Name: 小鼠模型的激光诱导脉络膜新生血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习使用激光诱导小鼠脉络膜新生血管模型，模拟新生血管性年龄相关性黄斑变性特征。该方法可重复且高效，适用于研究基因改变和药物治疗对疾病的影响。

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作者谨此感谢 Jonathan Chou 博士在最终稿件的准备和编辑过程中提供的帮助，以及 Wenzhong Liu 提供的 OCT 数据。我们还要感谢 Macula Society 研究基金（AAF）、美国纽约 Research to Prevent Blindness 公司向西北大学提供的无限制资助，以及 NIH-EY019951 项目的支持。

所有动物的处理均遵循《实验动物护理和使用指南》（2013年版）、视力与眼科研究中动物使用国际研究协会（ARVO）声明，并经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。
注意：以下步骤可由一名操作人员独立完成；但若由两名操作人员分工协作，则效率会显著提高。
1. 准备激光器和预激光处理工作站
<ol>
	<li>将激光器和裂隙灯放置在便于操作的位置。打开激光器并设置为预设参数（例如 75 µm 光斑大小、100 mW 功率、100 msec 持续时间）。 
	警告：确保操作人员佩戴所有必要的动物和激光安全个人防护装备，并在手术室外显眼位置张贴相应的激光安全警示标识。
	<ol>
		<li>在使用任何实验动物之前，应先使用一只用于校准的非实验小鼠确定最佳参数。激光参数取决于所使用的激光设备。理想参数定义为：当激光聚焦准确时，能够持续产生“气泡”现象的最低激光功率设置。参见视频示例，了解具有适当“气泡”形成的病灶表现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备激光前操作台，确保麻醉设备、动物保温装置、组织擦拭用品以及所有眼药水（托吡卡胺、丁卡因和人工泪液）均处于操作者易于取用的位置。
	<ol>
		<li>在对第一只小鼠注射麻醉剂之前，确保动物保温装置已预热至正确温度（37 °C），以避免麻醉诱导的低体温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠载物台置于保温装置上，使其在激光操作开始后能够保持温度并持续供热。</li>
</ol>
2. 小鼠麻醉与激光前准备
<ol>
	<li>在注射麻醉剂之前，需对眼球进行宏观检查，以确保其无任何可能导致角膜透明度下降的畸形或异常。例如 白内障</li>
	<li>称量小鼠体重。</li>
	<li>记录体重、性别和动物编号。</li>
	<li>根据机构提供的指南，通过体重计算所需麻醉剂的适当用量（例如 盐酸氯胺酮 100 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg，或三溴乙醇 250 mg/kg；对于20 g小鼠，注射0.20 ml&#160;赛拉嗪/氯胺酮混合液 或 0.25 ml 三溴乙醇）。准备一张按体重增量为1单位预先计算好的剂量表&#160;g，以减少数学错误。</li>
	<li>抓起小鼠背部皮肤并根据步骤2.4的计算结果进行腹腔注射麻醉剂。</li>
	<li>将小鼠置于动物加热垫上，等待其完全麻醉，通过捏脚趾检查足底反射（约3-5分钟）。</li>
	<li>将纸巾卷起并保护小鼠的鼻部区域，以防止液体流入导致吸入。将小鼠侧卧，向每只眼睛滴加一滴（约30 µl）盐酸四甲卡因，进行表面麻醉。等待2分钟，使溶液发挥作用。</li>
	<li>重复步骤2.7，使用一滴外用托吡卡胺进行瞳孔扩张。或者，可使用盐酸去氧肾上腺素（2.5%）进行扩张。</li>
	<li>等待2分钟使溶液发挥作用；在此期间将动物置于加热装置上。</li>
	<li>适当时间过后，迅速将小鼠放置于小鼠固定台上，并将固定台置于裂隙灯的下巴托上。</li>
	<li>打开裂隙灯至最低光照亮度，检查瞳孔散大程度。若瞳孔未充分散大（约2.5–3 mm），将小鼠放回动物加热垫上继续等待；或可另滴一滴托吡卡胺。待瞳孔充分散大后，进行激光操作。</li>
</ol>
3. 激光操作步骤
注意：当其他人员远离激光防护裂隙灯目镜时，应佩戴防护护目镜
<ol>
	<li>调整小鼠在小鼠固定装置上的位置，使其视神经处于理想的可视化位置（参见3.1.2）。
	<ol>
		<li>将小鼠固定于固定装置上，使其呈水平方向，与裂隙灯光束垂直，头部在一侧，尾部在另一侧。理想的小鼠放置位置有助于在盖玻片应用后更清晰地观察视神经。</li>
		<li>将小鼠轻轻转动，使其与原位置呈约170°角，头部靠近激光操作者。</li>
		<li>确保小鼠尽可能靠近裂隙灯，同时保持体位稳定，并为操作者的手留出足够空间以进行精细操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠处于理想位置后，在一块25 mm × 25 mm的玻璃盖玻片上滴加一滴人工泪液溶液。
	<ol>
		<li>在小鼠的对侧眼滴加一滴人工泪液，以确保眼球保持湿润，并有助于延缓白内障的形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用拇指和食指夹住盖玻片的一角，调整位置，使玻璃片被两指指尖夹紧。</li>
	<li>用其余三根手指轻轻环绕动物身体以提供支撑并稳定手部。调整手部位置，以便将玻璃盖玻片轻松放置于小鼠眼部。
	<ol>
		<li>确保手腕稳定在坚固的表面上，以减少手部震颤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一旦获得稳定位置，小心地将载玻片（仍附有泪液滴）压在小鼠眼睛上。
	<ol>
		<li>确保盖玻片尽可能与激光束垂直，以防止激光散射或反射。盖玻片起到接触镜的作用，用于压平角膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过裂隙灯观察，并用手调节焦距，直至可视视网膜。视网膜呈浅黄/红色，具体颜色取决于所观察的部位，可见清晰的红色血管。</li>
	<li>缓慢而仔细地调整小鼠头部和/或盖玻片，直至观察到视神经。视神经呈黄色，有多条血管从其周围辐射而出。</li>
	<li>操作者确认视神经可视化后，打开激光聚焦光束。</li>
	<li>激光束开启后，调节激光聚焦光束至目标位置（距视神经约1个视盘直径处）。</li>
	<li>将激光束聚焦于眼底的视网膜色素上皮（RPE）。通过观察激光束是否最清晰、最锐利来判断是否准确聚焦。若瞄准光呈椭圆形或失焦，可调节裂隙灯焦距或重新调整玻璃盖玻片位置。</li>
	<li>当瞄准光束聚焦于视网膜色素上皮（RPE）后，使用激光脚踏开关启动激光治疗。
	<ol>
		<li>务必避开视网膜血管，以防止眼内出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激光照射后立即观察是否有气泡出现。激光照射的轮廓应清晰，不得有任何模糊。
	<ol>
		<li>如果激光照射未产生气泡，或照射区域呈现模糊状态（表现为边界不清的浑浊外观，与成功照射后清晰、边界锐利的圆形区域相对），或在激光照射后出现出血现象，则不应将这些病灶纳入后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 3.10–3.12，针对所有目标 CNV 位点（通常位于视神经周围 3、6、9 和 12 点钟位置）。若激光诱导位置距视神经的距离大致相同，则通常无需重新调焦。然而，由于小鼠眼球曲率较大，且视网膜可能存在微小变异，因此在连续进行激光照射时，可能需要重新调整焦距。</li>
	<li>在实验记录本中记录每次激光照射的位置、给药情况及结果（成功、模糊、出血） 等等每次注射到眼部的剂量。不使用时，务必将激光设备置于待机模式。</li>
	<li>如有需要，对小鼠的另一只眼睛重复步骤3.1–3.14，使用相反的手进行固定，并更换新的盖玻片。</li>
	<li>完成所有预期的激光照射后，关闭激光仪和裂隙灯。</li>
	<li>弃去盖玻片，将小鼠置于加热垫上以促进麻醉后恢复。肉眼检查眼球是否有损伤，并滴加一滴人工泪液以保持眼球湿润，可能有助于预防白内障的发生。待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回笼中。</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>XYL/KET</td>
			<td>XYL/KET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠体重 (g)</td>
			<td>剂量 (mg/kg)</td>
			<td>溶液浓度 (mg/ml)</td>
			<td>麻醉剂剂量 (ml)</td>
			<td>剂量 (mg/kg)</td>
			<td>麻醉剂剂量 (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1875</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.2</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.2125</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.225</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.2375</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.25</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.2625</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.275</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.2875</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.3</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.3125</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.325</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.3375</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.35</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.3625</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>250</td>
			<td>20</td>
			<td>0.375</td>
			<td>100 mg/kg ketamine; 10 mg/kg xylazine</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：XyIKet 剂量表。

<ol><li>Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Age related macular degeneration.</a> Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).</li>
<li>Congdon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+Prevalence+of+Visual+Impairment+Among+Adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Age-Related Macular Degeneration.</a> NEJM. 358, 2606-2617 (2008).</li>
<li>Poor, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+the+Mouse+Model+of+Choroidal+Neovascularization+Induced+by+Laser+Photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation.</a> IOVS. 55, 6525-6534 (2014).</li>
<li>Ryan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+experimental+model+of+subretinal+neovascularization+in+disciform+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).</li>
<li>Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+laser+induced+choroidal+subretinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization.</a> IOVS. 31, 899-908 (1990).</li>
<li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molr+Aspects+Mede%22%5BJournal%5D)">Animal models of age related macular degeneration.</a> Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Choroidal+and+Retinal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization.</a> Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li>
<li>Zeiss, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REVIEW+PAPER%3A+Animals+as+Models+of+Age+Related+Macular+Degeneration+An+Imperfect+Measure+of+the+Truth%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol+Online%22%5BJournal%5D)">REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth.</a> Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).</li>
<li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Disruption+of+the+FGF2+Gene+Does+Not+Prevent+Choroidal+Neovascularization+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model.</a> Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).</li>
<li>He, L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Are+Essential+for+the+Early+Wound+Healing+Response+and+the+Formation+of+a+Fibrovascular+Scar%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar.</a> Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).</li>
<li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+characterization+of+laser+induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li>
<li>Jawad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Macrophage+Class+A+Scavenger+Receptors+in+a+Laser+Induced+Murine+Choroidal+Neovascularization+Model%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model.</a> IOVS. 54, 5959-5970 (2013).</li>
<li>Lambert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+induced+choroidal+neovascularization+model+to+study+age+related+macular+degeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice.</a> Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Depletion+Inhibits+Experimental+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization.</a> IOVS. 44, 3578-3585 (2003).</li>
<li>Espinosa Heidmann, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Depletion+Diminishes+Lesion+Size+and+Severity+in+Experimental+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization.</a> IOVS. 44, 3586-3592 (2003).</li>
<li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Evaluation+of+Laser+Induced+Choroidal+Neovascularization+Using+Spectral+Domain+Optical+Coherence+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography.</a> IOVS. 52, 3880-3887 (2011).</li>
<li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+Is+Major+Stimulator+in+Model+of+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization.</a> IOVS. 41, 3158-3164 (2000).</li>
<li>Reich, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+%28siRNA%29+targeting+VEGF+effectively+inhibits+ocular+neovascularization+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molr+Vis%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model.</a> Molr Vis. 9, 210-216 (2003).</li>
<li>Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroidal+Neovascularization+in+the+Rat+Induced+by+Adenovirus+Mediated+Expression+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor.</a> IOVS. 41, 3582-3589 (2000).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> JoVE. , 2563(2011).</li>
<li>Espinosa-Heidmann, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+as+an+Independent+Risk+Factor+for+Severity+of+Experimental+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization.</a> IOVS. 43, 1567-1573 (2002).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+and+Optimization+of+Standards+for+a+Preclinical+Animal+Test+Model+of+Laser+Induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS ONE. 9, e94743(2014).</li>
<li>Weinstock, M., Stewart, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+in+rodents+of+reversible+drug+induced+opacities+of+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22British+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens.</a> British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).</li>
<li>Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+Cataract+Development+in+Anesthetized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice.</a> Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在成功进行激光诱导后，有多种因素可能影响激光的递送以及脉络膜新生血管（CNV）病灶的形成。为了获得最可靠的结果，应对这些因素进行控制并实现标准化。其中最重要的因素包括小鼠的选择（基因型、年龄和性别）、麻醉剂的选择以及激光参数的设置。
所使用的特定小鼠模型可能对脉络膜新生血管（CNV）形成过程产生显著影响。目前最广泛使用的基因型是C57BL/6小鼠。实验动物的供应商来源也会影响最终CNV病灶的大小。Poor等人的研究显示，来自Jackson、Charles River和Taconic实验室的C57BL/6小鼠在最终CNV病灶大小上存在显著差异，其中来自Taconic的小鼠形成的CNV明显大于另两家供应商的小鼠4。因此，从同一家公司购买并统一使用同一供应商的小鼠，有助于最大限度地减少CNV病灶大小的外部差异。小鼠的年龄和性别在设计实验时也是需要考虑的重要因素。同龄雌性小鼠比雄性小鼠产生更多的CNV，而无论性别，年老小鼠均比年轻小鼠产生更多的CNV22,23。根据实验参数的不同，操作者应充分考虑这些因素。例如，若操作者采用激光诱导CNV模型用于...

年龄相关性黄斑变性（AMD）是50岁以上人群失明的主要原因之一1-3。AMD可分为两种类型：萎缩性（“干性”）AMD和新生血管性（“湿性”）AMD。前者表现为视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜毛细血管和光感受器的地理样萎缩，而后者则以异常血管从脉络膜侵入视网膜外层为特征，导致渗漏、出血和纤维化，最终引起失明1,2。在两种类型中，新生血管性AMD是造成大多数视力丧失的原因1。幸运的是，该类型目前有多种有效的药物治疗方案，而其萎缩性类型目前尚无经过验证的医学治疗方法3。此外，由于新生血管性AMD可在动物模型中较容易地重现，因此在基础AMD研究中更易于开展，有助于探索其潜在的病理机制，从而开发新的治疗方法4。
首个实验性脉络膜新生血管（CNV）动物模型由 Ryan et al. 在非人灵长类动物中建立5。该模型通过激光光凝诱导布鲁赫膜破裂，引发局部炎症反应，从而导致血管生成，类似于新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）中的表现。激光诱导后血管生成的组织病理学进展被发现与新生血管性 AMD 相似，证实了该模型的有效性6。非人灵长类动物的解剖结构与人类最为接近，但遗憾的是，其饲养成本高昂，难以进行基因操作，且疾病进展过程缓慢7。相比之下，啮齿类动物模型饲养成本显著更低，易于进行基因改造，且疾病进展速度更快（实验可在数周内完成，而非数月）。此类实验应仅在有色系啮齿类动物中进行，因为在白化动物中极难观察到相关变化。
小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型最初由Campochiaro团队在20世纪90年代末建立10，现已成为近年来多数研究中占主导地位的动物模型11-16。由于CNV的发病机制复杂且尚未完全明确，该激光模型已被广泛应用于湿性年龄相关性黄斑变性（wet AMD）研究的各个方面，从探究驱动血管生成的分子机制，到评估可用于未来人类治疗的新疗法。例如，Sakurai et al. 和 Espinosa-Heidmann et al. 利用该激光模型，通过转基因小鼠和药物耗竭处理，研究了巨噬细胞在CNV发展中的作用15, 16。Giani et al. 和 Hoerster et al. 则采用光学相干断层扫描（OCT）对激光诱导的CNV进行成像，以描述CNV的进展过程，并将组织病理学发现与OCT成像结果进行比较12,17。最后，涉及玻璃体内注射抗血管生成药物的研究已被用作开展人体临床试验的前提条件，在开发当今用于治疗新生血管性AMD的第一代抗VEGF药物过程中发挥了关键作用10,18,19。
用于实验性脉络膜新生血管（CNV）的替代模型采用手术方法诱导CNV。该方法通过注射促血管生成物质（例如 过表达VEGF的重组病毒载体、视网膜下注射视网膜色素上皮细胞和/或聚苯乙烯微球），模拟新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD）中观察到的VEGF表达升高，以诱导血管生成8,20。然而，该方法诱导新生血管形成的效率显著较低；这些研究显示，在C57/BL6小鼠中，仅31%的注射位点出现CNV，而相同品系小鼠采用激光光凝法的成功率约为70%8,14。鉴于上述原因，以及啮齿类动物相较于非人灵长类动物的诸多优势，激光诱导CNV的小鼠模型已成为大多数新生血管性AMD研究中CNV的标准动物模型8。
小鼠眼球是一种极其微小且 delicate 的组织。为了观察视网膜而对眼球进行操作十分困难，需要大量练习才能掌握。这一任务的复杂之处在于，操作者必须分别使用惯用手和非惯用手进行学习。此外，在掌握观察视网膜所需的精细动作之后，双手与操作激光的脚踏板之间的协调也至关重要。在本文中，我们力求将学习激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型中所有物理操作所面临的挑战提炼成一份指南，以帮助操作者快速成功掌握该模型。

<table><tbody><tr><td>532 nm（绿色）氩离子眼科激光器</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>任何532 nm（绿色）氩离子眼科激光器均可使用</td></tr><tr><td>裂隙灯</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>只要与激光器兼容，任何裂隙灯均可使用</td></tr><tr><td>三溴乙醇</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>用于制备麻醉剂</td></tr><tr><td>叔戊醇</td><td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>用于制备麻醉剂</td></tr><tr><td>棕色玻璃小瓶 + 隔垫</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td><td>三溴乙醇储存</td></tr><tr><td>擦拭纸巾</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>杂项&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>瞳孔散大</td></tr><tr><td>0.5% 盐酸四甲卡因</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;0065-0741-12</td><td>表面麻醉</td></tr><tr><td>人工泪液</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;58768-788-25</td><td>保湿</td></tr><tr><td>热疗泵（用于动物保温）</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>用于维持动物体温</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA</td><td>维持动物体温</td></tr><tr><td>30 G 胰岛素针头</td><td>BD</td><td>328418</td><td>腹腔注射麻醉</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>American Weigh Scale</td><td>AWS-1KG-BLK</td><td>小鼠称重</td></tr><tr><td>盖玻片（25 mm × 25 mm）</td><td>VWR</td><td>48366089</td><td>压平角膜以观察小鼠视网膜</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>由机构提供</td><td>由机构提供</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>由机构提供</td><td>由机构提供</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>用于三维体积重建</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr></tbody></table>

一种用于激光诱导脉络膜新生血管形成的动物模型

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型一直是新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）研究中的关键核心模型。通过向视网膜色素上皮（RPE）和布鲁赫膜施加靶向激光损伤，该操作可诱导血管生成，模拟新生血管性AMD中观察到的典型病理特征。
最初在非人灵长类动物中建立的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型，现已逐步应用于多种其他物种，其中最近的是小鼠。小鼠实验具有成本效益高、实验周期更短以及可利用多种转基因模型等优势。然而，由于小鼠眼球体积微小，在操作过程中带来了特殊挑战。观察视网膜时对眼球的操作需要熟练掌握精细的灵巧技能，并同时具备手-眼-脚协调能力以操控激光设备。但一旦掌握，该模型可用于研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的多个方面，包括分子机制、基因操作的影响以及药物治疗效果。
尽管激光诱导的CNV模型具有一定的应用价值，但它并非该疾病的理想模型。野生型小鼠的眼睛本身是健康的，其脉络膜-视网膜环境并不能模拟人类年龄相关性黄斑变性（AMD）中的病理改变。此外，由损伤诱导的血管生成并不反映与AMD这种年龄相关且呈慢性病程的疾病中所发生的血管生成相同的通路。
尽管存在一些局限性，激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型仍是目前研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）致残性病理机制的最佳方法之一。该模型的应用不仅加深了人们对AMD发病机制的理解，还推动了多种现有AMD疗法的开发。

可通过免疫荧光染色标记脉络膜新生血管（CNV）血管，对平铺的脉络膜组织进行分析，从而实现对CNV病灶的定量分析。组织制备最常用的两种方法分别为：在动物处死前立即通过灌注进行FITC-葡聚糖标记，或死后使用内皮细胞标志物进行免疫染色。这两种方法此前已有详细描述。13,14,21; 图1 和 2 分别展示各自的示例。共聚焦显微镜成像后，可使用 ImageJ 软件或 Volocity 对面积（二维）或体积（三维）进行计算和可视化。除了定量分析外，OCT 成像还可用于可视化 CNV 病变 体内. 显示脉络膜新生血管（CNV）的视网膜横断面图像示例如下所示 图3.
<img alt="细胞结构的荧光显微镜图像；用于结构分析的灰度映射，50 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/53502/53502fig1.jpg" data-altupdatedat...

本文介绍了小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）实验方案，该模型可重现新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的血管特征。掌握该技术后，可稳定有效地诱导CNV，作为测试多种实验干预措施的模型系统。

小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型一直是新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）研究中的关键核心模型……

本实验的总体目标是建立一种易于研究的动物模型，以重现新生血管性年龄相关性黄斑变性或 A MD 的典型特征。该方法可用于研究新生血管性 A MD 的多个方面，包括基因改变或药物治疗对疾病的影响，以及该疾病在不同成像模式下的表现。该技术的主要优势在于，一旦掌握，其实验结果易于重复，可实现快速、高效的实验操作。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为他们缺乏成功操作所需的精细灵巧性和协调性，而这两方面能力会随着练习逐渐提高。为准备激光工作站的位置，应将激光器和裂隙灯调整至便于操作的位置，打开激光器并将其设置为预设参数。此处使用的参数为：75微米的设定值、光斑尺寸、100毫瓦功率和100毫秒持续时间。接下来，将麻醉机、动物加热垫、组织擦拭巾和眼药水放置在激光操作者易于取用的位置。对第一只小鼠进行麻醉后，将其置于动物加热垫上约三到五分钟。通过脚趾夹捏测试以确认麻醉完全。然后使用卷好的纸巾擦拭，防止液体流入鼻腔被吸入。将30 µL盐酸四环卡因滴入每只眼睛。等待两分钟，使溶液发挥作用。接下来，向每只眼睛滴一滴局部用托吡卡胺，以扩大瞳孔，并等待两分钟使药液起效。现在迅速将小鼠放置于小鼠固定台上，然后将固定台置于裂隙灯的下巴托上。打开裂隙灯并将其调节至最低亮度。评估小鼠瞳孔的散大情况。如果瞳孔未达到2.5至3毫米的散大程度。将小鼠放回动物保温装置，或在瞳孔散大后追加一滴托吡卡胺。将小鼠置于载物台上，使其身体呈水平且垂直于裂隙光束的方向。轻微转动小鼠，使其角度不接近170度。将小鼠头部朝向激光操作者，尽可能靠近裂隙灯放置，同时保持平台稳定，并为操作者留出足够的空间以进行精细操作。小鼠位置调整妥当后，在一块25毫米×25毫米的玻璃盖玻片上滴加一滴人工泪液。同时，在小鼠未处理的眼部滴加一滴该溶液，以防止脱水。用拇指和食指捏住盖玻片的一角，其余三指环绕小鼠以支撑并稳定动物及操作者的手。然后小心地将盖玻片压在小鼠眼睛上，以压平角膜。将盖玻片垂直于激光束光路放置，以防止光束发生散射或反射。通过裂隙灯观察，用另一只手调节焦距，直至视网膜进入视野。视网膜呈淡黄色至红色，具有清晰可见的红色血管。缓慢而小心地移动小鼠头部或盖玻片，直至观察到视神经。视神经呈黄色，有多条血管从其向外辐射。然后打开激光聚焦光束，并调整其位置，使光束聚焦于眼底的视网膜色素上皮（RPE）。如果聚焦光束呈现椭圆形或失焦，应调整裂隙灯的焦距或盖玻片。当聚焦光束调整适当时，使用脚踏开关启动激光照射。激光照射后应立即形成气泡。边界模糊的病灶或存在出血性病灶的眼球应排除在分析之外。务必观察气泡的形成以及出现边界清晰、轮廓分明的圆形区域，以确认激光烧灼已准确聚焦。无法产生气泡的病灶可能无法有效诱导脉络膜新生血管（CNV）。在所有期望形成脉络膜新生血管（CNV）的位置创建额外病灶。不使用激光时，将其切换至待机模式，并在实验记录本中记录每次激光照射的位置和结果。使用新的盖玻片并用相反的手固定小鼠，对小鼠的另一只眼睛重复激光处理。完成全部操作后，关闭激光仪和裂隙灯，丢弃盖玻片，并将小鼠放回动物保温装置中。宏观上观察其体温逐渐回升。检查眼睛是否存在角膜表面或白内障损伤。恢复后，将小鼠放回笼中。脉络膜新生血管通过免疫荧光染色后对平铺脉络膜进行分析来量化。在动物处死后立即通过灌注进行荧光葡聚糖标记。随后在 ImageJ 中通过阈值法进行面积定量。此处还进行了死后免疫染色，使用内皮细胞标志物 ISO 选择素 GS IB four，随后通过共聚焦显微镜成像。生成了FOSS和侧面视图上CNV病灶的3D重建图像。还使用光学相干断层扫描成像技术在活体中可视化CNV病灶。此处显示的是视网膜的横截面图像，其中CNV病灶以黄色圆圈标出。病灶的正面无闪光拍摄图像也已展示，黄色圆圈标出。一旦掌握，若操作得当，该技术可在10分钟内完成。进行此操作时，务必确保动物已适当麻醉，并正确放置双手以提供充分支撑和稳定性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何聚焦激光以产生脉络膜新生血管（CNV）的激光损伤，该模型随后可通过多种方法进行研究。

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