一种用于激光诱导脉络膜新生血管形成的动物模型

本实验的总体目标是建立一种易于研究的动物模型，以重现新生血管性年龄相关性黄斑变性或 A MD 的典型特征。该方法可用于研究新生血管性 A MD 的多个方面，包括基因改变或药物治疗对疾病的影响，以及该疾病在不同成像模式下的表现。该技术的主要优势在于，一旦掌握，其操作易于重复，可实现快速、高效的实验。

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为他们缺乏成功操作所需的精细灵巧性和协调性，而这两方面能力会随着练习逐渐提高。为准备激光工作站的位置，应打开激光器和裂隙灯，并将其调节至便于操作的位置，然后开启激光器并设置为预设参数。此处使用的参数为：75 µm 间距、光斑尺寸、100 mW 功率和 100 ms 持续时间。

接下来，将麻醉机、动物加热垫、组织擦拭巾和眼药水放置在激光操作者易于取用的位置。对第一只小鼠进行麻醉后，将其置于动物加热垫上约三到五分钟。通过脚趾夹捏测试以确认麻醉完全。

然后使用卷好的纸巾擦拭，防止液体流入鼻腔被吸入。将30 µL盐酸四卡因滴入每只眼睛。等待两分钟，使溶液发挥作用。

接下来，向每只眼睛滴一滴局部用托吡卡胺溶液，以扩大瞳孔，并等待两分钟使药物发挥作用。现在迅速将小鼠放置于小鼠固定台上，然后将固定台置于裂隙灯的下巴托上。

打开裂隙灯并将其调节至最低亮度。评估小鼠瞳孔的散大情况。如果瞳孔未达到2.5至3毫米的散大程度。

将小鼠放回动物保温装置，或在瞳孔散大后追加一滴托吡卡胺。将小鼠置于载物台上，使其身体呈水平状态并与裂隙光束垂直。轻微转动小鼠，使其角度不接近170度。

将小鼠头部朝向激光操作者，尽可能靠近裂隙灯放置，同时保持平台稳定，并为操作者留出足够的空间以进行精细操作。小鼠位置调整妥当后，在一块25毫米×25毫米的玻璃盖玻片上滴加一滴人工泪液。同时，在小鼠未处理的眼部滴加一滴该溶液，以防止脱水。

用拇指和食指捏住盖玻片的一角，其余三指环绕小鼠以支撑并稳定动物及操作者的手。然后小心地将盖玻片压在小鼠眼睛上，以压平角膜。

将盖玻片垂直于激光束光路放置，以防止光束发生散射或反射。通过裂隙灯观察，用另一只手调节焦距，直至视网膜进入视野。视网膜应呈现淡黄色至红色，具有清晰可见的红色血管。缓慢而小心地移动小鼠头部或盖玻片，直至观察到视神经。

视神经呈黄色，有多条血管从其呈放射状分布。然后打开激光聚焦光束，并调整其位置，使光束聚焦于眼底的视网膜色素上皮（RPE）。如果聚焦光束呈现椭圆形或失焦，应调整裂隙灯的焦距或盖玻片。

当聚焦光束调整适当时，使用脚踏开关启动激光照射。激光照射后应立即形成气泡。边界模糊的病灶或存在出血性病灶的眼部应排除在分析之外。务必观察气泡的形成以及清晰锐利的圆形区域，以确认激光烧灼已准确聚焦。

无法产生气泡的病灶可能无法有效诱导脉络膜新生血管（CNV）。在所有需要诱导脉络膜新生血管（CNV）的位置创建额外病灶。不使用激光时，将其切换至待机模式，并在实验记录本中记录每次激光照射的位置和结果。

使用新的盖玻片并用相反的手固定小鼠，对小鼠的另一只眼睛重复激光处理。完成全部操作后，关闭激光仪和裂隙灯，丢弃盖玻片，并将小鼠放回动物饲养箱。宏观上观察其体温逐渐恢复。

检查眼睛是否存在角膜表面或白内障损伤。苏醒后，将小鼠放回笼中。脉络膜新生血管通过免疫荧光染色后对平铺的脉络膜进行分析来定量。

在动物处死后立即通过灌注进行FITC葡聚糖标记。随后在ImageJ中通过阈值法进行面积定量。此处采用内皮细胞标志物Isolectin GS IB4进行死后免疫染色，然后通过共聚焦显微镜成像。

生成了FOSS和侧面视图上CNV病灶的3D重建图像。还使用光学相干断层扫描成像技术在活体中可视化CNV病灶。此处显示的是视网膜的横截面图像，其中CNV病灶以黄色圈出。

病灶的正面无偏见视野图像也已展示，以黄色圆圈标出。一旦掌握，若操作得当，该技术可在10分钟内完成。在进行此操作时，重要的是确保动物已得到适当麻醉，并正确放置双手以提供充分支撑和稳定性。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何聚焦激光以产生脉络膜新生血管（CNV）的激光灼伤，随后可通过多种方法对 CNV 进行研究。