的策略，以验证胼胝质介导的Plasmodesmal浇注在热带反应中的作用
2016年4月17日
本文介绍了筛选基因控制的热带响应期间plasmodesmal渗透性，因此生长素梯度的方法。这包括在胚轴热带反应程度的测量 拟南芥和8羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）装载终于胼胝质水平评估检查plasmodesmal渗透性。
该程序的总体目标是筛选热带反应期间参与胼胝体介导的胞间连丝门控的基因。该方法可以帮助回答植物发育生物学领域的关键问题，例如在热带反应期间哪些未知基因控制胞间连丝的细胞间信号传导。这种技术的主要优点是它很简单，也可以工作，并且可以重复。
通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在整个过程中处理拟南芥黄化下胚轴而没有任何损坏是具有挑战性的。我们在建立 GSL8 的规则时首次有了这种方法的想法，GSL8 是胞间连丝门控中的一种葡萄糖合酶。这种方法的视觉演示至关重要，因为音频中提到的程序没有解释难以执行的关键步骤，因为它们需要特殊的设置和处理。
在实验前一天准备 Murashige 和 Skoog 或 MS 培养基。对其进行高压灭菌，并在 125 毫米方形板中填充每个板 50 毫升的介质。第二天，将用 1.1% 次氯酸钠消毒的种子放在半干板上。
从 1 毫米微量移液器吸头开始，用 200 微升水点种子。将种子排成五行，相距 1.8 厘米，每行种子至少相距 0.1 厘米。让一些水蒸发，然后用手术胶带覆盖和密封板。
然后用箔纸包裹板子，将它们放入盒子中。将盒子在 4 摄氏度下孵育 3 天。冷处理三天后，将种子盒转移到 22 摄氏度三天。
再过三天，在黑暗的房间里，在绿光下检查种子的发芽状态。通常，三天大的 Col-0 黄化幼苗长到 1.6 厘米长。在绿灯下，分析改变的向光性和向重力响应。
使用消毒的镐，选择类似大小且笔直、垂直生长的幼苗。轻轻地将幼苗从其下胚轴的最低部分提起，不要接触任何其他部分。然后，小心地将选定的幼苗转移到新鲜的 MS 琼脂平板上。
在新盘子上，以相同的方式定位幼苗的钩子。选择每种遗传背景的至少 20 个幼苗制作每行，并制作每个板的副本。每个板包含两行两个基因型。
要检查向光性响应，请将板放置在黑框中，使幼苗垂直定向。将盒子的一侧打开到板的边缘。然后，将盒子在植物生长室中用单侧白光孵育。
要检查引力响应，请用箔纸包裹板并放入黑盒子中，使幼苗水平。在几个时间点，通常从 90 分钟开始，一直延伸到 12 小时，在弱光条件下对板进行成像。使用扫描仪集收集 600 DPI JPEG 图像。
要测量幼苗的弯曲角度，请在 ImageJ 软件中加载它们的图像。使用放大工具放大，然后滚动到要分析的幼苗。然后使用角度工具测量幼苗弯曲的角度。
为此，双击原始下胚轴生长方向点 A，并将鼠标拖动到弯曲起始点 B，然后，使用左键绘制第一条线。现在，将鼠标从 B 点拖到弯曲端，即 C 点，左键绘制第二条线，形成一个角度，A.真正的弯曲角度是角度 B，等于 180 度减去角度 A.现在，按键盘上的 M 测量并记录角度 A。结果文件将单独打开。
重复上一步测量其余幼苗，并使用数据集电子表格文件测量两种不同背景的平均角度。文本方案中介绍了该测定所需的 HPTS 琼脂糖块的制备。首先准备植物样品。
在这个例子中，分析了胞间连丝大小排阻限改变的突变体。首先，创建一个检测平台。将显微镜盖玻片放在新的 MS 培养基板上。
接下来，从带有三天大黄化幼苗的 MS 板中，使用锋利的手术剪刀小心地从钩子底部切出幼苗，然后将它们转移到盖玻片上。每个遗传背景至少转移五棵幼苗。确定幼苗的方向，使距切除位置仅 0.5 厘米的下胚轴留在覆盖载玻片上，而下胚轴的其余部分接触培养基。
然后，将 HPTS 琼脂糖块放在切除的幼苗顶部，使切除区域与 HPTS 块接触。确保已建立联系。让块在下胚轴上放置 5 分钟。
然后，将下胚轴转移到装有双蒸水的 10 毫米培养皿中，振荡洗涤 15 分钟。接下来，将洗净的幼苗转移到载玻片上。将每个突变体放在对照旁边以进行直接比较。
用 100 至 150 微升双蒸水覆盖下胚轴，并盖上载玻片。现在，按照文本协议中的说明使用共聚焦显微镜分析载玻片。对于此检测，请使用新鲜制备的染料，该染料的保存时间少于两天，并保存在黑暗中。
为了抑制从头胼胝质合成，向染料中加入 1.5 毫摩尔的 2-脱氧-D-葡萄糖。通过选择三日龄的黄化幼苗进行胼胝质染色来开始该测定，有或没有热带反应。用细手术剪刀从钩状区域剪下幼苗。
然后，使用牙签的尖端，将幼苗转移到含有 2 毫升染色缓冲液的小培养皿中。将幼苗在染色缓冲液中避光孵育 2 小时，以 30 RPM 的转速连续摇动。染色后，用双蒸水洗涤幼苗 2 分钟，以去除多余的染色缓冲液。
洗涤后，从每种背景中选择至少五株幼苗进行共聚焦分析。使用 ImageJ 软件测量胼胝质信号强度。在成像软件中打开已以 JPEG 格式保存的共聚焦显微镜文件。
接下来，使用矩形选择工具，将光标拖动到图片上，然后选择要检查的区域。然后，按 M 测量并记录信号强度的数值，结果文件将单独打开。在结果文件中，术语 Mean 表示所选区域的信号强度，而不是几个区域的平均值。
以这种方式逐个分析每个幼苗的信号。重复上述步骤以测量其余的幼苗，并使用数据集电子表格文件测量两种不同背景的平均角度。使用所描述的方案，分析 AtGSL8 的地塞米松诱导型 RNAi 系。
DsGSL8 幼苗在向光性和向重力性方面存在明显缺陷。它们在任一力的影响下都没有表现出弯曲。共质运动的改变表明，dsGSL8 RNAi 敲低中的 HPTSA 染料运动比任何对照都广泛得多。
Calleakae 是胞间连丝大小排阻限制的关键调节因子之一，AtGSL8 是一种已知的胞间连丝胼胝合酶。因此，进行了胼胝质苯胺蓝染色。在对照中，胼胝质在 6 小时后积累，如黄色箭头所示。
然而，6 小时后，突变体的钙排丝水平持续较低。这种胼胝合成的缺失在向光性后 3 小时就明显减少。看完这个视频，你应该对如何通过调节纯胼胝来快速筛选由热带反应引起的胞间连丝门控的变异中的基因有一个很好的了解。
一旦掌握，这项技术可以在拟南芥幼苗发芽三天后大约六个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住避免在转移幼苗时损坏幼苗。此外，在负载测定过程中，在琼脂和下胚轴之间进行适当接触也很重要。
在此发展之后，这项技术为探索基因铺平了道路，即新基因，这些基因在热带期间控制共质电导
率中发挥作用查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文概述了一种筛选基因的方法，这些基因在植物向性反应期间调节胞间质通透性和生长素梯度。重点关注拟南芥下胚轴，评估胞间质通透性和聚糖水平。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物发育生物学
- 细胞间信号传递
- 遗传筛选
背景
- 理解胞间质通道开关对于植物信号传递至关重要。
- 聚糖在调节胞间质通透性中扮演重要角色。
- 植物的向性反应涉及复杂的遗传相互作用。
- 拟南芥作为这些研究的模式生物。
研究目的
- 识别在向性反应期间控制胞间质信号传递的未知基因。
- 增强对聚糖介导的胞间质通道开关的理解。
- 为该领域的研究人员提供简单直接的方法。
使用的方法
- 测量拟南芥下胚轴的向性反应。
- 使用HPTS加载评估胞间质通透性。
- 评估植物组织中的聚糖水平。
- 视觉演示以帮助执行方法。
主要结果
- 识别参与胞间质通道开关的关键基因。
- 在受控条件下成功测量向性反应。
- 展示该方法的有效性和可重复性。
- 突出处理拟南芥下胚轴的挑战。
结论
- 该方法为植物信号传递的遗传控制提供了见解。
- 视觉辅助对于成功实施该技术至关重要。
- 进一步的研究可以在这些发现的基础上探索其他遗传因素。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding gene-mediated regulation of plasmodesmal connectivity provides mechanistic insight into auxin gradient formation, a foundational process in plant developmental signaling. This strategy enables systematic identification of genetic regulators of symplasmic gating, supporting target validation in plant signaling pathways. Such knowledge aids in de-risking hypotheses about intercellular communication mechanisms relevant to crop trait development and stress response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses linking plasmodesmal callose synthesis to tropic response phenotypes.
- Operational Value: Uses aberrant tropic response screening in seedlings to prioritize genes affecting symplasmic connectivity.
- Scientific Value: Supports functional validation of candidate genes via symplasmic tracer movement and callose deposition assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes quantitative plasmodesmal permeability readouts using HPTS agarose block assays.
- Operational Value: Standardizes callose synthesis inhibition via 2-Deoxy-D-glucose treatment for comparative analysis.
- Scientific Value: Enables confocal microscopy-based signal intensity measurement to assess plasmodesmal gating dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene modulation to altered symplasmic connectivity during tropic responses, informing mechanistic models.
- Operational Value: Facilitates cross-genetic background comparison using duplicate plate designs and standardized hypocotyl excision.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening workflows for genes influencing cell-to-cell signaling in developmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by connecting genetic screening to functional validation of plasmodesmal regulators, informing downstream target confidence assessments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes controlling cell-to-cell signaling via plasmodesmata during tropic responses.
- Screening: Enables assay readiness through standardized HPTS loading and callose staining protocols for permeability and gating quantification.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (bending angle, signal intensity) enabling condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity from gene perturbation to symplasmic connectivity changes in tropic response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for genes modulating symplasmic signaling in plant developmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking gene function to plasmodesmal gating mechanisms.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized seedling handling, plate duplication, and blinded angle measurement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with validated roles in symplasmic connectivity regulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Arabidopsis seedling sterilization, plating, and hypocotyl handling without mechanical damage.
- Dependent on instrumentation for confocal microscopy, ImageJ analysis, and controlled light/temperature growth chambers.
- Necessitates cross-team standardization for tropic response imaging, callose staining, and symplasmic tracer assay execution.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different genetic backgrounds or developmental stages.
- Includes practical limitations such as seedling transfer sensitivity and the need for precise agar-hypocotyl contact during loading assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Screening for Altered Phototropic or Gravitropic Responses
4:09
Analysis of Seedling Bending Angles
5:32
Hypocotyl Assay: HPTS Dye-loading
7:30
Callose Aniline Blue Staining
8:44
Analysis of Callose Signal
9:45
Results: Screening AtGSL8 RNAi Plants
11:06
Conclusion
