Name: 汞（II）与Dicysteinyl四肽的络合的电喷雾质谱研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 了解电喷雾轨道阱质谱法表征汞(II)与双半胱氨酰四肽形成的配合物。该方法可分析金属离子配合物且碎片极少，为设计汞离子螯合剂提供依据。

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M.N-S 感谢美国国家科学基金会 RUI 项目 CHE 1011859 提供的支持。作者谨此感谢北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校 Triad 质谱中心提供 Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL 质谱仪的使用机会。作者感谢北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校的 Daniel Todd、Vincent Sica 和 Brandie Erhmann 对本研究提出的宝贵建议与意见。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。氯化汞为有毒化学品，操作该物质及其相关溶液时必须佩戴个人防护装备（手套、安全护目镜和实验服）。含重金属的废液应弃置于明确标记的、专用于重金属的化学废液瓶中。
1. 制备 5 mM 脱气甲酸铵缓冲液，pH 7.5
<ol>
	<li>将0.1576 g甲酸铵缓冲剂溶解于450 ml高效液相色谱级水中。用1 M甲酸和1 M氢氧化铵将上述溶液的pH值调节至7.5。将该溶液转移至500 ml容量瓶中，并加高效液相色谱级水至刻度线，配制成5 mM甲酸铵溶液。</li>
	<li>将5 mM甲酸铵缓冲液在真空系统下脱气10分钟，并用氩气吹扫。重复两次后，在氩气保护下储存。使用当天，使用前需经0.2微米滤膜过滤缓冲液。</li>
</ol>
2. 氯化汞(II)溶液的配制
<ol>
	<li>称取 0.2375 g 氯化汞(II)。将其溶解于 25 ml 5 mM 甲酸铵缓冲液中，配制成 0.035 M 的氯化汞(II) 溶液。</li>
	<li>取 0.214 ml 0.035 M 氯化汞(II) 溶液加入到 9.785 ml 5 mM 甲酸铵缓冲液中，配制成 7.5 × 10-4 M 的溶液。用氩气对 7.5 × 10-4 M 氯化汞(II) 溶液进行惰性气体保护。</li>
</ol>
3. CGGC 储备液的制备
<ol>
	<li>将2.0 mg的双半胱氨酰四肽CGGC溶解于0.118 ml的HPLC级乙腈中，然后加入1.0647 ml已用氩气脱气的5 mM甲酸铵缓冲液（pH 7.5），配制成5 mM的CGGC储备液。</li>
	<li>取225 µl的5 mM CGGC储备液加入到1,275 µl的5 mM甲酸铵缓冲液（pH 7.5）中，得到浓度为7.5 × 10-4 M的CGGC溶液。</li>
</ol>
4. 汞(II)与CGGC各种反应混合物的制备
<ol>
	<li>制备汞(II):CGGC 摩尔比为 1:0.5 的溶液
	<ol>
		<li>取 255 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5），加入 1.5 ml 微离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微离心管中加入 30 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微离心管中加入 15 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的 CGGC 溶液。再次涡旋混合 10 秒。将溶液静置 10 分钟&#160;，然后注入质谱仪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备汞(II):CGGC 摩尔比为 1:1 的溶液
	<ol>
		<li>取 240 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5），加入 1.5 ml 微离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微离心管中加入 30 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微离心管中加入 30 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的 CGGC 溶液。其余操作参照第 4.1 节所述方法进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备汞(II):CGGC 摩尔比为 1:2 的溶液
	<ol>
		<li>取 210 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5），加入 1.5 ml 微离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微离心管中加入 30 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微离心管中加入 60 µl 浓度为 7.5 × 10-4 M 的 CGGC 溶液。其余操作参照第 4.1 节所述方法进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. CEEC 储备液的制备
<ol>
	<li>将3.5 mg双半胱氨酰四肽CEE C溶解于0.145 ml HPLC级乙腈中以溶解肽。然后加入13.067 ml已用氩气脱气的5 mM甲酸铵缓冲液（pH 7.5），制备成0.5 mM CEEC溶液。</li>
	<li>涡旋振荡溶液直至肽完全溶解。取1.125 ml 0.5 mM CEEC溶液和0.375 ml 5 mM甲酸铵缓冲液（pH 7.5），加入1.5 ml微量离心管中，得到7.5 × 10-5 M CEEC溶液。涡旋振荡至混合均匀。</li>
</ol>
6. 汞(II)与CEEC溶液各种反应混合物的制备
<ol>
	<li>制备汞(II):CEEC 摩尔比为 1:0.5 的溶液
	<ol>
		<li>将 255 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5）加入一个 1.5 ml 微量离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中加入 30 µl 的 7.5 × 10-4 M 氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微量离心管中加入 15 µl 的 7.5 × 10-4 M CEEC 溶液。操作方式参照第 4.1 节所述方法进行重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备汞(II):CEEC 摩尔比为 1:1 的溶液
	<ol>
		<li>将 240 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5）加入一个 1.5 ml 微量离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中加入 30 µl 的 7.5 × 10-4 M 氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微量离心管中加入 30 µl 的 7.5 × 10-4 M CEEC 溶液。操作方式参照第 4.1 节所述方法进行重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备汞(II):CEEC 摩尔比为 1:2 的溶液
	<ol>
		<li>将 210 µl 的 5 mM 甲酸铵缓冲液（pH 7.5）加入一个 1.5 ml 微量离心管中。向含有甲酸铵缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中加入 30 µl 的 7.5 × 10-4 M 氯化汞(II)溶液。</li>
		<li>涡旋混合溶液 10 秒。然后向该 1.5 ml 微量离心管中加入 60 µl 的 7.5 × 10-4 M CEEC 溶液。操作方式参照第 4.1 节所述方法进行重复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用轨道阱电喷雾电离质谱法分析汞(II)与CGGC样品的反应混合物
<ol>
	<li>准备电喷雾电离质谱仪16
	<ol>
		<li>将100 µl校准标准品吸入500 µl玻璃注射器中。</li>
		<li>将注射器放入质谱泵的注射器支架中，连接管路，并将样品注入质谱仪。</li>
		<li>通过选择文件图标并输入文件名，设置运行的文件名称。</li>
		<li>在数据采集模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。</li>
		<li>通过打开软件的数据处理模块分析色谱图，以验证校准标准品。打开该模块，进入文件菜单并选择 &#34;打开&#34;，在对话框中选择相应文件。确认色谱图中的峰与标准品的质荷比相对应。</li>
		<li>通过吸入500 µl HPLC级甲醇，然后将甲醇排入烧杯，清洗500 µl玻璃注射器。</li>
		<li>将500 µl HPLC级甲醇吸入玻璃注射器中，并按照步骤7.1.2冲洗系统。</li>
		<li>选择软件中的方法设置模块以设定参数。进入扫描模式菜单，将分析器设为FTMS，然后点击 &#34;确定&#34;。随后在实时谱图页面点击各个图标，设置以下参数：鞘气流速：10，离子源温度：0，毛细管电压：37 V，管透镜电压：95 V，喷雾电压：4.20 kV，流速：10.00 µl/min，分析器：FTMS，扫描次数：150。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在电喷雾电离质谱仪上运行CGGC样品
	<ol>
		<li>运行5 mM甲酸铵缓冲液（pH 7.5）
		<ol>
			<li>将500 µl 5 mM甲酸铵缓冲液加入500 µl玻璃注射器中，放入质谱泵的注射器支架中，并连接管路。</li>
			<li>使缓冲液通过管路运行1-2分钟。</li>
			<li>通过选择文件图标并输入文件名，设置运行的文件名称。</li>
			<li>在模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。</li>
			<li>收集完150次扫描后，点击运行按钮停止采集。</li>
			<li>打开数据浏览器模块，进入文件菜单并选择 &#34;打开&#34;，在对话框中选择相应文件。确认色谱图中不存在与肽段或汞(II)-肽复合物相对应的483、683、1,163和1,363 m/z处的峰。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>运行汞(II):CGGC比例为1:0.5的溶液
		<ol>
			<li>将250 µl 汞(II):CGGC比例为1:0.5的样品加入注射器中。</li>
			<li>将注射器放入质谱泵的注射器支架中，连接管路，并对装置进行预冲洗。</li>
			<li>通过选择文件图标并输入文件名，为本次运行设置文件名。</li>
			<li>在数据采集模块中按下“采集数据”按钮，收集150次扫描，并点击运行按钮以停止采集。</li>
			<li>打开模块，进入文件菜单并选择 &#34;打开&#34;，在对话框中选择相应文件。确认色谱图中包含CGGC肽单独存在的峰。</li>
			<li>用500 µl甲酸铵缓冲液吸取并清洗注射器，然后将缓冲液排入烧杯。</li>
			<li>在质谱仪上选择废液按钮，并用500 µl甲酸铵缓冲液冲洗管路三次。</li>
			<li>用500 µl甲醇吸取并清洗注射器，然后将甲醇排入烧杯。</li>
			<li>用500 µl甲醇冲洗管路一次。</li>
			<li>在质谱仪上选择“加载检测器”按钮。</li>
			<li>向注射器中加入500 µl甲酸铵缓冲液。</li>
			<li>将注射器放入质谱泵的注射器支架中，连接管路，并对装置进行预冲洗。</li>
			<li>通过选择文件图标并输入文件名，为缓冲液运行设置文件名。</li>
			<li>按下“采集数据”按钮，收集150次扫描，然后点击“停止运行”按钮。</li>
			<li>打开数据浏览器模块，进入文件菜单并选择 &#34;打开&#34;，在对话框中选择相应文件。确认色谱图中无前一次Hg:CGGC运行的峰残留。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>运行汞(II):CGGC比例为1:1的溶液
		<ol>
			<li>将250 µl 汞(II):CGGC比例为1:1的样品加入注射器中。</li>
			<li>参照步骤7.2.2.2至7.2.2.15所述方法，以类似方式重复操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>运行汞(II):CGGC比例为1:2的溶液
		<ol>
			<li>将250 µl 汞(II):CGGC浓度为1:2的样品加入注射器中。</li>
			<li>参照步骤7.2.2.2至7.2.2.15所述方法，以类似方式重复操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 采用轨道阱电喷雾电离质谱分析汞和CEEC样品的反应混合物
<ol>
	<li>在电喷雾电离质谱仪上分析CEEC样品
	<ol>
		<li>使用CEEC样品以及不同化学计量比的汞(II)与CEEC反应混合物，重复分析步骤（步骤7.1至7.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clifton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury+exposure+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Mercury exposure and public health.</a> Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).</li>
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<li>Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+heavy+metals+by+newer%2C+therapeutically+useful+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents.</a> Toxicology. 97, 23-38 (1995).</li>
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<li>Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evalution+of+the+association+of+mercury+%28II%29+with+some+dicysteinyl+tripeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides.</a> Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).</li>
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<li>D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrospray+Mass+Spectrometric+Study+of+Organomercury+%28II%29+and+Mercuric+Interactions+with+Peptides+Involving+Cysteinyl+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands.</a> Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).</li>
<li>Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+ESI-MS+in+drug+discovery%3A+interrogation+of+noncovalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).</li>
<li>Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+Homo-+and+Heterodimeric+Mercury+%28II%29-bis-thiolates+of+Some+Biologically+Relevant+Thiols+by+Electrospray+Ionization+and+Triple+Quadruple+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).</li>
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<li>Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestering+ability+of+some+chelating+agents+towards+methylmercury%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II).</a> Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).</li>
<li>Mah, V., Jalilehvand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+Complex+Formation+with+Mercury%28II%29+in+Aqueous+Solution+at+Physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH.</a> Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).</li>
</ol>

本工作无任何披露事项。

疏水性双半胱氨酸四肽 CGGC（C10H18N4O5S2；分子量 = 338）（图1）可与汞(II)形成络合物，如图2和表1所示。此外，随着反应体系中肽含量的增加，该肽会逐步形成二聚体和三聚体。根据相应二聚体的质荷比（m/z）值[(2M+H)+ = 677]和三聚体的质荷比值[(3M+H)+ = 1015]可知，在实验条件下，CGGC的巯基未发生氧化形成二硫键。这些CGGC缔合物的形成可能与该四肽的疏水性有关。CGGC可形成两种类型的汞络合物，分别对应于1:1的汞(II):肽和1:2的汞(II):(肽)2络合物，这与先前报道的双半胱氨酸三肽的情况类似7。然而，在汞(II)过量或等摩尔存在时，还会形成一种2:2的[汞(II)]2:(肽)2络合物。
<p class="jove_content"...

目前用于汞中毒螯合治疗的临床药物1 含有巯基，该基团负责结合并螯合汞离子2,3然而，研究表明，这些小分子硫醇化合物［二巯基丁二酸（DMSA）和二巯基丙磺酸（DMPS）］并非汞螯合治疗的理想选择。4-6因此，有必要深入了解汞与硫醇之间的相互作用及复合物形成倾向，以促进用于汞螯合的硫醇类化合物的合理药物设计。最近，我们报道了 n-烷基和芳基双半胱氨酰三肽含有二硫醇基团，可作为有效的“双锚点”，占据汞(II)的配位位点，形成1:1的汞(II):肽和1:2的汞(II):(肽)配合物2 复合物7此外，我们研究了增加半胱氨酰残基对复合物类型形成的影响8本研究探讨了汞(II)与两种双半胱氨酰四肽的结合特性，其中半胱氨酰残基之间间隔两个氨基酸残基。为了评估辅助结合基团对汞结合的影响，中间的氨基酸残基分别为两个甘氨酸（未取代）残基或两个谷氨酸（γ-羧基化）残基。 
半胱氨酰肽与汞(II)的反应需要在防止半胱氨酰巯基氧化形成二硫键的条件下进行9。此外，汞(II)与半胱氨酰肽结合形成各类汞-肽复合物的过程依赖于反应体系中汞(II)与肽的初始摩尔比7,8。这些反应体系中形成的汞-肽复合物类型可通过软电离质谱法进行分析，该方法是一种用于确定金属离子与肽之间相互作用的高灵敏度分析工具10-14。因此，该方法可在特定的电喷雾电离条件下，提供所形成的各类汞化肽加合物的分布图谱。本文将介绍如何在经氩气保护的脱气甲酸铵缓冲溶液中配制半胱氨酰肽和氯化汞(II)溶液，以最大限度减少氧化。通过使不同摩尔当量的汞(II)与双半胱氨酰四肽反应，我们将展示初始汞(II):肽摩尔比对所形成复合物类型的影响。我们还将说明如何利用电喷雾电离（ESI）质谱法作为表征工具，准确测定复合物中汞与肽的化学计量比。配套的视频实验方案将演示制备汞复合物的实验条件、在特定电喷雾电离条件下分析反应混合物的操作流程，以及利用ChemCal程序根据汞同位素分布特征对汞(II)-双半胱氨酰四肽复合物的化学计量比进行表征15。本方法旨在帮助有意使用ESI轨道阱质谱法分析具有多种同位素形态的金属离子所形成各类复合物的研究人员。

<table><tbody><tr><td>氯化汞(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级水</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级乙腈</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级甲醇</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

汞(ii)与双半胱氨酰四肽络合物的电喷雾电离质谱研究

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

本研究评估了一种利用电喷雾电离轨道阱质谱法对汞(II)与双半胱氨酸四肽在不同相对比例下形成的复合物进行表征的方法。该策略基于先前利用质谱及其他技术成功表征汞-双半胱氨酸三肽复合物的研究。将氯化汞(II)与双半胱氨酸四肽在脱气缓冲体系中以不同的化学计量比孵育，随后在配备混合线性离子阱与轨道阱质量分析器的电喷雾质谱仪上分析所形成的复合物。电喷雾电离质谱（ESI-MS）谱图在正离子模式下采集，通过分析各峰所对应的特征性汞同位素分布模式及其相应的单同位素峰进行鉴定。本工作表明，在特定电喷雾电离条件下形成的汞-肽复合物中汞与肽的准确化学计量比，可通过高分辨ESI-MS结合特征性汞同位素分布模式予以确定。

本研究通过电喷雾电离质谱法（ESI质谱）对两种四肽CGGC和CEEC可能形成的汞-肽复合物组成进行了表征（图1）。通过将汞(II)溶液与肽溶液按三种不同摩尔比（1:0.5、1:1 和 1:2（汞(II):肽））混合反应，研究了汞(II)与CGGC或CEEC形成的复合物。汞(II)的浓度为7.5 × 10-6 M，肽的浓度相应变化。
<img alt="肽结构：Cys-Gly-Gly-Cys (CGGC) 和 Cys-Glu-Glu-Cys (CEEC) 的化学结构图。" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 双半胱氨酰肽结构。 双半胱氨酰四肽 CGGC 和 CEEC 的...

本文介绍了通过电喷雾电离轨道阱质谱法对汞(II)与双半胱氨酸四肽在不同相对比例下形成的配合物进行表征。

汞(II)与双半胱氨酰四肽络合物的电喷雾电离质谱研究

在本研究中，我们评估了一种用于表征汞(II)与双半胱氨酰四肽在不同相对比例下形成的复合物的方法，……

本实验的总体目标是在不同反应化学计量比条件下制备汞与双半胱氨酸肽的络合物，并通过电喷雾电离轨道阱质谱法对形成的各类络合物进行表征。该方法有助于解答关于汞与巯基化合物络合倾向性的关键问题，从而推动针对汞离子螯合剂的理性设计。该技术的主要优势在于能够实现金属离子络合物的分析，且几乎不发生碎片化。其他优点包括独特的汞同位素分布模式。通过串联质谱法可轻松确定电荷并分析重叠峰。尽管该方法可用于研究汞-肽复合物，但也适用于其他复合物，特别是具有不同同位素形式的金属离子。在真空系统下对5 mM甲酸铵缓冲液脱气10分钟，并用氩气吹扫。重复两次后，将溶液保存在氩气环境中。使用当天，使用前需经0.2微米滤膜过滤缓冲液。配制氯化汞溶液时，称取0.2375克氯化汞，溶于25毫升5毫摩尔甲酸铵缓冲液中，得到0.035摩尔的氯化汞溶液。取0.214毫升该氯化汞溶液加入9.785毫升5毫摩尔甲酸铵缓冲液中，配制成0.75毫摩尔的溶液。用氩气覆盖所得溶液。接着，将225微升5毫摩尔的CGGC储备溶液加入1.275毫升pH 7.5的5毫摩尔甲酸铵缓冲液中，配制成0.75毫摩尔的CGGC溶液。然后，通过将255微升pH 7.5的5毫摩尔甲酸铵缓冲液加入1.5毫升微量离心管中，制备汞与CGGC溶液比例为1:0.5的混合液。然后，向试管中加入 30 微升 0.75 毫摩尔的氯化汞溶液。涡旋振荡溶液 10 秒。接着，向试管中加入 15 微升 0.75 毫摩尔的 CGGC 溶液。再次涡旋溶液10秒，然后在注入质谱仪之前让溶液静置10分钟。准备电喷雾电离质谱仪（ESI-MS）时，用500 µL玻璃注射器吸取100 µL校准标准品，并将注射器放入质谱仪泵的注射器支架中。连接管路，并将样品注入质谱仪。通过点击文件图标并输入文件名来设置运行的文件名称。在数据采集模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。打开软件的数据处理模块，分析色谱图以验证校准标准品。然后进入文件菜单，选择打开，并在对话框中选择相应文件。确认色谱图中的峰与标准品的质荷比相对应。使用500微升的玻璃注射器吸取500微升HPLC级甲醇，然后将其排入烧杯中，以清洗注射器。用玻璃注射器吸取500微升HPLC级甲醇，并冲洗系统。选择软件中的方法设置模块以设定参数。选择扫描模式菜单，找到分析器 FTMS，然后点击确定。接下来，依次点击实时视图光谱页面上的各个图标，按照文本方案中详述的参数进行设置。运行缓冲液时，将 500 微升的 5 毫摩尔甲酸铵缓冲液注入 500 微升玻璃注射器中。将其放入质谱泵的注射器支架中，并断开管路。让缓冲液流经管路一到两分钟。通过选择文件图标并输入文件名，设置运行所需的文件名。在模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。采集完150次扫描后，点击“停止运行”按钮以停止采集。接下来，打开数据浏览器模块，进入文件菜单并选择

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