Name: 人生长激素测定血清SPRI，纳米单层屋面和酶联免疫吸附测定比较分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T11:00:01.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 了解表面等离子体共振成像（SPRi）与纳米增强SPRi技术在血清中检测人生长激素（hGH）的方法，并与酶联免疫吸附测定（ELISA）进行准确性比较。该技术为临床诊断中的生物标志物实时监测提供了无标记检测方案。

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感谢纳米制造创新联盟提供的资金支持。

1. SPRi 溶液与蛋白质样品的制备
<ol>
	<li>配制 100 ml 低盐磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，含 10 mM 磷酸盐、150 mM 氯化钠，pH 7.4。</li>
	<li>配制 50 ml 高盐 PBS 溶液，含 10 mM 磷酸盐、750 mM 氯化钠，pH 7.4。</li>
	<li>配制 5 ml 10 mM 乙酸钠溶液。</li>
	<li>在低盐 PBS 溶液中稀释牛血清白蛋白（BSA），制备浓度为 5 mg/ml 的储存液。</li>
	<li>在低盐 PBS 溶液中配制浓度为 1 μg/ml 的重组人生长激素（rhGH）储存液。</li>
	<li>配制抗-rhGH 抗体和阴性对照抗体的储存液，浓度均为 100 μg/ml。</li>
</ol>
2. 准备 SPRi 芯片用于抗体阵列
<ol>
	<li>将芯片在 120 ml 稳定的piranha溶液（浓硫酸与30%过氧化氢按3:1配制）中于50 °C超声处理90分钟，随后用水冲洗并超声5分钟。然后用乙醇冲洗芯片，并用氮气流吹干。</li>
	<li>将金芯片置于紫外/臭氧清洗仪中30分钟，以去除任何污染物。</li>
	<li>在含有搅拌子和管盖的试管中，将150 mg 11-巯基十一烷酸加入20 ml乙醇中。</li>
	<li>将芯片放入试管中，以50 W功率和50 °C微波处理5分钟。</li>
	<li>用乙醇冲洗芯片，并在乙醇中浸泡5分钟。</li>
	<li>接着用水冲洗芯片，并在水中浸泡5分钟。</li>
	<li>在含有搅拌子和管盖的试管中，将150 mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺加入20 ml水中。按步骤2.4的条件对芯片进行微波处理。</li>
	<li>用水冲洗芯片，并在水中浸泡5分钟。</li>
	<li>在含有搅拌子和管盖的试管中，将150 mg N-羟基琥珀酰亚胺加入20 ml水中。按步骤2.4的条件对芯片进行微波处理。</li>
	<li>用水冲洗芯片，并在水中浸泡5分钟。</li>
	<li>在含有搅拌子和管盖的试管中，配制250 µM聚乙二醇（PEG，800 Da）水溶液20 ml。按步骤2.4的条件对芯片进行微波处理。 
	注意：在传感器表面微波处理PEG800是作为封闭步骤，用于防止后续实验中血清蛋白和量子点复合物的非特异性结合。该效果通过PEG800与芯片表面未占据的裸露金位点发生反应而实现。</li>
	<li>用水冲洗芯片，并在水中浸泡5分钟。</li>
	<li>配制15 μg/ml的抗人生长激素抗体溶液和抗免疫球蛋白G（anti-IgG）阴性对照溶液，并将每种抗体溶液各10 µl加入384孔板的孔中。</li>
	<li>在微阵列点样仪上设计点样模式（每个样本4 × 7个象限），使用500 μm聚四氟乙烯（Teflon）尖端点样针在芯片上点样抗体。</li>
	<li>将点样后的芯片在室温、湿度75%或更高的环境中孵育2小时。</li>
	<li>冲洗芯片并在水中浸泡5分钟，然后用氮气流吹干芯片。</li>
</ol>
3. SPRi 实验设置与封闭
<ol>
	<li>启动仪器并选择目录。选择实时相机，以1 ml/min的流速注入10 ml脱气水，启动注射泵。将芯片插入仪器，并持续注水直至所有气泡被清除。</li>
	<li>用10 ml水冲洗芯片后，开始图像采集，随后将缓冲液切换为低盐PBS，以1 ml/min流速运行5 ml，然后将流速降低至20 µl/min，持续20分钟。</li>
	<li>选择对比度较高的图像，该图像显示已固定在芯片上的抗体斑点。</li>
	<li>选择并定义对应于固定化抗体的400 µm单个圆形斑点。</li>
	<li>在仪器绘制出等离子体共振曲线后，选择反射率曲线中斜率最大的工作角度。</li>
	<li>以20 µl/min的流速持续流过低盐PBS运行缓冲液，直至所有选定斑点的信号稳定。</li>
	<li>将BSA（100 µg/ml）溶于运行缓冲液中，注入样品环（150 µl），此时进样阀置于加载位置。然后将阀切换至注射位置，将溶液注入流动池。 
	注意：BSA注入后会与胺反应性表面发生共价结合，未结合的BSA将通过缓冲液冲洗从表面洗脱。</li>
	<li>向表面注入150 µl的10 mM醋酸钠溶液，随后注入150 µl高盐PBS。</li>
	<li>注入150 µl乙醇胺（1 mM）以钝化胺反应性表面。</li>
	<li>注入150 µl的10 mM醋酸钠溶液清洗表面。</li>
	<li>随后，将运行缓冲液更换为含50 µg/ml BSA的PBS，以250 µl/min的流速运行总共5 ml。 
	注意：在运行缓冲液中添加50 µg/ml BSA，用于通过非共价方式占据非特异性位点，进一步阻断表面，以减少血清蛋白在表面的非特异性结合。</li>
	<li>将流速调整为5 µl/min，并使其稳定20分钟。</li>
</ol>
4. 人源生长激素的 SPRi 检测
<ol>
	<li>在含1 mg/ml BSA的PBS中，用10%血清配制一系列已知浓度的rhGH溶液（30,000 pg/ml；250 pg/ml；25 pg/ml；2.5 pg/ml和0.25 pg/ml）。</li>
	<li>在0.5 ml微量离心管中，将1 µl生物素标记的抗rhGH检测抗体（6 µM）加入3 µl链霉亲和素包被的近红外量子点（1 µM）中，制成2:1的混合溶液，并孵育30分钟，以实现有效偶联。</li>
	<li>将150 µl添加了hGH的人血清溶液注入进样环。此操作会导致信号显著上升，随后因非特异性结合的血清成分从表面被冲洗下来而出现缓慢下降。</li>
	<li>待信号稳定后，用在流动缓冲液中添加450 mM氯化钠的溶液冲洗传感器表面。</li>
	<li>用流动缓冲液（含50 µg/ml BSA的PBS）将抗rhGH检测抗体与量子点的混合溶液稀释至10 nM（2:1），然后注入流路池中。</li>
</ol>
5. SPRi 数据分析
注意：在注射添加了重组人生长激素（rhGH）的人血清和量子点增强剂后，由于表面等离子体共振曲线的放大偏移，反射率变化增大。这将生成一幅差分图像，显示与芯片上信号相对应的灰度图像。
<ol>
	<li>将数据导入数据分析程序。绘制 SPRi 信号（反射率百分比）随时间（秒）的变化曲线，并在高盐洗涤后，确定抗 rhGH 抗体点与阴性对照抗体点之间的差异。</li>
</ol>
6. ELISA 实验方案（第1天）
<ol>
	<li>将rhGH ELISA试剂盒中的所有检测组分均储存于2-8 °C。这些组分包括包被有抗-rhGH抗体的微孔板、标准品（0-5，溶于绵羊血清中）和质控品（1 &amp;#38;2) 在人血清中，结合缓冲液，（200倍浓缩）洗涤缓冲液，显色底物TMB（四甲基联苯胺）和终止液。</li>
	<li>按照商用ELISA试剂盒说明书中的步骤准备试剂并进行操作。</li>
	<li>首先，在打开铝箔包装之前，让包被有抗rhGH抗体的96孔板恢复至室温。</li>
	<li>然后取出所需数量的8孔条用于检测，将剩余孔板所在的铝箔袋重新密封，并于2-8 °C保存。</li>
	<li>通过以下方式制备标准品：标准品#0用2 ml蒸馏水重悬，标准品（1-5）用1 ml蒸馏水重悬，对照品（1&amp;#38;2)。以下是标准品和对照品相应浓度的表格（表1):</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标准</td>
			<td>浓度 (ng/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>0.94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>2.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>26.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 #1</td>
			<td>1.22 ± 0.33 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 #2</td>
			<td>4.97 ± 1.25 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 商业ELISA试剂盒中包含的标准品和对照品的浓度。
<ol start="6">
	<li>制备样品，样品包含在10%人血清中的rhGH激素，浓度如下（表2）：</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td>浓度 (ng/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 在10%血清中配制的重组人生长激素样品浓度。
<ol start="7">
	<li>向每个孔中加入 50 μl 的标准品、对照品和样品（设三个复孔）。密封各孔，并在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜（O/N），同时孵育标准品、对照品和 rhGH 样品。</li>
</ol>
7. ELISA 实验方案（第 2 天）
<ol>
	<li>从摇床中取出板，静置使其升至室温（15–20 分钟），然后继续进行检测。</li>
	<li>从冰箱中取出抗rhGH-HRP、结合物缓冲液、洗涤缓冲液（200倍浓缩液）、显色底物TMB（四甲基联苯胺）和终止液，使其恢复至室温。</li>
	<li>试剂配制：（根据生产商说明书）
	<ol>
		<li>用结合物缓冲液将抗rhGH-HRP稀释40倍。用蒸馏水将洗涤缓冲液稀释200倍进行配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每孔中加入50 μl&#160;抗rhGH-HRP结合物，密封各孔，并在室温下轻轻振荡孵育30分钟。</li>
	<li>倾去孔内溶液，将板倒置并在吸水纸上轻拍至干燥。然后向每孔中加入200 μl洗涤缓冲液。</li>
	<li>倾去洗涤液，在吸水纸上轻拍干燥。重复此步骤3次。</li>
	<li>洗涤步骤完成后15分钟内，向每孔中加入100 μl显色底物。在室温下避光轻轻振荡孵育30分钟。溶液颜色由无色变为蓝色。</li>
	<li>向每孔中加入100 μl终止液。溶液颜色由蓝色变为黄色。立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。</li>
	<li>根据提供的标准品（0–5）绘制标准曲线。然后绘制10%血清样品中rhGH的光密度值相对于各样品浓度的关系曲线。</li>
</ol>

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</ol>

M.G. Sandros 是 Horiba Scientific 的顾问。她曾因参与口头报告而获得以下机构的酬金：Horiba Scientific 和 Syngenta。除上述披露外，作者与任何组织或实体均无其他相关隶属关系或经济利益往来，亦不存在与本文所述主题或材料相关的经济利益冲突。本手稿的撰写未使用任何第三方写作协助。

天然激素hGH水平异常与多种影响人体生长发育的医学疾病相关。此外，尽管使用重组人生长激素（rhGH）作为兴奋剂被禁止，但运动员仍普遍外源性使用rhGH以提高运动表现。由于难以区分外源性hGH与内源性hGH，导致检测rhGH滥用存在挑战。因此，目前批准的外源性hGH检测方法依赖于测定22 kDa hGH亚型与20 kDa亚型之间的比例。由于该亚型检测需要在较宽浓度范围内并在短时间内同时测量多种hGH亚型，因此我们认为SPRi平台非常适合这一应用。此外，内源性hGH在血液中的浓度波动可降至极低水平（0.03 ng/ml），因此检测系统必须具备高特异性，并能稳定检测该浓度范围。基于此，本研究还探讨了Nano-SPRi作为hGH诊断工具的潜力，并将其直接与SPRi及经典免疫测定法ELISA进行了比较。
根据本研究获得的结果，SPRi 和 Nano-SPRi 方法的主要优势在于，与传统的 ELISA 方法相比，rhGH 浓度的检测速度更快。使用直接检测方法测定一个样本中 rhGH 水平的标准时间为 1 小时，而 Nano-SPRi 由于流程中包含额外步骤，所需时间为 2 小时。总体而言，在进行 SPRi 和 Nano-SPRi 实验时，在注入样本前强烈建议进行校准步骤。此外，注入人血清等粗提样本会导致一些非特异性相互作用，因此必须注入高盐洗涤缓冲液，以仅显示特异性相互作用。还需注意的是，在将封闭分子引入传感器表面后，必须进行洗涤步骤，以去除未结合的分子。至于 ELISA，分析一个样本所需时间要长得多（约 16–18 小时）。由于需要提高检测灵敏度，尤其是本研究的重点在于比较检测下限，因此需要更长的孵育时间。
表面化学的选择因应用而异，这可能是表面等离子体共振成像（SPRi）技术的局限性之一。在本研究中，评估了多种化学连接分子与封闭分子的组合，以确定最佳组合，从而实现重组人生长激素（rhGH）与传感器表面之间的最优结合效率。例如，在本研究中，牛血清白蛋白（BSA）与聚乙二醇（PEG）的组合能有效最小化非特异性相互作用。然而，在先前的一项研究17中，当捕获配体为适配体时，单独使用PEG即为最佳封闭分子。分析物与配体结合效率受多种因素影响，包括pH值、缓冲液和温度。因此，在任何应用中，这些变量均需进行优化。此外，确定配体在芯片表面的最佳点样浓度至关重要。在启动研究前，需通过一系列不同浓度的固定化配体进行滴定实验。与酶联免疫吸附试验（ELISA）类似，实验中的关键步骤之一是通过轻拍微孔板将洗涤缓冲液倾倒除去，以确保无残留液体。使用移液器移除洗涤缓冲液并不充分，因为任何残留液体都会干扰目标样本的信号读数。
在灵敏度方面，ELISA（1 ng/ml）与 SPRi（3.61 ng/ml）相当，而纳米 SPRi（nano-SPRi，9.20 pg/ml）的灵敏度提高了三个数量级，从而能够检测到更低生物学浓度的重组人生长激素（rhGH），低至 0.03 ng/ml。正如我们先前所报道的16,17，NanoEnhancers 所带来的信号增强归因于质量负载效应，以及近红外荧光团与金膜纳米结构中传播的表面等离激元之间的强耦合作用。尽管纳米 SPRi 在操作流程中增加了一个步骤，但如此高的灵敏度有望拓展 SPRi 技术在多种应用场景中的使用。
SPRi 可为科学家提供抗体与重组人生长激素（rhGH）相互作用的完整动力学谱（KD、Ka 和 Kd），而 ELISA 仅能报告亲和力数值。SPRi 的变异系数（CV）为 4.1%，ELISA 为 6.5%，均低于 10%，表明两种方法均具有良好的可重复性。ELISA 与 SPRi 所得亲和力数值存在差异，原因是固定在传感器芯片上的捕获抗体与固定在 ELISA 96 孔板上的抗体不同。至于 Nano-SPRi，观察到较高的 CV 值（20%）。多个参数可能成为 CV 测定中误差的来源。例如，在 Nano-SPRi 实验中检测的分析物浓度显著更低，NanoEnhancers 的加入使实验步骤增加，且该实验为手动操作。在 spiked 人血清中检测 rhGH 时，Nano-SPRi 与 ELISA 之间获得了非常好的相关性。最后，ELISA 可以是一种可靠的技术，但其本身耗时较长，难以适用于需要实时监测和多重检测的场景，而人生长激素（hGH）的检测正是此类情况。此外，SPRi 相较于 ELISA 具有一项更具吸引力但本研究未直接考察的特性，即能够实时同时测量数百种分子相互作用。因此，未来将评估 Nano-SPRi 方法在实时多重检测血清中不同浓度多种生物标志物方面的潜力，以考察其作为可行临床诊断工具的应用前景。

人生长激素（hGH）是由垂体产生并直接释放到血液中的一种由191个氨基酸组成的肽（22 kDa）。下丘脑肽生长激素释放激素（GHRH）与生长素之间的相互作用可诱导hGH的脉冲式分泌。因此，hGH水平在50–100 ng/ml的高值与0.03 ng/ml的低值之间波动1。体内hGH的缺乏或过量可引发多种异常生理症状。例如，hGH水平过高可导致巨人症2和糖尿病3；hGH水平降低则会导致新生儿低血糖，以及成人骨密度降低和抑郁症状4。
给予重组人生长激素（rhGH）可增加瘦体重并减少体脂。因此，该物质成为职业和业余运动员的首选药物，因其可增强体力，从而在竞技体育中获得优势。世界反兴奋剂机构（WADA）已禁止使用rhGH5,6，国际上的研究人员已投入大量努力，致力于开发能够检测其存在或同化作用的检测方法。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）一直是检测全血中人生长激素（hGH）的首选方法7尽管ELISA是一种具有较高灵敏度和选择性的可靠技术，但其相对耗时且劳动密集。此外，ELISA依赖于酶标标签对人生长激素（hGH）进行间接检测。相比之下，表面等离子体共振（SPR）技术能够在实时条件下无需标记物直接检测hGH。SPR的检测原理基于一种传感表面，该表面由涂有薄金属层（金或银）的棱镜构成；当单色偏振光与金属表面相互作用时 &#34;表面等离激元&#34; 产生。当分析物与固定在金属表面的受体结合时，会扰动共振条件，导致共振峰位发生偏移，该偏移可与分析物浓度相关联。目前已有基于表面等离子体共振（SPR）的生物传感器实现商业化，可提供一种实时、免标记的技术，用于监测生物分子结合事件及生化反应。8-10近年来，为了满足多重检测的需求，发展出了 SPRi 技术（即，&#160;同时监测多个结合事件），这是传统 SPR 生物传感器无法实现的。因此，SPRi 已发展成为一种可同时监测多个结合事件的工具。目前的 SPRi 系统基于对表面进行显微成像，该表面以特定角度和波长的光激发10然后将图像捕获到电荷耦合器件（CCD）阵列上。
迄今为止，已开发出几种基于表面等离子体共振（SPR）的检测方法用于检测人生长激素（hGH）11-14。其中一种特定策略称为“亚型法”15，其原理是检测22 kDa hGH与总hGH的比值，因为在外源性重组人生长激素（rhGH）给药后，非22 kDa内源性hGH水平会下降。最近，de Juan-Franco et al.11 报道了一种基于SPR的免疫传感器，可选择性地检测人血清样本中的22 kDa和20 kDa hGH亚型。针对每种亚型的特异性单克隆抗体被直接固定在金传感器表面，可在单次进样中同时测定两种亚型，检测限达0.9 ng ml-1。此外，SPR也可用于筛选对hGH具有高特异性的抗体13。当目标分析物浓度低于SPR成像系统（SPRi）的检测限时（&#60;nM），需借助纳米颗粒（Nano-SPRi）来放大SPRi信号。此类基于SPR的信号放大技术已在文献中被广泛报道16-19，适用于多种类型的分析物和表面。
本研究评估了基于 SPRi 和 Nano-SPRi 的生物传感器的分析潜力，特别是用于检测添加了重组人生长激素（rhGH）的人血清样本，并将其检测能力与 ELISA 方法直接进行比较。将对以下参数进行回顾和评估：检测时间、灵敏度、动力学曲线、重复性和特异性。

<table><tbody><tr><td>生长激素（GH1）捕获抗体&amp;nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>DM1015</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents&amp;nbsp;</td><td>BP671-10</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的生长激素（GH1）检测抗体&amp;nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>AM09304BT-N</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺&amp;nbsp;</td><td>TCI America</td><td>D1601</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Acros Organics&amp;nbsp;</td><td>141-43-5</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Chemicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>人HGH ELISA试剂盒&amp;nbsp;</td><td>invitrogen&amp;nbsp;</td><td>KAQ1081</td><td></td></tr><tr><td>人血清&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H4522&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>兔IgG抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>I5006</td><td></td></tr><tr><td>11-巯基十一烷酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>450561</td><td></td></tr><tr><td>Nanostrip&amp;nbsp;</td><td>Cyantek&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>00-3002</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（800 Da）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>729108</td><td></td></tr><tr><td>重组人生长激素&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>869008</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的近红外量子点&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>Q10171MP</td><td></td></tr><tr><td>紫外/臭氧清洗仪</td><td>Bioforce Nanosciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波反应器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CEM Corporation</td><td></td><td>Discover系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SPRi-Arrayer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>LabNext Xactll 微阵列系统&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR生物芯片</td><td>HORIBA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi-Lab+</td><td>HORIBA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx 多功能微孔板读板仪&amp;nbsp;</td><td>BioTek&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScrubberGen</td><td>HORIBA</td><td></td><td>数据分析软件&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用 spri、nano-spri 和 elisa 检测法对血清中人生长激素的比较分析

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

在较宽浓度范围内（高水平为50-100 ng/ml）对人生长激素（hGH）进行高灵敏度和高选择性检测的方法−1 和最低水平 0.03 ng/ml−1循环血液中的激素水平至关重要，因为其浓度变化可能提示生理状态的改变。例如，通过检测血液中人生长激素（hGH）的水平，可诊断儿童期发生的生长发育障碍。此外，重组人生长激素（rhGH）在体育运动中的滥用不仅涉及伦理问题，还会对滥用者造成严重的健康威胁。目前一种常用的检测hGH滥用的策略，是测定22 kDa hGH与总hGH的比值，因为在外源性注射重组hGH后，非22 kDa的内源性hGH水平会下降。 表面等离子体共振成像（SPRi）是一种分析工具，可通过实时记录传感器表面附近折射率的变化，直接（无需标记）监测和可视化生物分子相互作用。相比之下，最常用的比色法——酶联免疫吸附测定（ELISA），则依赖于酶标记的检测抗体，在加入可引发颜色变化的底物后间接测定待测物浓度。为提高检测灵敏度，放大式SPRi采用夹心法检测模式，并结合近红外量子点（QDs）以增强信号强度。在对人血清中添加的重组人生长激素（rhGH）进行直接SPRi检测后，通过依次注入包被近红外量子点的检测抗体（Nano-SPRi）实现信号放大。本研究评估了直接SPRi与放大式SPRi在检测人血清中添加的rhGH时的诊断潜力，并直接与商用ELISA试剂盒的检测能力进行了比较。

在复杂环境中检测重组人生长激素（rhGH）时，将 SPRi 与 Nano-SPRi（使用 NanoEnhancers 的 SPRi）的性能与 ELISA 进行了比较。以下简要描述这些方法在设置上的差异。对于 SPRi（直接检测，图 1），首先将捕获抗体固定在传感器表面，然后注入样品，直接以实时、无标记的方式测量分析物与传感器表面的结合。然而，在 Nano-SPRi（图 1）中，分析物与传感器表面结合后，会连续注入包被有检测抗体的量子点，以放大 SPRi 信号。
<img alt="直接检测与放大检测示意图；抗体、NanoEnhancers、HGH、流式分析方法。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 在粗提样品中检测重组人生长激素（rhGH）的直接模式（SPRi）与放大模式（Nano-SPRi）示意图比较。将配体（rhGH 或特异性 IgG 抗体）以阵列形式固定在 SPRi 生物芯片表面。将添加了目标蛋白（rhGH）的人血清样品引入传感器表面，可直接检测（SPRi），随后用 NanoEnhancers 进行标记增强（Nano-SPRi）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
对于ELISA，多孔板已预先包被捕获抗体，直接加入样品后，目标分析物将发生结合。随后加入检测抗体，再添加底物，最后在450 nm处测定吸光度。本研究采用一种商业化的ELISA试剂盒（图2）来检测添加至10%人血清中的重组人生长激素（rhGH）。
<img alt="ELISA 流程图；蛋白质检测方法，光密度测量，抗体相互作用。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. ELISA 检测流程示意图。将重组人生长激素蛋白（rhGH，蓝色椭圆）加入已预先固定特异性抗rhGH单克隆抗体（黄色）的微孔中。通过洗涤缓冲液冲洗微孔以去除非特异性结合，随后加入预先偶联辣根过氧化物酶（HRP，紫色）的检测抗体。加入底物四甲基联苯胺（TMB，金色）后，溶液颜色发生变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3 表示在10%人血清中添加的重组人生长激素（rhGH）的滴定曲线，该曲线以450 nm处测得的光密度（OD）绘制。观察到良好的线性响应，检测限确定为1 ng/ml。变异系数（CV）为6.5%，表明重复性良好。
<img alt="线性回归图，光密度与rhGH浓度的关系，高度相关R²=0.9999。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. ELISA数据分析。 将血清中添加的rhGH浓度与在450 nm处测得的吸光度（OD）作图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
接下来，采用 SPRi 检测在人血清中添加的重组人生长激素（rhGH）。rhGH 的直接检测获得了相应的浓度梯度曲线（图 4），每个数据点代表由每种浓度的三条 SPRi 动力学曲线计算得到的反射率差值的平均值。检测限（LOD）确定为 3.61 ng/mL。SPRi 直接检测方法具有高度的可重复性，其批内变异系数（CV）仅为 4.1%。
<img alt="反射率与hGH浓度的关系；NaCl + 缓冲液对血清反射率数据的影响分析" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 在含10%人血清样本中直接检测添加的hGH。 注入不同浓度hGH添加至人血清后的归一化SPRi动力学曲线，随后注入高盐缓冲液（垂直虚线）以去除非特异性相互作用。浓度梯度曲线显示了添加至人血清中的不同量hGH与传感器表面结合的情况，该传感器表面已预先固定了生物素标记的hGH特异性抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为了提高 SPRi 生物传感器的灵敏度，将预先偶联检测抗体的纳米增强剂（NanoEnhancers，即量子点标记的检测抗体）依次引入传感器表面，以凸显人血清中添加的重组人生长激素（rhGH）的存在。在扣除背景信号后，NanoEnhancers 可使生物传感器信号增强高达 7.9%；然而，在对照区域，非特异性信号变化极小（针对免疫球蛋白 G（IgG）的抗体，反射率变化仅为 0.38%；图 5）。对传感器表面的成像结果显示，仅在固定有 rhGH 特异性抗体的兴趣区域出现最大的对比度变化，该变化与动力学传感图谱响应结果直接一致。
<img alt="反射率随时间变化的曲线图；在抗hGH/抗IgG检测研究中使用的NaCl、缓冲液和纳米增强剂。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 采用夹心法在10%人血清中检测重组人生长激素（rhGH）。 将rhGH（30 ng/ml）加入缓冲液（10 mM PBS，150 mM 氯化钠，pH = 7.4）后注入已预先功能化的芯片，该芯片表面修饰有11-巯基十一烷酸 / rhGH特异性抗体以及对照IgG抗体，经BSA封闭后，再加入量子点标记的检测抗体（NanoEnhancers）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为验证纳米 SPRi 生物传感器的实用性，评估了其在粗提样品中检测 rhGH 的测量范围。加入 NanoEnhancers 后，检测的动态工作范围扩展至 30,000 pg/ml 到 0.25 pg/ml（图6）。值得注意的是，滴定曲线上每个数据点均来自三次独立实验的平均值。据此计算，检测下限为 9.20 pg/ml，变异系数为 20%。
<img alt="NanoEnhancers、反射率图表、rhGH浓度分析、%Δ反射率随时间变化。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 人血清中添加hGH的Nano-SPRi检测。 对添加不同浓度hGH的人血清样本，其hGH特异性Anti-QDs放大信号的归一化SPRi动力学曲线图。一条垂直的虚线（灰色）表示运行缓冲液的注入时间点。(b) 浓度梯度曲线，表示将不同量的hGH添加至人血清后，注入到已预先修饰11-巯基十一烷酸/hGH特异性抗体的传感器表面时，NanoEnhancers（hGH特异性Anti-QDs）的结合情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接下来，比较了直接检测法与NanoEnhancer增强检测法在不同浓度下SPR反射率曲线的变化情况（图7）。在直接检测法中，当浓度介于25至0.25 pg/ml之间时，信号开始趋于平缓，这并不意外，因为这些浓度低于3 ng/ml的检测限（LOD）（图7）。类似地，在信号放大检测法中，当浓度低于9.2 pg/ml的检测限时，信号也趋于平缓，几乎不再发生变化。
<img alt="反射率与浓度关系图；直接检测与放大检测；误差线表示数据离散程度。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. SPRi与Nano-SPRi的比较分析。该柱状图显示了在人血清中加入不同浓度（30,000 pg/ml、250 pg/ml、25 pg/ml、2.5 pg/ml 和 0.25 pg/ml）的重组人生长激素（rhGH）后，反射率变化百分比（%R）的结果，先进行直接检测，随后注入NanoEnhancers进行信号放大检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
此外，还评估了纳米表面等离子体共振成像（Nano-SPRi）生物传感器的特异性。由于人生长激素（hGH）可通过肝细胞膜上的生长激素受体刺激胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的分泌，因此将人血清中添加的IGF-1作为对照注入。在注入含IGF-1的血清后，依次注入NanoEnhancers，表面等离子体共振（SPR）信号响应未显示任何特异性结合（图8）。然而，当将添加了重组人生长激素（rhGH）的血清样本注入已固定rhGH抗体的相同位点时，观察到信号增强。综上所述，Nano-SPRi平台对rhGH表现出优异的特异性和选择性。
<img alt="分析血清样本中IGF-1和hGH随时间变化的光学反射率变化的图表。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 纳米SPRi对重组人生长激素（rhGH）选择性的评估。 在添加了rhGH（黑色）和IGF-1（红色）的血清样本中注射后，纳米SPRi生物传感器的响应结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
采用皮尔逊相关系数进行相关性分析，以确定 SPRi 信号强度与 ELISA 光密度值之间的相关性（图9）。当 p 值 <0.01 时认为具有显著性。如图所示，通过 SPRi 和 ELISA 测定的加标人血清中 rhGH 水平之间存在良好的相关性。9 个不同样本的 r 值为 0.9263。
<img alt="光密度与%Δ反射率关系图，显示光谱分析中的线性相关性。" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. ELISA与Nano-SPRi之间的皮尔逊相关性分析。该图显示Nano-SPRi信号强度（y轴）与ELISA光密度（x轴）值之间的相关性。（皮尔逊相关系数 n = 9，r = 0.9263，p = 0.00000183）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用 GraphPad 软件通过 ELISA 测定平衡解离常数（KD）。计算得到的 KD 值约为 79 nM（表 3）。ELISA 方法无法测定结合速率（Ka）和解离速率（Kd）。然而，利用数据分析软件，直接检测方法获得的 KD 值为 23 pM，该计算基于分子质量为 22 kDa，对应于一个 rhGH 分子。结合速率和解离速率分别计算为 6.1 × 107 M-1s-1 和 1.33 × 10-3 sec-1。这意味着每秒有 0.13% 的 rhGH 与抗体复合物发生解离。在放大信号的 SPRi 实验中，NanoEnhancers 与 rhGH 之间的整体相互作用更强，计算得到的结合亲和力为 4.3 pM。此外，NanoEnhancers 与 rhGH 的结合速率高于捕获抗体与 rhGH 的结合速率，但解离速率表明每秒有 0.26% 的 NanoEnhancer/rhGH/捕获抗体复合物发生解离。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>KD（亲和力）</td>
			<td>Ka（结合速率）</td>
			<td>Kd（解离速率）</td>
			<td>检测限（LOD）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA</td>
			<td>79.45 x 10-9 M</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi</td>
			<td>23.2 x 10-12 M</td>
			<td>6.1 x 107 M-1sec-1 </td>
			<td>1.33 x10-3 sec-1</td>
			<td>3.61 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-SPRi</td>
			<td>4.33 x 10-12 M</td>
			<td>7.54 x108 M-1sec-1 </td>
			<td>2.62 x10-3 sec-1</td>
			<td>0.0092 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 完整的动力学数据分析。 使用GraphPad（ELISA）以及数据分析软件（SPRi和Nano-SPRi）评估抗体反应的亲和力、结合速率（on-rate）和解离速率（off-rate）。计算时选用对应于一个rhGH分子的22 kDa分子质量来确定avidity（结合价态亲和力）。所有三项研究的检测限均通过Excel确定。

本研究通过将表面等离子体共振成像（SPRi）检测结果与市售酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒直接比较，评估了直接和信号放大SPRi检测方法在检测人工添加人血清中重组人生长激素方面的诊断潜力。

利用 SPRi、Nano-SPRi 和 ELISA 检测法对血清中人生长激素的比较分析

在较宽浓度范围内（高水平为50-100 ng ml−1……）对人生长激素（hGH）进行灵敏且特异性检测的方法

本研究的总体目标是评估直接和放大表面等离子体共振成像（SPRi）检测技术在血清生物标志物检测中的诊断潜力，并将其与市售的酶联免疫吸附测定试剂盒直接进行比较。该方法有助于回答生物医学领域中的关键问题，例如突出疾病早期阶段，以及提供监测治疗效果的手段。SPRi 的主要优势在于，它能够通过记录传感器表面附近折射率的变化，实现对生物分子相互作用的无标记、实时监测与可视化。该技术的应用前景涉及血清中人生长激素（hGH）水平的诊断，因为内源性hGH已与多种影响人类生长发育的医学疾病相关联。该方法的可视化演示至关重要，因为生物芯片表面化学处理步骤较难掌握，任何操作失误都可能对结果产生极大影响。根据文本方案配制溶液和蛋白质样品后，使用120毫升稳定化的piranha溶液，在50°C下超声处理90分钟，以清洗金芯片。用去离子水冲洗芯片，并在水中超声处理五分钟。然后用乙醇冲洗芯片，并用氮气流吹干。将金芯片置于紫外臭氧清洗仪中处理30分钟，以去除任何污染物。接下来，将 150 毫克的 11-巯基十一烷酸加入含有塑料帽（用于固定芯片）和搅拌子（以使溶液均匀混合）的试管中，试管内预先装有 20 毫升乙醇。将芯片放入试管并盖上盖子，随后在 50 瓦、50 °C 条件下微波处理 5 分钟。用乙醇冲洗芯片，并将其在乙醇中浸泡五分钟。用水重复冲洗，并浸泡五分钟。在含有搅拌子的试管中，将150毫克1-乙基-3-碳二亚胺加入20毫升水中。将芯片转移至试管中，并按上述方法进行微波处理。用水冲洗芯片，并在水中浸泡五分钟。然后在含有搅拌子的试管中，将150毫克N-羟基琥珀酰亚胺加入20毫升水中。将芯片加入试管中，用盖子密封后进行微波处理。按照之前的方法用水冲洗并浸泡芯片后，向含有搅拌子的试管中加入250微摩尔的聚乙二醇溶于20毫升水中。加入芯片并进行微波处理，然后按照之前的方法用水冲洗和浸泡。配制每毫升含15微克的抗rhGH抗体溶液，并以抗IgG作为阴性对照，分别取10微升加入384孔板中的不同孔内。在微阵列点样仪中设计点样模式，使用500微米带聚四氟乙烯（Teflon）涂层的点样针将抗体点样到芯片上。将点样后的芯片在室温、75%湿度条件下孵育两小时。在根据正文方案对SPRi实验进行设置并完成芯片封闭后，用含10%血清和1毫克/毫升BSA的PBS配制一系列浓度的重组人生长激素（rhGH）溶液。此步骤中所选用的封闭分子类型需特别强调，因为其目的是尽量减少非特异性相互作用。在0.5毫升微量离心管中，将1微升6微摩尔的生物素标记抗rhGH检测抗体与3微升1微摩尔的链霉亲和素包被近红外量子点混合，配制成2:1的溶液。将150微升添加了hGH的人血清溶液注入进样环中。信号将迅速增强，随后由于非特异性结合的血清成分从表面被洗脱，信号缓慢下降。信号稳定后，将450毫摩尔的氯化钠溶液加入运行缓冲液中，用于清洗表面。用运行缓冲液将抗rhGH检测抗体和量子点溶液稀释至10纳摩尔浓度，并注入流动池。将数据导入数据分析程序中。然后绘制 SPRi 信号随时间变化的曲线，并在高盐洗涤后确定抗 rhGH 抗体点与阴性对照抗体点之间的差异。进行 ELISA 时，在按照文本方案准备好试剂、抗体包被的孔板和标准品后，将 rhGH 激素样品配制为含 10% 人血清的以下浓度。每孔加入 50 µL 的各标准品、对照品和样品，每个样本设三个复孔。然后密封各孔，并在4°C下轻轻振荡孵育过夜。次日，从振荡器中取出板，使其恢复至室温。将抗rhGH HRP、结合缓冲液、洗涤缓冲液、显色剂四甲基联苯胺（TMB）和终止液恢复至室温。配制工作试剂时，使用偶联缓冲液将抗rhGH HRP稀释40倍。用蒸馏水将洗涤缓冲液稀释200倍。向每个孔中加入50 µL抗rhGH HRP偶联物。封闭各孔，在室温下轻轻振荡孵育30分钟。倾去孔内溶液，将板倒置并轻拍于吸水纸上使其干燥。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，随后再次倾去溶液，并轻拍干燥。重复洗涤三次。轻敲96孔板以去除辅助试剂非常重要，因为仅依赖移液器无法有效去除。接下来，在洗涤步骤后的15分钟内，向每个孔中加入100 µL显色剂。在室温下避光孵育30分钟，同时轻轻振荡。无色溶液将变为蓝色。向每孔中加入100 µL终止试剂。溶液颜色将由蓝色变为黄色。立即使用酶标仪在450纳米波长下测定每个孔的吸光度。最后，根据提供的标准品绘制标准曲线，然后绘制10%血清样品中重组人生长激素（rhGH）的光密度值相对于各样品浓度的曲线。在本视频中，比较了SPRi和纳米SPRi与ELISA在检测重组人生长激素（rhGH）时的性能。该图显示了在10%人血清中添加rhGH后的滴定曲线，并以450纳米处测得的吸光度（OD）作图。观察到良好的线性响应，检测限确定为每毫升1纳克。在此，采用 SPRi 对 rhGH 的检测进行了评估。浓度梯度曲线上的每个点代表由每个浓度的三条 SPRi 动力学曲线计算得到的反射率差值的平均值。检测限（LoD）确定为 3.61 纳克每毫升。为了提高 SPRi 生物传感器的灵敏度，实验中依次向传感器引入了纳米增强剂。在此实验中，纳米增强剂使生物传感器的响应信号最高增强了 7.9%，而对照组的信号变化极小。通过检测 0.25 至 30,000 皮克每毫升（picograms per milliliter）范围内的重组人生长激素（rhGH），评估了该纳米增强 SPRi 生物传感器的实用性。检测限（LoD）计算为每毫升 9.2 皮克，变异系数为 20%。若操作得当，掌握该技术后，直接检测可在 1 小时内完成，纳米 SPRi 检测可在 2 小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住对每一步骤的条件进行优化；一旦完成优化，结果可在更短时间内被轻松重复。在完成该实验后，可直接在芯片上进行其他方法，如多通道检测、maspeck 分析等，以提供关于捕获分子的额外信息。该技术开发完成后，将为医学诊断领域的研究人员探索与癌症、神经及心血管疾病相关的多种生物标志物的同步检测提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立 SPRi、纳米 SPRi 以及 ELISA 检测方法，用于检测人血清中 hGH 的水平。请注意，操作试剂可能具有极高危险性，在执行本实验操作时，务必采取佩戴手套和护目镜等防护措施。

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