一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

本实验的总体目标是在新生小鼠中建立一种可重复的脊髓压迫损伤模型。首先对小鼠进行深度麻醉，随后实施背部椎板切除术以暴露脊髓。

最后通过制造压迫性损伤，我们近期建立了一种新生小鼠脊髓损伤模型，并已证明新生小鼠表现出惊人的适应性可塑能力。研究这种恢复背后的机制可能提供重要的见解，这些见解可用于脊髓损伤的治疗。

在本视频中，我们将演示如何对出生一天的小鼠进行脊髓压迫损伤操作。该手术过程包括麻醉、椎板切除术以及两次由夹子驱动的硬膜外压迫。手术准备工作如下。

手术在体视显微镜下进行。在显微镜下方放置一个加热垫。术中保持幼鼠体温至关重要，以避免手术期间发生猝死。

在加热垫上放置一块手术毯或一张干净柔软的大型实验室用纸。为了术前镇痛，准备一支胰岛素注射器（0.3 毫升，30 号针头），内装局部麻醉剂 Marcaine，用无菌 PBS 稀释至终浓度为 2.5 毫克/毫升。进行皮肤切口、肌肉去除和椎板切除时，使用微型刀具、精细镊子和精细虹膜剪刀。

请注意，此处我们还使用了在尖端弯曲形成齿状的镊子。这种镊子比市售的有齿镊子更适用，因为齿部必须非常小。对于脊髓压迫，应使用一种特殊改装的Yasargil临时动脉瘤微型夹，我们将在后文进行描述。

还需要一小段塑料毛细管，用于制作止动塞，以防止夹子完全闭合，同时需要一个夹子施加器来放置夹子。缝合时使用持针器和小型剪刀来剪断缝线。用于镇痛治疗时，将丁丙诺啡用无菌 PBS 稀释至 0.03 毫克/毫升。

脊髓损伤模型采用 Yasargil 临时动脉瘤微型夹进行夹闭式压迫。使用前需通过研磨石对夹子的刀片进行机械修整，将其厚度削至 150 微米。手术前，剪取一段短塑料管，套在夹子的一个刀片上。

导管起到塞子的作用，防止夹子完全闭合。麻醉与镇痛。对于气体麻醉，我们使用连接至氧气罐的异氟烷蒸发器。

异氟烷是在纯氧中汽化的麻醉剂。为了将异氟烷-氧气混合气体输送给小鼠，需要制作一个适用于新生小鼠的鼻罩。新生小鼠体型非常小，因此鼻罩可使用注射器的前端部分制成，该部分作为塑料导管的入口，连接至汽化器的出口。

在面罩侧面钻一个小孔，用于连接抽气管，抽气管末端可接至带有收集装置的调压真空泵，或直接接入通风橱。使用一个150 mm × 25 mL的塑料培养皿制作麻醉气体溢出室，在其一侧开一个足够容纳小鼠头部的孔。

在另一侧，制作两个直径与塑料管相匹配的小孔。最后，在培养皿顶部开一个比其他孔更小的排气孔。剪掉250微升移液器吸头的尖端，并将其插入最后一个孔中。

移液器吸头用作连接抽吸管的接口，抽吸管连接至设定为轻微负压的真空装置。使用橡皮泥将小鼠头部孔洞内侧的面罩固定。使用胶带或橡皮泥将塑料管固定在腔室顶部，确保管道准确地位于相应的孔洞中。

将腔室置于显微镜下的手术毯上。该示意图展示了整个系统。在蒸发器的出口处连接一个三通旋塞阀。

此处，通向睡眠室的路径畅通，而通向面罩的路径被阻断，可将小鼠放入睡眠室以开始麻醉。将三通旋塞向右旋转，可使气体流向面罩，同时阻断通往睡眠室的路径。在此配置下，可将小鼠转移至面罩。

通过溢流室的真空装置去除气体泄漏。选择一只近期喝过牛奶的幼鼠，其特征是皮肤下可见白色物质。将幼鼠放入麻醉室，并引入4%的气化异氟烷以实现快速镇静。

将幼鼠转移至面罩。小心地将小鼠的鼻部充分插入面罩内，以确保充分接触麻醉气体。转动三通旋塞，使气体流向面罩。

在预定手术部位皮下注射50微升浓度为2.5毫克/毫升的布比卡因。注意不要注射过深，以免刺破血管，布比卡因进入血管可导致致命后果。用小块无菌敷料擦去多余的布比卡因。

背侧椎板切除术。将异氟烷浓度降低至1%至2%。数分钟后，使用微型刀片刺穿皮肤，并沿头尾方向轻轻牵拉皮肤，形成一个8至9毫米的切口。

转移性切口更为方便，并为实施椎板切除术提供了更好的侧向入路。通过在切口头侧和尾侧的皮下插入海绵止血材料，将皮肤切口边缘与下方组织分离。使用精细剪刀剪开椎前肌肉，以暴露脊柱。

请注意，新生儿的棘突尚未完全发育。确定中线后，用细剪刀横向剪开椎板。注意不要剪得过深，以免可能损伤硬脊膜甚至脊髓。

将细镊子的一个镊尖小心地插入椎板与硬脑膜之间。闭合镊子夹住椎板，轻轻提起，直至椎板脱离，保留硬脑膜完整。重复此步骤两到三次，以完成一至两个节段的椎板切除术。

使用小块海绵抑素控制出血。用细镊子作为咬骨钳，双侧切除部分小关节突，以获得足够的空间将改良的动脉瘤微型夹置入椎管内。此步骤常引起出血，可使用小块海绵抑素进行控制。

为了提高可视性，有时用37摄氏度的温热无菌PBS冲洗会更有利。制造脊髓压迫损伤。打开夹子，将刀片放置于脊髓两侧，位于关节突关节与脊髓之间的间隙处。

确保刀片插入足够深，以涵盖脊髓的腹侧部分。在固定施加器位置的同时，迅速闭合夹子，以防止夹子向后滑动。15秒后，迅速松开夹子。

使用海绵定素清洁伤口。为实现对称性压迫，调转刀片方向，在相反方位进行第二次压迫，持续15秒。缝合。移除手术开始时置于皮下的海绵定素碎片，并用6.0缝线关闭皮肤。

皮下注射0.05毫升、浓度为0.03毫克/毫升的Temgesic，使用30号胰岛素注射器，并将幼崽置于30摄氏度的温控环境中数小时。为减少术后第一晚母鼠对已手术幼崽的攻击性母性行为，手术后配制地西泮溶液，用洁净的PBS稀释至0.1毫克/毫升，按每千克体重8毫克的剂量进行腹腔注射。结果。

如该图所示，在脊髓受压六小时后，胸椎较低节段的损伤小鼠后肢瘫痪，而前肢未受影响。对于仅接受椎板切除术的假手术对照组动物，其后肢和前肢均具有高度活动性。脊髓切片显示损伤部位存在残留血液。

此外，组织呈现半透明状，提示组织缺损，这通常会在数天后导致空洞的形成。结论：观看本视频后，您应能充分了解如何在新生小鼠中建立脊髓压迫性损伤模型。使用新生小鼠的优势在于，我们可以采用特定方法研究适应性可塑性，而这些方法无法应用于成年小鼠。

此外，该模型为测试治疗策略（例如干细胞移植）提供了平台。