Name: 药物与DNA相互作用的细胞全基因组映射与COSMIC（小分子交联，染色质隔离） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习COSMIC技术用于细胞全基因组药物DNA相互作用映射，通过小分子交联和染色质分离方法直接测量配体DNA结合，为DNA靶向分子设计和药物开发提供机制洞察。

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我们感谢 Ansari 实验室成员以及 Parameswaran Ramanathan 教授提供的有益讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA133508 和 HL099773、H. I. Romnes 教师研究员奖以及 W. M. Keck 医学研究奖对 A.Z.A. 的支持。G.S.E. 得到了生物化学系 Peterson 研究生奖学金以及美国国立卫生研究院 T32 GM07215 分子生物科学培训项目的支持。A.E. 得到了 Morgridge 研究生奖学金和干细胞与再生医学中心奖学金的支持，D.B. 得到了美国国家科学基金会（NSF）NSEC 项目的资助。

1. 活细胞中的交联
<ol>
	<li>以约 2.5×107 个 H1 细胞或其他培养细胞开始。 
	注意：此数量的 H1 细胞相当于五个 10 cm 培养皿（约 40% 汇合度）。</li>
	<li>将细胞培养于涂有支持多能干细胞生长表面的培养皿中的 E8 培养基中，并在 37 °C、5% CO2 的湿化气氛中孵育。通过酶法收获细胞（参见材料列表）。注意：避免 H1 细胞汇合度超过 90%；高汇合度会诱导 H1 细胞自发分化。为计数细胞，额外培养一个 10 cm 培养皿的细胞，按照 1.8–1.10 节所述方法通过酶法消化细胞，并用血细胞计数板进行计数。
	<ol>
		<li>按照 Chen et al.54&#160; 的方法配制 E8 培养基</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加入多酰胺之前，使用连接真空泵的巴斯德吸管移除用过的培养基。使用移液管和移液器分配器向每个培养皿中加入新鲜培养基（每 10 cm 培养皿 8 ml）。 
	注意：应将培养基沿培养皿壁加入，以避免扰动细胞。从此时起需将细胞避光，防止多酰胺过早发生光交联。</li>
	<li>使用移液器将多酰胺直接加入各培养皿的培养基中（每皿加入 8 µl 的 400 µM 多酰胺 DMSO 溶液，终浓度为 400 nM）。轻轻晃动培养皿，使多酰胺在培养基中均匀分散。 
	注意：浓度可调整，但需确保所选处理条件不引起细胞毒性。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 的湿化气氛中孵育 24 小时，并保持避光。 
	注意：可通过改变孵育时间来检测多酰胺在不同时间点的结合情况。</li>
	<li>使用移液管和移液器分配器，每 10 cm 培养皿用 4 ml PBS（1.05 mM 磷酸二氢钾，155.17 mM 氯化钠，2.97 mM 磷酸氢二钠）洗涤一次。吸除 PBS，再加入 3 ml E8 培养基。</li>
	<li>在弱光条件下，取下 5 个培养皿的盖子，将培养皿置于超净台外的平坦表面上。在 5 个培养皿上方放置玻璃滤光片，以滤除波长 λ &#60; 300 nm 的光线。将紫外光源置于滤光片上方。用 365 nm 紫外光（2.4 mW/cm2）照射 30 分钟进行交联。 
	注意：交联时间应通过实验确定。</li>
	<li>将培养皿移回超净台内。使用连接真空泵的巴斯德吸管吸除培养基。每 10 cm 培养皿用 4 ml PBS 洗涤一次，吸除 PBS。每 10 cm 培养皿加入 3 ml 细胞解离酶（参见材料列表）以解离细胞。在 37 °C 孵育 5 分钟。 
	注意：解离酶不得预先温育。</li>
	<li>每皿加入 3 ml E8 培养基以终止酶反应。将解离后的细胞转移至一个 15 ml 圆底离心管中。 
	注意：从此步骤开始，将细胞置于冰上。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。吸除上清液以去除酶和培养基。 
	注意：暂停点。细胞可用液氮速冻后于 -80 °C 保存，以便后续实验时使用。</li>
</ol>
2. 染色质的分离
<ol>
	<li>加入1.2 ml COSMIC缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 8.1]，2 mM EDTA，150 mM NaCl，1% Triton-X100，0.1% SDS），用移液器上下吹打数次，充分重悬每份样品的细胞沉淀。
	<ol>
		<li>分别加入 133 µl 的 100 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、100 mM 苄脒和 150 µM 胃蛋白酶抑制剂 pepstatin 蛋白酶抑制剂 新鲜 加入PMSF和苯甲脒至终浓度为1 mM，胃蛋白酶抑制剂至终浓度为1.5 µM。将细胞裂解液分装到两个棕色1.7 ml微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用超声波破碎仪超声处理35分钟（开启10秒，关闭10秒，功率60%），将基因组片段化至100–500 bp。
	<ol>
		<li>保持微量离心管中染色质溶液的液面与储水槽中水的液面平行。通过目视检查确认该液面位置。&#160; 
		注意：使用1.5%琼脂糖凝胶确认DNA已剪切。55</li>
		<li>根据经验优化超声时间。在储液槽中使用最少数量的冰来冷却样品，并确保冰不会阻碍样品与杯状 horn 之间的接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以12,000 × g离心10分钟。用移液器将含有可溶性染色质的上清液转移至新的棕色微量离心管中保存。弃去沉淀。</li>
	<li>将110 µl（10%）样品转移至新的微量离心管中，标记为Input DNA，于-80 °C保存。其余染色质样品置于冰上，用于后续3.3步骤。</li>
</ol>
3. 捕获配体-DNA 交联物
<ol>
	<li>使用移液器将60 µl链霉亲和素包被的磁珠加入微量离心管中。加入1 ml COSMIC缓冲液，在室温下于旋转摇床中混匀5分钟。将磁珠置于磁力分离架上2分钟以捕获磁珠。用移液器吸除COSMIC缓冲液。 
	注意：切勿让磁珠干燥。请立即进行下一步操作。</li>
	<li>将染色质样品（约1 ml）加入磁珠（60 µl）中并重悬磁珠。在4 °C条件下，于旋转摇床上与链霉亲和素包被的磁珠孵育至少4小时。如需要，可过夜孵育样品。</li>
</ol>
4. 亲和纯化DNA的分离
<ol>
	<li>在室温下，使用以下洗涤缓冲液以7分钟间隔洗涤磁珠，以去除非特异性相互作用。每次洗涤后使用磁力架捕获磁珠。每次更换洗涤缓冲液后，重新悬浮磁珠。</li>
	<li>使用去离子蒸馏水配制洗涤缓冲液，并在使用前经0.2 µm滤膜过滤。洗涤缓冲液1和2可在4 °C下保存数月。洗涤缓冲液3需每日新鲜配制。使用移液器添加和移除样品中的洗涤缓冲液。对于2和4，分别在洗涤过程中加入1和3（5 mM）。在进行下列洗涤步骤前，样品还可额外用COSMIC缓冲液洗涤两次（一次12小时，一次4小时）。
	<ol>
		<li>用洗涤缓冲液1（10 mM Tris-Cl [pH 8.0]，1 mM EDTA，3% SDS）洗涤一次；用洗涤缓冲液2（10 mM Tris-Cl [pH 8.0]，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.5% NP40，1% 脱氧胆酸钠）洗涤一次；用洗涤缓冲液3（4 M 尿素，10 mM Tris-Cl [pH 7.5]，1 mM EDTA，0.1% NP-40）洗涤两次；用Tris EDTA（TE）缓冲液（10 mM Tris-Cl [pH 8.0]，1 mM EDTA）洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器将磁珠重悬于200 μl TE缓冲液中。此捕获的DNA样品称为亲和纯化（AP）DNA。</li>
	<li>向Input和AP DNA中加入10×交联逆转缓冲液（100 mM Tris-Cl [pH 8.0]，1 M KOH，4 mM EDTA），使其终浓度为1×。56,57 在90 °C孵育30分钟。 
	注意：也可使用254 nm紫外照射逆转补骨脂素交联，58 但该波长照射可能形成环丁基嘧啶二聚体，干扰后续DNA处理。</li>
	<li>对于AP DNA，将含有样品的微量离心管置于磁力架上，室温静置2分钟，用移液器分离液体（DNA）。将已从磁珠释放的AP DNA转移至新的棕色微量离心管中。 
	注意：目标AP DNA存在于液体中，不再与磁珠结合。</li>
	<li>使用浓盐酸将Input和AP DNA中和至pH 7，每100 μl样品约加入1 µl 6 N HCl。用移液器取约0.5 µl样品点于pH试纸，确认样品已中和。警告：浓盐酸为强腐蚀性酸，操作时应遵循所在机构关于个人防护装备的指导原则。</li>
	<li>向Input和AP DNA中加入RNase A（100 mg/ml），使其终浓度为0.2 µg/µl，在37 °C孵育1小时。随后向Input和AP DNA中加入Proteinase K（20 mg/ml），使其终浓度为0.2 µg/µl，55 °C孵育1小时。</li>
	<li>使用DNA纯化柱试剂盒对DNA进行纯化（参见材料清单）。55 用58 μl DNA级H2O洗脱DNA。将Input和AP样品储存于-20 °C或-80 °C。</li>
	<li>通过定量聚合酶链式反应（qPCR）结合位点特异性引物，和/或通过高通量测序分析AP DNA。进行qPCR时，每个位点使用2 µl AP DNA，反应参数如下：95 °C预变性10分钟（1个循环），随后进行40个循环：95 °C变性20秒，54 °C或56 °C退火20秒，72 °C延伸40秒。 
	注意：退火温度应根据所用引物对的熔解温度进行调整。选择可使定量循环数最小且无非特异性扩增的退火温度。 
	注意：若采用高通量测序分析，目标应获得至少1000万条比对上的读段。可通过增加AP DNA用量或将更少样品合并进行测序来提高比对读段数量。更多读段可提升检测灵敏度。标准ChIP-seq分析软件包（例如，HOMER59、MACS60和SPP61）适用于COSMIC-seq数据。与其他依赖高通量测序的方法（如全基因组测序和ChIP-seq）类似，重复区域会导致序列比对和组装中的不确定性，仍是技术上的挑战。</li>
</ol>

A.Z.A. 是 Vista Motif, LLC 和 WINStep Forward 的唯一所有人。

传统ChIP技术面临的主要挑战之一是合适抗体的筛选。ChIP高度依赖抗体的质量，而大多数商用抗体并不适用于ChIP实验。事实上，DNA元件百科全书（ENCODE）联盟发现，仅有20%的商用抗体适用于ChIP检测50。在COSMIC技术中，抗体被链霉亲和素（streptavidin）所取代。由于多酰胺分子上修饰有生物素（biotin），因此使用链霉亲和素替代抗体来捕获多酰胺–DNA交联复合物。生物素与链霉亲和素之间的相互作用是自然界中已知最强的相互作用之一，其强度比抗体与其配体的结合强一千到一百万倍62。我们利用这一强韧的相互作用以及链霉亲和素本身的内在稳定性，对捕获的多酰胺–DNA交联物进行剧烈的洗涤处理，这种条件足以使抗体变性。这些洗涤步骤显著降低了COSMIC的背景信号。此外，在此类剧烈条件下，诸如组蛋白等生物素化蛋白会去折叠并从DNA上解离63,64。
添加生物素基团会增加分子的大小，可通过替换为“可点击”基团（例如炔基）来减小分子体积。43-46 该基团可用于在细胞裂解后引入生物素基团。...

人体内每个细胞的生成信息都编码在DNA中。对这些信息的选择性使用决定了细胞的命运。转录因子（TFs）是一类能够结合到特定DNA序列上的蛋白质，可表达基因组中特定的基因子集，而转录因子的功能异常与多种疾病的发生相关，包括发育缺陷、癌症和糖尿病。1,2 我们一直致力于开发能够选择性结合基因组并调控基因调控网络的分子。
由多胺组成的 N-甲基吡咯和 N甲基咪唑是经过合理设计的分子，能够以媲美天然转录因子的特异性和亲和力靶向DNA。3-6 这些分子结合到DNA小沟中的特异序列。4,5,7-11 聚酰胺已被用于抑制和激活特定基因的表达。4,12-19 它们还具有有趣的抗病毒作用20-24 抗癌12,13,25-30 特性。聚酰胺的一个显著优点是能够识别并结合甲基化的DNA序列31,32 并缠绕在组蛋白上9,10,33.
为了测量DNA结合分子的全面结合特异性，我们实验室开发了识别共有序列位点（cognate site identifier, CSI）的方法。34-39 基于体外（in vitro）特异性的结合位点预测出现频率（基因组景观，genomescapes）可以在基因组上进行可视化展示，因为体外（in vitro）结合强度与结合常数（Ka）成正比。34,35,37 这些基因组景观有助于理解多酰胺类分子在全基因组范围内的占据情况，但在活细胞中直接测量多酰胺的结合仍具挑战性。DNA在细胞核内高度紧密地包装，可能影响结合位点的可及性。这些染色质化DNA序列对多酰胺的可及性仍是一个未解之谜。
近年来，出现了许多研究小分子与核酸相互作用的方法40-48。化学亲和捕获与大规模并行DNA测序技术（chem-seq）便是其中之一。chem-seq利用甲醛将小分子与基因组中的特定靶标交联，并使用生物素标记的小分子衍生物来捕获配体与靶标之间的相互作用48,49。
甲醛交联会导致间接相互作用，从而产生假阳性结果。50 我们开发了一种新方法——小分子交联分离染色质技术（COSMIC）51，通过引入光交联剂以消除这些所谓的“幻影”峰。50 首先，我们设计并合成了多胺的三功能衍生物。这些分子包含一个DNA结合多胺、一个光交联剂（补骨脂素）以及一个亲和标签（生物素，图1）。利用三功能多胺，我们可通过365 nm紫外光照射共价捕获多胺–DNA相互作用，该波长不会损伤DNA，也不会引发非补骨脂素介导的交联。51 随后，我们在严格且半变性的条件下对基因组进行片段化，并纯化被捕获的DNA，以减少非共价结合的DNA。因此，我们认为COSMIC是一种与chem-seq相关的方法，但能更直接地读取DNA靶向信息。重要的是，补骨脂素对DNA的亲和力较弱（Ka 103-104 M-1），不会显著影响多胺的特异性。51,52 富集的DNA片段可通过定量聚合酶链式反应51（COSMIC-qPCR）或下一代测序53（COSMIC-seq）进行分析。这些数据有助于无偏倚地、基于基因组指导设计能够特异性结合目标基因组位点并最小化脱靶效应的配体。
<img alt="聚酰胺-DNA 加合物形成示意图涉及测序；通过 qPCR 和测序进行基因组分析。" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 生物活性聚酰胺及 COSMIC 实验方案。（A）发夹型聚酰胺 1–2 靶向 DNA 序列 5′-WACGTW-3′。线性聚酰胺 3–4 靶向 5′-AAGAAGAAG-3′。为清晰起见，N-甲基咪唑环以粗体标出。空心圆和实心圆分别代表 N-甲基吡咯和 N-甲基咪唑。方块代表 3-氯噻吩，菱形代表 β-丙氨酸。补骨脂素和生物素分别用 P 和 B 表示。（B）COSMIC 实验方案。用聚酰胺的三功能衍生物处理细胞，经 365 nm 紫外光照射交联后，裂解细胞并剪切基因组 DNA。加入链霉亲和素包被的磁珠以捕获聚酰胺–DNA 加合物。释放 DNA 后，可通过定量 PCR（qPCR）或下一代测序（NGS）进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亮抑酶肽</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>我们已成功尝试其他厂家的DNA柱产品。</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP 样品制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>该试剂盒可用于为下一代测序制备COSMIC DNA</td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>用于包被培养板以生长H1胚胎干细胞（H1 ESCs）</td></tr><tr><td>pH试纸</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棕色微量离心管</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex滤器</td><td>任意来源</td><td></td><td>Pyrex烤盘适用</td></tr><tr><td>qPCR预混液</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl（6 N）</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm组织培养皿</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml锥形管</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪（nutator）</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外光源</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>可使用其他紫外光源，但交联时间需通过实验优化</td></tr><tr><td>Misonix超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>S4000配431C1杯型探头</td><td>可使用其他超声仪，但超声条件需通过实验优化</td></tr><tr><td>带湿度控制的CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带真空出口的生物安全柜</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用cosmic（小分子交联分离染色质）技术在细胞中进行药物-dna相互作用的全基因组定位

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

基因组是一些最有效化疗药物的作用靶点，但大多数此类药物缺乏DNA序列特异性，从而导致剂量限制性毒性和多种不良副作用。利用具有序列特异性的 小分子靶向基因组，可能有助于开发出治疗指数更高且脱靶效应更少的药物分子。 N-甲基吡咯/N甲基咪唑聚酰胺是一类可被合理设计以高精度靶向特定DNA序列的分子。与大多数天然转录因子不同，聚酰胺在结合甲基化或染色质化DNA时，其亲和力不会降低。聚酰胺的序列特异性已得到广泛研究 体外 通过同源位点鉴定（CSI）以及传统的生物化学和生物物理方法，已对多酰胺类化合物的结合特性进行研究，但在细胞内研究其与基因组靶标的结合仍具挑战性。本文报道了一种名为小分子交联分离染色质（crosslinking of small molecules to isolate chromatin, COSMIC）的方法，可鉴定多酰胺在整个基因组中的结合位点。COSMIC 与染色质免疫共沉淀（ChIP）技术类似，但在两个关键方面存在差异：（1）采用光交联剂以实现对多酰胺结合事件的选择性、时间可控的捕获；（2）利用生物素亲和标签在半变性条件下纯化多酰胺–DNA 共价复合物，从而减少非共价结合的 DNA 干扰。COSMIC 是一种通用策略，可用于揭示多酰胺及其他靶向基因组的化学治疗药物在全基因组范围内的结合行为。

为消除基因组片段化不均一性及其他变量的影响，纯化的DNA应始终以输入DNA（Input DNA）作为参照进行标准化。可使用针对目标位点的特异性引物。同时分析一个预期无分子结合的位点作为阴性对照，有助于实验结果的解读。我们观察到 &gt;365 nm 光照后聚酰胺占据率增加 100 倍（图2).
富集的DNA也可通过下一代测序进行分析。DNA的测序文库制备方法与ChIP DNA的制备方法相同（例如，使用商业样品制备试剂盒，参见材料列表）。即使采用下一代测序技术，我们仍使用qPCR来确认在预期多酰胺结合的基因组位点处DNA的富集情况。测序完成后，将原始DNA读段比对至参考基因组，并使用专为分析ChIP-seq数据设计的相同软件生成密度图谱图3）。根据我们对细胞内多酰胺分布的分析，发现跨越广泛亲和力范围的成簇结合位点最能预测细胞内的占据情况。我们开发了一种算法，用于对整个基因组与我们的多酰胺结合情况进行评分 体外 CSI 数据（图4A）。该评分方法表明...

确定基因组靶向分子的直接作用靶点仍然是一个重大挑战。为了理解DNA结合分子如何与基因组相互作用，我们开发了一种依赖小分子交联来分离染色质的方法（COSMIC）。

利用COSMIC（小分子交联分离染色质）技术在细胞中进行药物-DNA相互作用的全基因组定位

基因组是一些最有效化疗药物的作用靶点，但大多数此类药物缺乏DNA序列特异性，从而导致……

本实验的总体目标是确定聚酰胺及其他靶向DNA的小分子在细胞内的全基因组结合谱。该方法可通过利用基因组信息指导靶向DNA分子的设计，从而推动药物-DNA化学领域的发展。该技术的主要优势在于能够直接测量配体与DNA的相互作用，从而深入揭示作用于基因组的配体分子的作用机制。一些最成功的治疗剂是能够与DNA结合并干扰基因组活动的小分子。尽管该方法最初是为研究多胺类化合物而开发的，但也可应用于其他类型的靶向DNA分子。本实验所用细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化气氛中，于10厘米培养皿中的E8培养基及支持多能干细胞生长的表面包被上进行培养。在添加多酰胺之前，弃去用过的培养基，并向每个10 cm培养皿中加入8 ml新鲜培养基。从此时起，需将细胞避光保护，以避免过早发生光交联。使用移液器将多酰胺直接加入每个培养皿的培养基中。轻轻晃动培养皿，使聚酰胺均匀分散到培养基中。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育24小时，并确保避光。次日，使用移液管和移液器，每10 cm培养皿加入4 ml PBS洗涤一次。吸去 PBS，加入 3 ml E8 培养基。在光线较暗的条件下，将细胞移至超净台外的平坦表面，打开五个培养皿的盖子。将玻璃滤光片覆盖在五个培养皿上方，以滤除波长小于 300 纳米的光线。将紫外光源置于滤膜上方，用365纳米的UVA辐射交联样品30分钟。UVA照射结束后，将培养皿重新放回超净台。使用连接真空泵的巴斯德吸管吸出培养基，每10 cm培养皿用4 ml PBS洗涤。吸去PBS，每10 cm培养皿加入3 ml细胞解离用酶溶液。室温孵育5分钟。每皿加入 3 ml E8 培养基以终止酶反应。将解离的细胞转移至一个 15 ml 的锥形离心管中。从此步骤开始，将细胞置于冰上保存。将解离的细胞在 500 × g、4 摄氏度条件下离心五分钟。吸除上清液以去除酶和培养基。开始染色质分离实验前，加入新鲜的蛋白酶抑制剂配制 cosmic 缓冲液。向基础宇宙缓冲液中新鲜加入 12.1 µL 的 100 mM PMSF、100 mM 苄脒和 150 µM 胃蛋白酶抑制剂。将 1.2 mL 宇宙缓冲液加入细胞沉淀中，反复吹打数次以重新悬浮细胞。然后将细胞悬液分装至两支棕色 1.7 mL 微量离心管中。使用超声波破碎仪进行超声处理，将基因组片段化至100至500个碱基对之间。保持微量离心管中染色质溶液的液面与储水槽中水的液面齐平。通过目视检查确认液面高度一致。超声时间已通过经验优化，以60%的功率进行超声，开启10秒，关闭10秒，持续35分钟。在储液槽中使用少量冰对样品进行冷却，并确保冰不会阻碍样品与杯式探头之间的接触。超声完成后，将样品在12 000 g下离心10分钟。将含有可溶性染色质的水相溶液转移至新的棕色微量离心管中保存。弃去沉淀。取110微升或样品的10%转移至新的微量离心管中。标记为输入DNA，并在-80摄氏度下保存。将剩余的染色质样品置于冰上，用于本方案后续步骤。为捕获配体-DNA交联物，将剩余的染色质样品加入链霉亲和素包被的磁珠中，并重新悬浮混合物。在4摄氏度下，将染色质与磁珠在旋转摇床上孵育至少四小时。洗涤缓冲液需使用去离子蒸馏水配制，并在使用前用0.2微米滤器过滤。缓冲液1和缓冲液2可在4摄氏度下保存数月，但缓冲液3必须每天新鲜配制。当染色质与链霉亲和素包被的磁珠孵育完成后，用洗涤缓冲液1洗涤样品7分钟。将样品置于磁力分离架上以捕获磁珠，并移除洗涤缓冲液1。加入洗涤缓冲液2，再洗涤7分钟。然后用洗涤缓冲液3洗涤两次，每次七分钟。最后用TE缓冲液洗涤两次。最后一次TE缓冲液洗涤后，将磁珠重悬于200 µL TE缓冲液中。这种捕获的DNA样品被称为亲和纯化DNA或AP DNA。接下来，向输入DNA和AP DNA中加入10倍浓度的交联逆转缓冲液，使其终浓度为1倍。在90摄氏度下孵育30分钟。将含有AP DNA的微量离心管置于磁力分离架上，室温静置2分钟，然后将含有AP DNA的液体转移至新的棕色微量离心管中。在Input和AP DNA中和后，向两种DNA样品中加入RNase A，使其终浓度为0.2微克/微升。在37摄氏度孵育1小时。一小时后，向输入DNA和AP DNA中均加入蛋白酶K，使其终浓度为每微升0.2微克。在55摄氏度下孵育一小时。随后，使用DNA柱纯化试剂盒对输入DNA和AP DNA进行纯化，并用DNA级水洗脱。将DNA储存于20或80摄氏度，直至准备进行分析。亲和纯化DNA的定量应始终以输入DNA作为参照进行标准化。使用位点特异性引物进行的定量PCR代表性结果表明，在365纳米光照射后，多胺的占据率增加了100倍以上。富集的DNA还可通过新一代测序进行分析。测序完成后，原始DNA读段将比对至基因组，并生成密度图谱。本示例展示了针对AAG重复序列设计的线性多酰胺4的密度图谱。对细胞内聚酰胺分布的分析表明，跨越广泛亲和力范围的成簇结合位点最能预测细胞内的占据情况。研究人员开发了一种算法，利用体外特异性结合位点鉴定数据对整个基因组的结合能力进行评分。这些小提琴图显示了聚酰胺2和聚酰胺4在整个基因组中结合的预测评分。还展示了聚酰胺4的代表性基因组景观。该评分方法显示，具有多个低和中等亲和力序列的位点与具有少量高亲和力序列的位点表现出相似的聚酰胺占据水平。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成。在进行该实验操作时，重要的是需注意在DNA纯化之前始终将样品避光保护。完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如RT-PCR和RNase C实验，以探究更多科学问题，例如结合对基因表达的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用cosmic技术绘制多胺类化合物在全基因组范围内的结合谱图。

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