Name: 功能性克隆使用爪卵母细胞表达系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解非洲爪蟾卵母细胞表达克隆系统，用于识别诱导外胚层反应的基因产物。该方法结合动物帽重组技术，为发育生物学研究提供可靠的基因功能分析工具。

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本工作获得了谢泼德大学基金会向 C.Z.P. 提供的专业发展资助。作者谨此感谢 Brett Zirkle 和 Malia Deshotel 就实验方案提供的有益讨论，以及 Carol Hurney 博士的大力支持。

所有实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。
注意：图1展示了实验步骤的示意图。
1. 卵母细胞的制备
<ol>
	<li>在卵母细胞分离前约一周，使用 150 U 孕马血清促性腺激素（PMSG）对雌性 X. laevis 进行预促排处理。用带有 29 G 针头的 1 ml 无菌注射器，向背侧淋巴囊注射 1 ml 浓度为 150 U/ml 的 PMSG。</li>
	<li>准备用于卵母细胞注射及卵母细胞-动物帽实验的溶液。
	<ol>
		<li>制备无 Ca++/Mg++ 的 OR2 溶液（OR2-）：82 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.5 mM Na2HPO4、50 mM HEPES，pH 7.2。</li>
		<li>制备 OR2 溶液：在 OR2- 基础上添加 1 mM CaCl2 和 1 mM MgCl2。</li>
		<li>制备 OCM 溶液：60% Leibovitz L15 培养基、0.4 mg/ml BSA、100 μg/ml 庆大霉素，pH 7.8。</li>
		<li>制备 1x MBS 溶液：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.7 mM CaCl2、1 mM MgSO4、5 mM HEPES（pH 7.8）、2.5 mM NaHCO3。</li>
		<li>制备含 3% 蔗糖的 1x MBS 溶液。</li>
		<li>制备 1x NAM 溶液：110 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM Ca(NO3)2、1 mM MgSO4、0.1 mM EDTA、1 mM NaHCO3、2 mM Na3PO4，pH 7.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将雌蛙置于含 0.03% 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS222）的 0.1x MBS 溶液中进行麻醉（先将 0.3 g MS222 溶于 10 ml 95% 乙醇中，再稀释至 1 L 0.1x MBS），浸泡 10–15 分钟，直至其失去反应能力。
	<ol>
		<li>通过将麻醉后的蛙翻转至背部以检查麻醉是否完全，若未完全麻醉，蛙会移动四肢或自行翻转身体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手术刀片切开腹部皮肤和体壁，用镊子和剪刀分离卵巢组织，获取卵巢片段并将其放入 OR2- 溶液中。使用带 24 mm 弯针的 3-0 丝线缝合体壁，并用相同缝线单独缝合皮肤。将雌蛙置于含 1 g/L 水族馆盐的水中恢复。</li>
	<li>用精细镊子将卵巢组织撕成小块（每块含 10–20 个卵母细胞），并转移至新鲜的 OR2- 溶液中。</li>
	<li>在含 2.0 mg/ml 胶原酶 A 的 OR2- 溶液中，于摇床上轻柔振荡 1 小时以去除滤泡层，随后更换新鲜胶原酶溶液，继续振荡 1 小时。</li>
	<li>用含 Ca++/Mg++ 的 OR2 溶液清洗卵母细胞 10 次，并弃去体积较小的卵母细胞。</li>
	<li>用 OCM 溶液清洗卵母细胞两次，然后转移至新鲜 OCM 溶液中。根据大小通过肉眼观察筛选 VI 期卵母细胞，并弃去未成熟（体积较小）的卵母细胞：VI 期卵母细胞比未成熟卵母细胞更大，动物极色素分布均匀，直径约为 1.2–1.4 mm。</li>
	<li>在注射前，将卵母细胞置于 OCM 溶液中，于 18–20 °C 条件下维持培养。注意：可使用琼脂糖包被的培养皿以减少卵母细胞粘附于皿底的情况。</li>
</ol>
2. 文库转录本的注射
<ol>
	<li>构建定向cDNA文库15 使用在适当发育阶段（例如神经板阶段14）提取的RNA10）。购买cDNA文库，或按照以下四个步骤的概述，使用商业试剂盒构建cDNA文库。
	<ol>
		<li>使用产品富集 poly(A)+ RNA（参见材料表），并按照制造商说明分离约 5 μg mRNA。注意：用于构建 cDNA 文库的转录本可限定于特定诱导组织（例如经显微解剖获得的神经板组织），或可来自特定发育阶段的 whole embryos。</li>
		<li>使用商业试剂盒，按照生产商说明书操作合成 cDNA。</li>
		<li>将约 20 ng cDNA 连接到商业试剂盒附带的载体或其他合适的载体中。合适的质粒载体应包含可增强 mRNA 稳定性的序列，例如 5' β-珠蛋白和 3' poly(A) 序列（如 pCS2+、pTnT、pCS105）。</li>
		<li>使用供应商推荐的热激转化方案，将连接产物转入感受态细菌细胞中。 
		注意：也可通过商业途径获得开放阅读框（ORFeome）克隆文库，并可用于体外转录以生成注射用RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备10个质粒池，每池10个3 至 104 复杂性（104 至 105 总复杂度）。这相当于10块平板，每块平板上有1,000至10,000个菌落。
	<ol>
		<li>将文库培养物接种至10个15 cm LB-氨苄青霉素平板，于37 ˚C培养12–18小时，用玻璃涂布器轻轻按压各平板收集菌落，并悬浮于7 ml LB培养基中。</li>
		<li>从0.5 ml菌液中制备甘油菌保存液（加入0.2 ml无菌甘油，-20 ˚C保存），剩余6.5 ml菌液按照生产商说明书，使用 commercially available DNA miniprep kit 提取质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用适当的限制性内切酶消化将混合质粒DNA（1.0 - 2.0 μg）线性化16 在37 ˚C下孵育1–1.5小时。按照所用RNA聚合酶试剂盒的说明书，使用酚/氯仿抽提法分离线性化DNA，随后进行乙醇沉淀，并将DNA重悬于水中。根据生产商的说明，使用商用RNA聚合酶试剂盒合成正义RNA。</li>
	<li>准备用于显微注射的针头（使用拉针仪和玻璃毛细管），针头直径约为20 μm；使用带有校准目镜测微尺的复合显微镜测量针尖尺寸。注意：拉针仪的参数需通过实验确定，以制备出尖端精细的针头，使其用精细镊子折断后能达到所需的尖端尺寸。</li>
	<li>准备35 × 10 mm培养皿，底部均匀铺上黏土并压平，制成带平行凹槽的黏土衬里培养皿，用于在显微注射过程中固定卵母细胞；可用钝头探针或经火焰熔融尖端的巴斯德移液管压出凹槽。作为黏土的替代方案，可制备琼脂糖培养皿，使用弹性体模具在表面压出凹陷。17用宽口移液管将卵母细胞转移至黏土衬里的培养皿中，放入1X MBS中的3% Ficoll溶液（约2 ml）中，按行排列。</li>
	<li>使用显微注射仪，将针头吸入浓度为1 ng/nl的RNA，并调整平衡以产生轻微正压（防止吸入卵母细胞胞质）。</li>
	<li>在赤道区域向卵母细胞注射约 20 nl RNA。注射后的卵母细胞在 Ficoll-MBS 中静置 1 小时，然后轻柔转移至 1x MBS。于 20 °C 培育 8 – 24 小时后进行动物帽检测。</li>
</ol>
3. 动物帽检测
<ol>
	<li>配制 3/4x NAM，并准备精细镊子、毛细环、弯曲的盖玻片碎片，以及带有杯状凹陷且内衬黏土的培养皿用于盛放卵母细胞。通过将玻璃盖玻片 Breaking 成小碎片（约 1 - 2 mm × 2 - 4 mm），经火焰灼烧至边缘光滑并下垂，形成弯曲的盖玻片碎片。</li>
	<li>授粉 X. laevis 卵18 通过 体外 或通过自然交配获得受精卵，并在0.1x MBS中培养至原肠胚阶段（室温下受精后10 - 11小时），然后按发育阶段进行筛选；收集中期原肠胚（阶段11 - 11.5）10 胚胎</li>
	<li>将胚胎转移至一个约半满的3/4x NAM培养皿中。使用两对精细镊子，去除原肠胚的受精（卵黄）膜。</li>
	<li>将卵母细胞转移至含3/4x NAM（约2 ml）的黏土衬里培养皿中，并将其固定在黏土的单个凹槽内，凹槽的制作方法同上文所述用于容纳单个胚胎的沟槽。</li>
	<li>将胚胎转移至黏土衬里的培养皿中，使用两把精细镊子从原肠胚上切下动物极帽。注意仅分离动物极帽外胚层，避免取到赤道区域组织。18.</li>
	<li>将动物极帽放置于每个卵母细胞的动物极半球，使动物极帽的内表面与卵母细胞接触。用弯曲的玻璃盖片碎片压住重组结构，并向下施加压力，使玻璃盖片接触黏土时将外胚层压平（动物极帽可保持开放状态，使其内层暴露于卵母细胞表面6–8小时或更长时间）。 
	注意：或者，将动物帽放入黏土凹陷处，使其内表面朝上，并将一个卵母细胞置于帽上；用少量黏土延伸部分固定重组结构。</li>
	<li>在20 °C条件下培养，直至对照胚胎达到检测所需的发育阶段。</li>
	<li>用镊子和毛环去除盖玻片/黏土，分离外胚层以获得重组体。</li>
	<li>在MEMFA（MEM中含3.8%甲醛，MEM成分为0.1 M MOPS pH 7.4、2 mM EGTA和1 mM MgSO₄）中固定外胚层片段1小时4]).</li>
	<li>将片段（及对照胚胎）从MEMFA转移至乙醇中，并于-20 ˚C保存。</li>
</ol>
4. 外胚层反应的分析 原位 杂交（原位杂交，ISH）
<ol>
	<li>准备原位杂交（ISH）所需溶液。
	<ol>
		<li>制备1x PBS：0.01 M磷酸盐缓冲液，含0.138 M NaCl，pH 7.4</li>
		<li>制备PBS-Tween（PTw）：1x PBS，含0.1% Tween-20</li>
		<li>制备100x Denhart's溶液：2% BSA，2% 聚乙烯吡咯烷酮，2% Ficoll</li>
		<li>制备杂交缓冲液（Hybridization Buffer）：50% 甲酰胺，5x SSC，1 mg/ml 酵母RNA（torula yeast RNA），1 μg/mL 肝素（Heparin），1x Denhart's溶液，0.1% Tween-20，0.1% CHAPS，10 mM EDTA，DEPC-H2O</li>
		<li>制备马来酸缓冲液（MAB）：100 mM 马来酸，150 mM NaCl，pH 7.5</li>
		<li>制备MAB + 封闭液（MAB + block）：MAB中加入2% 封闭试剂（加热至60 ˚C以溶解）</li>
		<li>制备碱性磷酸酶（AP）缓冲液：100 mM Tris（pH 9.5），50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween，dH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备RNA探针。
	<ol>
		<li>使用商业RNA聚合酶试剂盒和dig-NTP混合液，在1.5 ml&#160;离心管中进行反应（总体积50 μl）：加入25.5 μl DEPC-H2O，10 μl 5X 转录缓冲液，2.5 μl 10x dig-NTP混合液，5 μl 100 mM DTT，2 μl RNAsin，2 μl线性化DNA模板（约1 μg/μl），3 μl RNA聚合酶，37 ˚C孵育90分钟。</li>
		<li>加入2 μl RNA聚合酶，37 ˚C继续孵育60分钟。</li>
		<li>取2 μl反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。</li>
		<li>加入1 μl RQ1无RNase的DNase，37 ˚C孵育20分钟。</li>
		<li>通过加入50 μl DEPC-H2O，25 μl 10 M乙酸铵和313 μl乙醇沉淀探针。-20 ˚C过夜（O/N）&#160;，然后在13,800 x g离心20分钟回收RNA。用500 μl 75%乙醇洗涤，短暂离心，吸除乙醇，让沉淀自然晾干。加入50 μl DEPC-H2O溶解。</li>
		<li>加入杂交缓冲液，使探针终浓度约为0.5 μg/μl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于杂交的组织。除非另有说明，每次更换溶液时均将离心管加满（约4 ml）。
	<ol>
		<li>从离心管中移除乙醇，将胚胎转移至75%乙醇/PTw中，再转移至50%乙醇/PTw中，各10分钟，水平置于摇床上振荡。</li>
		<li>在PTw中洗涤三次，每次5分钟，置于摇床上振荡。</li>
		<li>加入含10 μg/μl蛋白酶K的PTw溶液处理；垂直置于摇床上振荡15分钟。</li>
		<li>用0.1 M三乙醇胺（pH 7.8）溶液洗涤两次，每次10分钟，垂直振荡。</li>
		<li>向离心管中加入12.5 μl乙酸酐，垂直振荡5分钟。再加入12.5 μl乙酸酐，继续振荡5分钟。</li>
		<li>在PTw中洗涤一次，5分钟，垂直置于摇床上振荡。</li>
		<li>用4%多聚甲醛在摇床上固定20分钟。将杂交缓冲液加热至60 ˚C。</li>
		<li>在PTw中洗涤三次，每次5分钟，置于摇床上振荡。</li>
		<li>从每管中移除除约1 ml外的所有PTw，加入250 μl杂交缓冲液（Hyb Buffer）；轻轻旋转混匀。垂直振荡5分钟。</li>
		<li>替换为60 ˚C的杂交缓冲液（0.5 ml），在60 ˚C轻轻振荡10分钟。更换新鲜杂交缓冲液，在60 ˚C振荡2至4小时。</li>
		<li>将探针溶液（0.5 μg/μl，1 ml溶于杂交缓冲液）加热至60 ˚C（3分钟）。移除杂交缓冲液，将探针加入各管中。在60 ˚C轻轻振荡过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于抗体结合的组织。
	<ol>
		<li>将杂交缓冲液和2x SSC + 0.1% Tween-20溶液预热至60 ˚C。</li>
		<li>用杂交缓冲液替换探针溶液（将探针保存于-20 ˚C，可重复使用2–3次&#160;）。在60 ˚C洗涤10分钟。</li>
		<li>在2x SSC-Tween中60 ˚C洗涤三次，每次20分钟，振荡。</li>
		<li>在0.2x SSC-Tween中60 ˚C洗涤三次，每次20分钟，振荡。</li>
		<li>在MAB中室温（RT）洗涤两次，每次15分钟，水平置于摇床上振荡。</li>
		<li>加入1 ml MAB + 封闭液，在垂直摇床上封闭2小时。</li>
		<li>转移至含1/2,000稀释的Anti-digoxygenin-AP抗体的1 ml MAB + 封闭液中，4 ˚C垂直振荡过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于显色反应的组织。
	<ol>
		<li>用MAB替换抗体溶液，在MAB中水平振荡洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>在MAB中水平振荡洗涤三次，每次1小时。</li>
		<li>在AP缓冲液中水平振荡洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>将组织转移至多孔塑料板中，移除AP缓冲液，加入BM Purple显色试剂（约1 ml）。避光反应5分钟至过夜（O/N）。</li>
		<li>当显色达到理想程度后，将组织转移至含PTw的离心管中。在摇床上用PTw洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>在Bouin's固定液中4 ˚C避光固定过夜（O/N），置于摇床上。</li>
		<li>用70%乙醇/30% PTw溶液在室温洗涤三次以去除Bouin's溶液。使用落射照明显微镜及显微镜连接的相机进行图像采集，必要时进行漂白处理18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 兄弟选择与克隆
<ol>
	<li>选择在外胚层组织中活性最高（反应最强）的文库。</li>
	<li>将活性最高的文库对应的甘油菌种进行滴定（用LB培养基稀释至适当浓度），并按照上述方案第2节的方法，铺制十个新平板，每个平板的菌落数量约为上一步的十分之一。</li>
	<li>逐步缩小文库规模，直至将活性追踪至单个菌落。</li>
	<li>使用载体上的标准引物获取DNA序列。</li>
</ol>

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<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的功能性基因克隆方法可用于筛选能够诱导感受态外胚层产生反应的基因，从而鉴定多种多样的基因产物。该方法在以往研究的基础上进行了拓展，将组织诱导实验与表达克隆技术相结合。我们利用非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞的代谢途径，在RNA注射后直接或间接地产生诱导因子。结合使用已建立的基因克隆方法6,7——通过cDNA文库或其他克隆集合所生成的转录本进行表达——该策略为致力于发现参与胚胎诱导的新基因的研究者提供了一种有价值的途径。该方法在新基因功能鉴定方面具有广泛的适用性，可作为当前蓬勃发展的反向遗传学方法的有力补充，也可用于对高通量技术（如RNA-seq）21所鉴定出的转录本进行功能性验证。
对照组对于监测用于帽状结构检测实验的卵母细胞的代谢功能至关重要。为了确保每批卵母细胞的健康状态，并验证该系统检测低丰度转录本的能力，实验测试了中胚层诱导因子INHBB mRNA 的不同浓度；该基因与晶状体诱导通路无关，是已有充分文献记录的独立对照14。使用 12/101 抗体检测动物帽外胚层中...

通过基因的功能或功能缺失来鉴定目的基因的正向遗传学方法1,2，是理解发育过程中复杂图式形成事件的重要组成部分。结合日益广泛适用于各类系统和研究者的强大反向遗传学技术3-5，目前已有可能识别出在特定通路中具有关键功能作用的基因，并进一步在细胞水平上阐明该基因的功能及其与其他基因产物的相互作用。过去曾用于功能鉴定目的基因并取得诸多关键发现的一种方法是表达克隆6,7。
我们近期的目标8 旨在鉴定早期晶状体诱导因子，因为已有研究表明，脊椎动物晶状体诱导过程的初始步骤早在原肠胚阶段即已发生。为此，我们采用了短暂具备晶状体诱导能力的9 动物帽外胚层（阶段11-11.5）10的 非洲爪蟾 胚胎作为诱导反应组织，以及VI期 非洲爪蟾 卵母细胞作为诱导因子的产生来源。
以下实验方案基于 Smith 和 Harland 的表达克隆与姐妹选择方案6,7，该方案也已被其他研究者成功应用11-13。在我们的卵母细胞表达系统中（最初由 Lustig 和 Kirschner 用于诱导因子的生产14），我们筛选并鉴定了那些注射后能够直接或间接促使卵母细胞产生可诱导动物帽外胚层发生晶状体诱导反应的因子的转录本池。由于该系统适用于直接表达分泌型诱导分子（在具有中胚层诱导能力的动物帽外胚层中，卵母细胞注射 INHBB mRNA 可导致中胚层诱导8），我们最初预期该筛选方法主要用于鉴定旁分泌因子。然而，由于我们在筛选中鉴定出了一种核因子（ldb18），显然该系统也可用于鉴定多种类型的分子，例如转录或翻译调控因子、miRNA、辅因子或邻近分泌因子。

<table><tbody><tr><td>12/101 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>12/101</td><td>用于肌肉组织检测的单克隆抗体</td></tr><tr><td>20x SSC 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Aurum 质粒小量提取试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>质粒DNA纯化</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Boekel 杂交炉</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Bouin's 溶液</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>用于OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>卵母细胞去滤泡</td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>去除胚胎胶膜</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Dig-RNA 标记混合物</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>用于原位杂交探针</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>用于去除卵黄膜</td></tr><tr><td>乙基-3-氨基苯甲酸酯</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 麻醉剂</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>用于注射介质</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>用于OCM</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>长3.5&quot;，内径0.530 mm</td></tr><tr><td>玻璃样品瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>毛发环</td><td></td><td></td><td>固定在巴斯德移液管上的毛发，用于组织操作</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>纳升注射器 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>微处理器控制的微量注射器</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>蛙类恢复用的水族馆盐</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus 验证全长 cam cDNA</td><td>Source Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA文库&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含100 &amp;micro;g/ml 氨苄青霉素的LB琼脂平板</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150 mm 预制LB-Amp平板，用于同胞筛选</td></tr><tr><td>LB 营养肉汤</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>用于从平板上收集菌落及培养物稀释的LB培养基</td></tr><tr><td>磁性mRNA分离试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>用于分离富含poly(A)的RNA</td></tr><tr><td>马来酸</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>手动Microfil显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>手动显微操作器</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>用于原位杂交的摇床</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>用于注射和解剖皿的黏土</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>用于刺激卵母细胞发育</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>程序化拉针仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>微移液管针头拉制仪</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>pTnT 载体</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA文库构建</td></tr><tr><td>核糖探针组合系统</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>体外转录</td></tr><tr><td>Superscript 全长cDNA文库构建试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>cDNA文库构建试剂盒</td></tr><tr><td>缝合线，3-0 丝线</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>卵母细胞取出后使用的缝合线和缝合针</td></tr><tr><td>酵母RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>用于原位杂交（ISH）</td></tr><tr><td>通用RiboClone cDNA合成系统</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>cDNA文库构建的替代试剂盒</td></tr><tr><td>Xenopus 全长ORF入门克隆 - ORFeome协作项目</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome克隆</td></tr><tr><td>XL2-Blue 超感受态细胞</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>用于cDNA文库转化的细胞</td></tr></tbody></table>

使用 xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

鉴定负责胚胎诱导的基因面临诸多挑战：例如，感兴趣的分泌分子可能丰度较低，或并非真正分泌而是与信号细胞相连，或需要结合伴侣分子或上游调控分子的存在。因此，在寻找能够引发具有诱导能力的外胚层产生早期晶状体诱导反应的基因产物时，我们采用了一种表达克隆系统，该系统可用于鉴定旁分泌或邻近分泌因子，以及转录因子或其他调控蛋白。我们将mRNA混合物注入Xenopus卵母细胞，并将反应组织直接置于卵母细胞上进行共培养。基于从神经板期cDNA文库中克隆出的ldb1能够诱导具有晶状体诱导能力的动物帽外胚层表达早期晶状体原基标志物foxe3的功能，我们进一步表征了ldb1的mRNA表达模式，并检测了其过表达或敲低后对发育进程的影响。该系统适用于多种研究场景，尤其适用于在具有诱导能力的组织中通过功能性反应来鉴定诱导因子或其上游调控分子的研究。

在将mRNA注射到卵母细胞中后，检测反应性动物帽组织中相关基因的表达情况 otx2 由 原位 杂交图2 和 表1); otx2 在神经管闭合至晶状体基板增厚期间，于预定晶状体外胚层（PLE）中表达19。然而，由于 otx2 也在前部神经外胚层以及位于 PLE 之外的非神经头部外胚层中表达，因此与神经和生基板反应均相关。使用 foxe3 筛选文库以获得能够在晶状体具备感应能力的动物帽外胚层中产生晶状体诱导反应的基因产物，使得表达克隆的目标实现更为特异的方法成为可能，因为 foxe3 从神经板阶段开始，在晶状体板（PLE）中表达，并持续贯穿晶状体泡形成过程20，存在于相邻的 placodal 区域，但在神经外胚层中缺失。利用上述表达克隆和同胞选择方案，并注射文库转录本的混合物，可鉴定出一个能够产生该表型的基因 foxe3 动物帽中的表达被分离（表 2</str...

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

鉴定负责胚胎诱导的基因面临诸多挑战；例如，感兴趣的分泌分子可能含量较低……

本实验的总体目标是展示一种适用于鉴定能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因产物的非洲爪蟾卵母细胞与动物帽系统。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如哪些基因对于引发诱导性反应是必需的。该技术的主要优势在于利用非洲爪蟾卵母细胞作为表达系统，用于产生并鉴定作用于靶组织的诱导因子，甚至可鉴定作用于诱导因子上游的基因。该方法的可视化演示极为重要，因为解剖和重组步骤高度依赖于发育阶段，且需要精细的操作技术。从麻醉的雌性青蛙中采集卵巢组织后，将组织撕成小块，每块包含约10至20个卵母细胞。然后将这些组织片段依次转移至新鲜的OR2溶液中，再转移至含有2.0毫克/毫升胶原酶A的OR2溶液中。随后将含有组织的混合液置于摇床上，轻轻振荡处理一小时。然后将组织碎片转移至新鲜的胶原酶溶液中，继续振荡处理1小时。此步骤结束时应观察到分散的卵母细胞。随后用完全OR2溶液洗涤卵母细胞10次，再用卵母细胞培养基（简称OCM）洗涤2次。随后，将卵母细胞置于新鲜的OCM中，并在解剖显微镜下进行肉眼观察。通过剔除较小的未成熟卵母细胞，分离出处于第六阶段的卵母细胞。接着，将卵母细胞放入含有OCM的琼脂糖包被培养皿中，并在18至20摄氏度条件下保存，直至进行注射。为进行显微注射做准备，将玻璃毛细管放入拉针仪中，拉制后折断尖端，制成直径约为20微米的注射针。在复式显微镜下，使用校准的目镜测微尺测量针尖尺寸。接着，将黏土均匀铺在35毫米×10毫米的培养皿底部形成一层。然后使用类似探针的工具在此层中制作平行的沟槽。用约2毫升含3% Ficoll的1x改良巴特氏生理盐水（MBS）填充衬有黏土的培养皿，再用宽口移液管将卵母细胞转移至其中。将卵母细胞置于凹槽中，以便在后续显微注射过程中固定其位置。使用显微注射仪，用约两微升预先制备的 mRNA 混合液充满注射针，并调节平衡以产生轻微正压，防止注射过程中卵母细胞胞质被吸入针内。随后，在卵母细胞的赤道区域注射 20 纳升 RNA。随后，将卵母细胞置于 Ficoll MBS 中孵育一小时，然后轻轻转移至 1x MBS 中。在 20 摄氏度下继续孵育卵母细胞 8 至 24 小时。开始动物帽实验前，准备 3/4x 正常两栖类培养液（简称 NAM 溶液）、精细镊子、毛环、先前已注射的卵母细胞以及处于 11 至 11.5 期的非洲爪蟾胚胎。然后，将玻璃盖玻片破碎成大小约为1毫米×2毫米的碎片，并将这些碎片通过火焰灼烧，直至其边缘熔融变圆滑。接着，如前所述，将黏土压入培养皿中形成单层。并使用细小探针在此涂层上制作出单个杯状凹痕。继续向培养皿中加入约两毫升的3/4x NAM。然后将已注射的卵母细胞转移至其中，放置数个卵母细胞，使每个卵母细胞固定于一个凹陷内。为准备胚胎，将其转移至含有3/4x NAM溶液的培养皿中。选取部分原肠胚作为外胚层年龄的对照样本，并将其转移至另一含有相同溶液的培养皿中，将该培养皿置于一旁备用。对于将用于动物极帽实验的胚胎，使用两对精细镊子去除其卵黄膜。随后，将原肠胚转移至盛有卵母细胞的铺有黏土的培养皿中。首先，使用两把精细镊子从胚胎上切下动物极帽，注意避免损伤赤道区域组织。采用第一种方法生成重组体时，将动物极帽放置在已置于凹陷处的卵母细胞的动物极半球上，使其内表面与卵母细胞的动物极半球接触。对多个已注射的卵母细胞重复此操作。为确保这些重组体保持结合状态，在每个重组体上放置一片弯曲的玻璃盖玻片碎片，并施加向下的压力，直至动物极变平且盖玻片接触到黏土。若采用第二种方法生成重组体，可将动物帽和卵母细胞共同置于黏土中单独的凹陷处。确保动物极帽的内表面朝向卵母细胞。然后，使用少量黏土延伸部分将两种组织固定在一起。一旦通过任一方法生成了多个重组体，将它们与预留的对照胚胎一同在20摄氏度下培养。当对照胚胎达到所需阶段时，从重组胚胎上取下盖玻片，并使用镊子和毛发环分离动物极帽外胚层。随后将外胚层组织片段和对照胚胎均在MEMFA中固定一小时。然后将它们转移至乙醇中，并于-20摄氏度保存该组织。在此实验中，将一系列卵母细胞分别注射含有逐渐减少数量的克隆或菌落对应的mRNA混合物，然后与动物帽共同培养。随后，检测每组中表达foxe3的动物帽数量，foxe3是一种通常在从早期神经板阶段到囊泡形成期间的预定晶状体外胚层中观察到的标记基因，在本实验中用于评估晶状体诱导能力。该方法鉴定出一个编码核因子的基因ldb1，其可在179个被评估的动物帽中的50个（即28%）中产生晶状体诱导反应。此处展示的是我们的原位杂交图像，显示了从大约 11 期到 23 期在与注射了 ldb1 的卵母细胞共培养的动物帽中，由箭头指示的 foxe3 信号。在放置于未注射卵母细胞上的相应对照动物帽中，未观察到 foxe3 表达。当对这些动物帽进行切片时，可在内层和外层外胚层中均检测到 foxe3 的表达。内层的表达是晶状体反应的特征。或者，若在两层中均有信号，则提示可能存在嗅板等其他结构。完成此操作后，可对动物帽外胚层进行免疫组织化学、原位杂交或荧光报告基因的直接检测等方法，以评估其诱导反应。

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