功能性克隆使用爪卵母细胞表达系统
2016年1月30日
我们描述了一种非洲爪蟾卵母细胞和动物帽系统，用于表达克隆能够在感受态外胚层中诱导反应的基因，并讨论了此类基因的后续分析技术。该系统可用于多种基因产物的功能鉴定。
该程序的总体目标是证明非洲爪蟾卵母细胞，一种动物帽系统，适用于鉴定能够在感受态外胚层中诱导反应的基因产物。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如哪些基因是非法归纳反应所必需的。该技术的主要优点是它使用非洲爪蟾卵母细胞作为表达系统，以产生和鉴定作用于靶组织的诱导剂，甚至是作用于诱导剂上游的基因。
这种方法的视觉演示非常有用，因为解剖和重组步骤高度依赖于阶段，需要精细的技术。从麻醉的雌性青蛙收集卵巢组织后，将组织撕成小块，每块包含大约 10 到 20 个卵母细胞。并将这些片段首先转移到新鲜的 OR2 溶液中，然后转移到含 OR2 的 2.0 毫克/毫升胶原酶中 A.继续在摇床上轻轻搅拌含有组织的混合物 1 小时。
然后将片段转移到新鲜的胶原酶溶液中，再搅拌一小时。期望在这种治疗结束时观察到解絮凝的卵母细胞。继续在完全 OR2 中洗涤卵母细胞 10 次，然后在卵母细胞培养基中洗涤 2 次，缩写为 OCM。
之后，将卵母细胞置于新鲜的 OCM 中，并在解剖显微镜下目视检查它们。通过丢弃较小的未成熟卵母细胞来分离第六阶段的卵母细胞。接下来，将卵母细胞放入含有 OCM 的琼脂糖包被培养皿中，并保持在 18 至 20 摄氏度直至注射。
为了准备显微注射，将玻璃毛细管放入针头拉拔器中，拉动它，然后从玻璃上折断尖端，以产生直径约为 20 微米的针头。在复式显微镜上，用校准的目测微计测量针尖。接下来，将粘土推入 35 x 10 毫米培养皿底部的均匀层中。
然后使用类似 mall 探针的工具在该层中创建平行凹槽。在粘土衬里的培养皿中加入大约 2 毫升 3% Ficoll 和 1x 改良巴斯盐水或 MBS 中。然后使用大口径移液器将卵母细胞转移到其中。
将卵母细胞放置在小窝中，以便在随后的显微注射过程中将它们固定在原位。使用显微注射器，在针头中加入大约 2 微升先前生成的 mRNA 池，并调整平衡以产生轻微的正压，这将防止卵母细胞细胞质在注射过程中被吸入针头。然后，在赤道区域向每个卵母细胞注射 20 纳升 RNA。
然后，将卵母细胞留在 Ficoll MBS 中 1 小时，然后轻轻地将它们转移到 1x MBS 中。继续在 20 摄氏度下孵育卵母细胞 8 至 24 小时。要开始动物帽测定，收集 3/4x 正常两栖动物培养基，缩写为 NAM 溶液、细镊子、发环、先前注射的卵母细胞和第 11 至 11.5 阶段的非洲爪蟾胚胎。
然后，将玻璃盖掰开，滑成大约 1 毫米 x 2 毫米大小的碎片，并将这些碎片通过火焰，直到它们的边缘抛光和绘制。接下来，如前所述，将粘土压成盘子中的单层。并使用商场探针在这种涂层中创建单独的杯形印记。
继续用大约 2 毫升 3/4x NAM 填充培养皿。然后，将注射的卵母细胞转移到它上面，定位几个，使每个卵母细胞都固定在一个凹陷中。为了准备好胚胎，将它们转移到含有 3/4x NAM 溶液的培养皿中。
选择原肠胚的子集用作外胚层年龄的分期对照，并将它们转移到另一个含有相同溶液的培养皿中。并将这个盘子放在一边。对于将用于动物帽评估的胚胎，用两对细镊子去除它们的卵黄膜。
然后，将原肠胶转移到装有卵母细胞的粘土衬培养皿中。首先，使用两对细额头从胚胎上切下动物帽，小心避开赤道组织。要使用第一种方法生成重组体，请放置动物帽，使内表面接触卵母细胞的动物半球，卵母细胞已经位于压痕中。
并对几个注射的卵母细胞重复此过程。为确保这些重组体固定在一起，将弯曲的玻璃盖玻片碎片放在每个重组体的顶部，并向下施加压力，直到动物变平并且盖玻片接触粘土。要使用第二种方法生成重组体，请将动物帽和卵母细胞一起放在粘土中空的单个凹痕中。
并确保动物帽内表面面向卵母细胞。然后，使用小的粘土延伸物将两个组织固定在一起。一旦使用任一方法生成多个重组体，然后在 20 摄氏度下培养和搁置对照胚胎。
当对照胚胎达到所需阶段时，从重组体中取出盖玻片，并使用镊子和发环分离动物帽外胚层。继续在 MEMFA 中固定两个外胚层碎片和对照胚胎 1 小时。并将它们转移到乙醇中并将该组织储存在零下 20 摄氏度。
在这里，将卵母细胞组注射与逐渐减少的克隆或菌落数量相对应的 mRNA 池，然后用动物帽培养。随后，确定了每组中表达 foxe3 的动物帽的数量，foxe3 是通常在推定晶状体外胚层中观察到的标志物，从早期神经板阶段到囊泡形成，并在此处用于评估晶状体诱导能力。这种方法在编码基因 ldb1 的核因子中鉴定，它可以在 179 个中的 50 个中产生晶状体诱导反应，即 28% 的评估动物帽。
这里显示的是我们的原位杂交图像，描绘了 foxe3 信号，由箭头表示，在大约 11 期到第 23 期用注射 ldb1 的卵母细胞培养的动物帽中。在放置在未注射卵母细胞上的相应对照动物帽中未观察到 foxe3 表达。当从这些动物帽生成切片时，在内外外胚层中都观察到 foxe3 表达。
内层的表达是晶状体反应的特征。或者，正如两层中所发出的信号，表示其他结构，例如嗅觉板。按照此程序，可以执行免疫组织化学、原位杂交或直接检测荧光报告基因等方法，以评估动物帽外胚层中的诱导反应。
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概述
本文介绍了一种利用非洲爪蟾卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，用于筛选能够诱导具有反应能力的外胚层产生应答的基因。该方法在鉴定基因产物及其在发育生物学中的功能分析方面尤为有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 基因表达
- 功能基因组学
背景
- 非洲爪蟾卵母细胞是研究基因功能的重要模型。
- 动物帽系统可用于分析外胚层中的诱导反应。
- 理解基因相互作用对于发育过程至关重要。
- 由于解剖过程复杂，可视化技术显得尤为关键。
研究目的
- 鉴定在外胚层中诱导反应的基因。
- 探究基因在发育过程中发挥作用的机制。
- 提供一种可靠的基因产物分析方法。
使用的方法
- 从麻醉的雌性青蛙中采集卵巢组织。
- 将组织解剖成含有卵母细胞的小片段。
- 使用胶原酶A促进卵母细胞的分离。
- 振荡组织混合物以提高卵母细胞的回收率。
主要结果
- 非洲爪蟾卵母细胞系统能有效鉴定基因诱导物。
- 所展示的技术可实现对外胚层组织的精确操控。
- 可视化辅助工具有助于理解实验操作流程。
- 研究结果增进了对发育过程中基因调控机制的广泛认知。
结论
- Xenopus 卵母细胞系统是基因表达研究的有力工具。
- 鉴定诱导因子有助于深入理解发育生物学。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步推动新发现。
常见问题
行业重要性概述
该方法能够对在具有诱导能力的外胚层中引发诱导反应的基因产物进行功能性筛选，有助于验证发育通路中的靶点。通过将分子过表达与组织环境中的表型读数相联系，该方法为早期靶点假设提供了机制层面的风险降低支持。非洲爪蟾卵母细胞表达系统为识别与信号转导级联相关的旁分泌、邻近分泌或转录调控因子提供了一个可扩展的平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测候选基因是否能在未分化组织中诱导特定的发育反应，来验证治疗假设。
- 操作价值：利用定量读出（foxe3 表达）对 cDNA 文库进行表型筛选，从而优先确定具有功能的阳性克隆。
- 科学价值：通过区分直接作用于靶细胞的诱导因子与需要上游调节因子或结合伴侣的诱导因子，支持生物学风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成经过验证的生物系统（卵母细胞-动物帽重组体），用于下游检测的标准化和可重复性测试。
- 操作价值：有助于制备可诱导的组织模型，适用于对信号调节剂或通路抑制剂进行高内涵筛选。
- 科学价值：能够检测在可溶性因子检测中无法捕获的配体非依赖性或接触依赖性信号活性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过评估靶基因过表达或敲低后的发育进程，阐明表型后果及信号通路中的定位。
- 操作价值：提供一种与疾病相关的系统（外胚层发育潜能），用于在生理背景下评价靶基因调控作用。
- 科学价值：通过将分子扰动与早期谱系标志物的诱导（例如 foxe3）相关联，支持转化生物标志物的匹配。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设生成到先导化合物鉴定的发现全过程，尤其适用于通过细胞外或旁分泌机制发挥作用的靶点。
- 发现生物学：通过测量具有诱导能力的外胚层中的诱导能力，验证基因功能假设，明确信号通路的作用，减少机制上的不确定性。
- 筛选：产生标准化且可量化的结果（表达foxe3的动物帽百分比），支持在不同筛选项目中实现检测方法的可重复性及阳性结果的确认。
- 分析：基于标记物在时空表达上的功能读出，实现诱导因子效力的比较以及构效关系的分析。
- 转化研究：将早期基因发现与发育组织中的表型结果相联系，基于诱导保真度支持风险调整后的研发推进决策。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的平台，用于针对外胚层或其他具有诱导能力的组织中多种诱导表型，筛选不同的cDNA或ORF文库。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在基于组织的功能测定中将基因型与诱导表型相关联，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过明确定义的卵母细胞制备、mRNA注射和共培养参数，促进标准化，增强跨实验室的可重复性。
- 战略价值：基于可证明的诱导能力筛选靶点，优化“推进/终止”决策，减少对无功能候选靶点的投资。
- 项目组合影响：能够在生物学重复中一致表现出晶状体诱导或异位组织反应的靶点进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 成功分离和注射卵母细胞需要具备非洲爪蟾胚胎学、显微手术以及mRNA操作方面的专业知识。
- 依赖于显微注射仪器、琼脂糖板制备，以及标志物表达的荧光或显色检测设备。
- 需要跨团队对胚胎分期、动物帽组织分离和固定方案进行标准化，以确保实验的一致性。
- 若将该方法应用于其他模式系统，可能需要优化共培养条件和组织感受态的时间窗口。
- 实际限制包括重组结构的手工构建通量较低，以及外胚层感受态具有特定发育阶段的限制性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Preparation of Oocytes
2:21
Injection of Library Transcripts
4:08
Preparing the Animal Cap Asssay
5:48
Generation and Culture of Recombinants
7:35
Results: Identification of a Gene Product that Elicits a Lens-Inductive Response in Animal Cap Ectoderm
9:11
Conclusion
