可靠工具。

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

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