利用共轭聚合物光学调控活细胞的电活动

该方法的总体目标是通过可见光脉冲刺激来调控细胞膜电位。光信号转导过程由一种光敏共轭聚合物介导。该方法为技术领域提供了一种新工具，因其代表了现有技术（如光遗传学和热刺激）在活细胞活动光学调控方面的有效替代方案。

该技术的主要优势在于能够快速整合到任何类型的电生理设备中，具有潜在的高空间和时间分辨率，并且降低了侵入性。此外，该方法无需像光遗传学那样进行基因转导。本文以体外细胞培养的光刺激为例，介绍本方法的具体操作。

但它也可能为体内应用开辟出有趣的机会。演示该实验步骤的是我们实验室的两位博士后，分别具有生物学和物理化学背景的Caterina Bossio和Susana Vaquero Morata。首先，通过将P3HT和PCBM以1:1的相对浓度溶于氯苯中，制备光敏共轭聚合物溶液。

将溶液在60摄氏度下用磁力搅拌器搅拌至少四小时。接下来，在超声波清洗机中依次用去离子水、丙酮和异丙醇对镀有氧化铟锡的玻璃载片进行每次10分钟的清洗。用氮气枪吹干盖玻片，然后用等离子清洗仪处理基底。

清洁后，将载玻片放置在旋涂仪的卡盘上，使氧化铟锡（ITO）涂层面向上。接着，向载玻片上滴加150微升P3HT:PCBM溶液，并对样品进行旋涂。旋涂完成后，取下样品，用浸有丙酮的洁净室棉签清洁基底背面。

将光敏基底放入带盖的耐热容器中，在120摄氏度下加热两小时以进行灭菌。然后将样品转移至无菌操作台并使其冷却。自此之后，须始终保持样品的无菌状态。

将光敏基底放入六孔板中。由于共轭聚合物层具有疏水性，需使用聚二甲基硅氧烷制作小室以固定样品，并如随附文本方案所述限制溶液扩散。然后将光敏基底置于板的各孔中，并用500至750微升的PBS溶液覆盖每个样品的整个表面，该溶液中含有浓度为每升2毫克的纤连蛋白。

将样品在37摄氏度下孵育至少一小时。孵育后，使用玻璃移液管去除纤连蛋白溶液，然后用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤基质一次。首先，每孔加入750至1,000微升的完全培养基，总体积不超过此范围。

接下来，将每平方厘米光敏基底15,000个AGK293细胞接种至每个孔中。然后将细胞培养24至48小时。只要沉积了适当的黏附层（如纤连蛋白），细胞即可在光敏基底上轻松培养。

首先，按照随附文本方案中的描述配制细胞外液和细胞内液。使用0.2微米滤器过滤溶液以实现灭菌。然后，将细胞外液置于37摄氏度水浴中预热。

此外，用一毫升注射器吸取细胞内液，并安装34号针头。将细胞内液与冰接触以避免ATP降解。接着，从培养箱中取出带有细胞的基底材料，并小心移除PDMS小室。

然后用玻璃移液管吸除培养基，并用细胞外液缓慢冲洗样品，以避免细胞脱落。每个孔中加入三毫升细胞外液，随后将培养板转移至电生理记录系统的样品架上。放置到位后，将参考电极置入待测孔中。

接下来，使用拉针仪制备一支新的玻璃微电极用于膜片钳实验。将微电极一半体积填充细胞内液。使用显微操作器将膜片电极移至所选细胞膜附近。

在定位过程中，需对移液管施加正压，以防止杂质黏附在尖端。当移液管位于细胞上方几微米处时，开始缓慢降低移液管，使其接近细胞膜，同时通过膜片钳控制软件监测移液管的电阻。当移液管电阻升高约1兆欧时，撤去正压，并施加轻柔的负压，以在移液管与细胞膜之间形成吉欧密封（gigaseal）。

接下来，向移液管施加 -40 毫伏的负电位，以帮助稳定封接。使用膜片钳放大器和/或膜片钳控制软件中的相应指令，补偿由移液管电容引起的电容瞬变。对移液管施加短暂而强烈的吸力脉冲，以破裂细胞膜，从而实现对细胞胞质的电学通路。

然后，将膜片钳放大器设置为电流钳模式，使无电流注入细胞。在电流钳模式下，记录细胞膜电位，并等待数分钟使其稳定。待膜电位稳定后，通过波长为450至600纳米的光照射细胞下方的光敏膜，对细胞施加所需的光照程序。

记录光照对膜电位的影响。持续约10至20毫秒的短脉冲光会引起细胞短暂的去极化，而持续数百毫秒的长时间光照则会引起持续的超极化，直至光照关闭。由光敏基底介导的细胞光刺激可对细胞膜产生不同的影响，具体取决于光刺激的持续时间。

一个快速的锋电位（如图中所示）之后会跟随一个持续数十毫秒的短暂去极化。当光刺激为短脉冲时，在光关闭后可观察到相反的行为。这些信号被认为是由光吸收后局部加热引起的膜电容变化所致。

对于长时间的光照，初始的去极化会转变为细胞超极化。这一现象同样具有热效应来源，但在此情况下，它与膜平衡电位的变化有关，原因是温度升高导致离子通道电导率发生改变。需要注意的是，该技术具有较强的灵活性，可根据特定实验的具体需求进行调整，例如通过更换光毒性聚合物、改变制备工艺或调整光照方案来实现。

然而，在修改实验方案之前，应首先验证活性聚合物的重要特性，例如其生物相容性、对灭菌过程的适用性、电化学稳定性以及时间稳定性。观看本视频后，您应能充分理解如何实现导电聚合物与活细胞之间的杂化界面，以及如何利用该界面实现对细胞活性的光学调控。我们相信，该技术有望成为神经科学领域体外研究的有力补充工具，并为体内应用开辟新的前景。

然而，要完善该方案，材料科学家、神经科学家、物理学家和医学工作者必须开展强有力且紧密协作的共同努力。