利用 SPRi、Nano-SPRi 和 ELISA 检测法对血清中人生长激素的比较分析

本研究的总体目标是评估直接和放大表面等离子体共振成像（SPRi）检测技术在血清生物标志物检测中的诊断潜力，并将其与市售的酶联免疫吸附测定试剂盒直接进行比较。该方法有助于回答生物医学领域中的关键问题，例如突出疾病早期阶段，以及提供监测治疗效果的手段。SPRi 的主要优势在于，它能够通过记录传感器表面附近折射率的变化，实现对生物分子相互作用的无标记、实时监测与可视化。

该技术的应用前景涉及血清中人生长激素（hGH）水平的诊断，因为内源性hGH已与多种影响人类生长发育的医学疾病相关联。该方法的可视化演示至关重要，因为生物芯片表面化学处理步骤较难掌握，任何操作失误都可能对结果产生极大影响。根据文本方案配制溶液和蛋白质样品后，使用120毫升稳定化的piranha溶液，在50°C下超声处理90分钟，以清洗金芯片。

用去离子水冲洗芯片，并在水中超声处理五分钟。然后用乙醇冲洗芯片，并用氮气流吹干。将金芯片置于紫外臭氧清洗仪中处理30分钟，以去除任何污染物。

接下来，将 150 毫克的 11-巯基十一烷酸加入含有塑料帽（用于固定芯片）和搅拌子（以使溶液均匀混合）的试管中，试管内预先装有 20 毫升乙醇。将芯片放入试管并盖上盖子，随后在 50 瓦、50 °C 条件下微波处理 5 分钟。

用乙醇冲洗芯片，并将其在乙醇中浸泡五分钟。用水重复冲洗，并浸泡五分钟。在含有搅拌子的试管中，将150毫克1-乙基-3-碳二亚胺加入20毫升水中。

将芯片转移至试管中，并按上述方法进行微波处理。用水冲洗芯片，并在水中浸泡五分钟。然后在含有搅拌子的试管中，将150毫克N-羟基琥珀酰亚胺加入20毫升水中。

将芯片加入试管中，用盖子密封后进行微波处理。按照之前的方法用水冲洗并浸泡芯片后，向含有搅拌子的试管中加入250微摩尔的聚乙二醇溶于20毫升水中。加入芯片并进行微波处理，然后按照之前的方法用水冲洗和浸泡。

配制每毫升含15微克的抗rhGH抗体溶液，并以抗IgG作为阴性对照，分别取10微升加入384孔板中的不同孔内。在微阵列点样仪中设计点样模式，使用500微米带聚四氟乙烯（Teflon）涂层的点样针将抗体点样到芯片上。将点样后的芯片在室温、75%湿度条件下孵育两小时。

在根据正文方案对SPRi实验进行设置并完成芯片封闭后，用含10%血清和1毫克/毫升BSA的PBS配制一系列浓度的重组人生长激素（rhGH）溶液。此步骤中所选用的封闭分子类型需特别强调，因为其目的是尽量减少非特异性相互作用。

在0.5毫升微量离心管中，将1微升6微摩尔的生物素标记抗rhGH检测抗体与3微升1微摩尔的链霉亲和素包被近红外量子点混合，配制成2:1的溶液。将150微升添加了hGH的人血清溶液注入进样环中。信号将迅速增强，随后由于非特异性结合的血清成分从表面被洗脱，信号缓慢下降。

信号稳定后，将450毫摩尔的氯化钠溶液加入运行缓冲液中，用于清洗表面。用运行缓冲液将抗rhGH检测抗体和量子点溶液稀释至10纳摩尔浓度，并注入流动池。将数据导入数据分析程序中。

然后绘制 SPRi 信号随时间变化的曲线，并在高盐洗涤后确定抗 rhGH 抗体点与阴性对照抗体点之间的差异。进行 ELISA 时，在按照文本方案准备好试剂、抗体包被的孔板和标准品后，将 rhGH 激素样品配制为含 10% 人血清的以下浓度。每孔加入 50 µL 的各标准品、对照品和样品，每个样本设三个复孔。

然后密封各孔，并在4°C下轻轻振荡孵育过夜。次日，从振荡器中取出板，使其恢复至室温。将抗rhGH HRP、结合缓冲液、洗涤缓冲液、显色剂四甲基联苯胺（TMB）和终止液恢复至室温。

配制工作试剂时，使用偶联缓冲液将抗rhGH HRP稀释40倍。用蒸馏水将洗涤缓冲液稀释200倍。向每个孔中加入50 µL抗rhGH HRP偶联物。

封闭各孔，在室温下轻轻振荡孵育30分钟。倾去孔内溶液，将板倒置并轻拍于吸水纸上使其干燥。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，随后再次倾去溶液，并轻拍干燥。

重复洗涤三次。轻敲96孔板以去除辅助试剂非常重要，因为仅依赖移液器无法有效去除。接下来，在洗涤步骤后的15分钟内，向每个孔中加入100 µL显色剂。

在室温下避光孵育30分钟，同时轻轻振荡。无色溶液将变为蓝色。向每孔中加入100 µL终止试剂。

溶液颜色将由蓝色变为黄色。立即使用酶标仪在450纳米波长下测定每个孔的吸光度。最后，根据提供的标准品绘制标准曲线，然后绘制10%血清样品中重组人生长激素（rhGH）的光密度值相对于各样品浓度的曲线。

在本视频中，比较了SPRi和纳米SPRi与ELISA在检测重组人生长激素（rhGH）时的性能。该图显示了在10%人血清中添加rhGH后的滴定曲线，并以450纳米处测得的吸光度（OD）作图。观察到良好的线性响应，检测限确定为每毫升1纳克。

在此，采用 SPRi 对 rhGH 的检测进行了评估。浓度梯度曲线上的每个点代表由每个浓度的三条 SPRi 动力学曲线计算得到的反射率差值的平均值。检测限（LoD）确定为 3.61 纳克每毫升。

为了提高 SPRi 生物传感器的灵敏度，实验中依次向传感器引入了纳米增强剂。在此实验中，纳米增强剂使生物传感器的响应信号最高增强了 7.9%，而对照组的信号变化极小。通过检测 0.25 至 30,000 皮克每毫升（picograms per milliliter）范围内的重组人生长激素（rhGH），评估了该纳米增强 SPRi 生物传感器的实用性。

检测限（LoD）计算为每毫升 9.2 皮克，变异系数为 20%。若操作得当，掌握该技术后，直接检测可在 1 小时内完成，纳米 SPRi 检测可在 2 小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住对每一步骤的条件进行优化；一旦完成优化，结果可在更短时间内被轻松重复。在完成该实验后，可直接在芯片上进行其他方法，如多通道检测、maspeck 分析等，以提供关于捕获分子的额外信息。

该技术开发完成后，将为医学诊断领域的研究人员探索与癌症、神经及心血管疾病相关的多种生物标志物的同步检测提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立 SPRi、纳米 SPRi 以及 ELISA 检测方法，用于检测人血清中 hGH 的水平。请注意，操作试剂可能具有极高危险性，在执行本实验操作时，务必采取佩戴手套和护目镜等防护措施。