汞(II)与双半胱氨酰四肽络合物的电喷雾电离质谱研究

本实验的总体目标是在不同的反应化学计量条件下制备汞与双半胱氨酸肽的复合物，并利用电喷雾电离轨道阱质谱法对所形成的各类复合物进行表征。该方法有助于解答有关汞与巯基化合物络合倾向的关键问题，从而推动针对汞离子螯合剂的理性设计。该技术的主要优势在于能够实现金属离子复合物的分析，且几乎不发生碎片化。

其他优点包括独特的汞同位素分布模式。通过串联质谱法可轻松确定电荷并分析重叠峰。尽管该方法可用于研究汞-肽复合物，但也适用于其他复合物，特别是具有不同同位素形态的金属离子。

在真空系统下对5 mM甲酸铵缓冲液脱气10分钟，并用氩气吹扫。重复两次后，将溶液保存在氩气环境中。使用当天，使用前经0.2微米滤膜过滤缓冲液。

配制氯化汞溶液时，称取0.2375克氯化汞，溶于25毫升5毫摩尔的甲酸铵缓冲液中，得到0.035摩尔的氯化汞溶液。取0.214毫升该氯化汞溶液加入9.785毫升5毫摩尔的甲酸铵缓冲液中，配制成0.75毫摩尔的溶液。

用氩气覆盖所得溶液。接着，将225微升5毫摩尔的CGGC储备溶液加入1.275毫升pH 7.5的5毫摩尔甲酸铵缓冲液中，配制成0.75毫摩尔的CGGC溶液。然后，通过将255微升pH 7.5的5毫摩尔甲酸铵缓冲液加入1.5毫升微量离心管中，制备汞与CGGC溶液1:0.5的比例体系。

然后，向试管中加入 30 微升 0.75 毫摩尔的氯化汞溶液。涡旋振荡溶液 10 秒。接着，向试管中加入 15 微升 0.75 毫摩尔的 CGGC 溶液。

再次涡旋溶液10秒，然后在注入质谱仪之前让溶液静置10分钟。准备电喷雾电离质谱仪（ESI-MS）时，用500 µL玻璃注射器吸取100 µL校准标准品，并将注射器放入质谱仪泵的注射器支架中。

连接管路，并将样品注入质谱仪。通过点击文件图标并输入文件名来设置运行的文件名称。在数据采集模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。

打开软件的数据处理模块，分析色谱图以验证校准标准品。然后进入文件菜单，选择打开，并在对话框中选择相应文件。确认色谱图中的峰与标准品的质荷比相对应。

使用500微升的玻璃注射器吸取500微升HPLC级甲醇，然后将其排入烧杯中，以清洗注射器。用玻璃注射器吸取500微升HPLC级甲醇，并冲洗系统。选择软件中的方法设置模块以设定参数。

选择扫描模式菜单，找到分析器 FTMS，然后点击确定。接下来，依次点击实时视图光谱页面上的各个图标，按照文本方案中详述的参数进行设置。运行缓冲液时，将 500 微升的 5 毫摩尔甲酸铵缓冲液注入 500 微升玻璃注射器中。

将其放入质谱泵的注射器支架中，并拆下管路。让缓冲液流经管路一到两分钟。通过选择文件图标并输入文件名来设置运行文件的名称。

在模块中选择“采集数据”按钮，收集150次扫描。采集完150次扫描后，点击“停止运行”按钮以停止采集。接下来，打开数据浏览器模块，进入文件菜单并选择“打开”，然后在对话框中选择相应文件。

确认在质荷比为 483、683、1163 和 1363 处不存在与肽段或汞离子-肽段复合物相似的峰。通过将 250 微升样品注入注射器中，运行汞与 CGGC 摩尔比为 1 至 0.5 的溶液。将注射器放入质谱泵的注射器支架中。

连接管路并启动装置。采集150次数据扫描后，打开浏览器模块，进入文件菜单并选择打开。然后在对话框中选择文件。

确认色谱图中包含各组分的峰，其中包括单独的 CGGC 肽峰。该实验步骤的关键在于确保每次分析反应混合物之前，前一次运行的分析物已完全清除。通过彻底清洗进样管线，可有效减少残留分析物带来的样品污染。

用500微升甲酸铵缓冲液抽吸并冲洗注射器，然后将缓冲液排入烧杯中。接着，在质谱仪上选择废液按钮，用500微升甲酸铵缓冲液冲洗管路三次。进一步清洗注射器，抽吸500微升甲醇并排入烧杯中。

用 500 微升甲醇冲洗管路一次。然后，在质谱仪上选择加载检测器按钮。向注射器中加入 500 微升甲酸铵缓冲液后，将注射器放入质谱仪泵的注射器支架中。连接管路，并对装置进行预冲洗。

像之前一样为缓冲运行选择一个文件名，并在单击停止运行按钮前采集150次扫描。打开数据浏览器模块，确认色谱图中无上一次汞至CGGC运行的峰。对剩余的CGGC样品重复分析过程。

为制备汞与CEEC溶液1:0.5的摩尔比，取255微升5毫摩尔的甲酸铵缓冲液（pH 7.5），加入1.5毫升微量离心管中。向管中加入30微升0.75毫摩尔的氯化汞溶液。涡旋振荡溶液10秒后，再向管中加入15微升0.75毫摩尔的CEEC溶液。

将溶液再涡旋10秒，并在质谱仪进样前静置10分钟。使用CEEC样品以及汞离子与CEEC的反应混合物重复分析过程。

图中显示了一个典型的质谱图。在汞与CGGC摩尔比为1:0.5的反应混合物中，反应10分钟后可观察到多种汞-肽复合物，同时可见分子量为339.08的肽峰以及分子量为677.15的肽二聚体峰。与先前的质谱图观察结果一致，汞与CGGC摩尔比为1:1的反应混合物中也含有部分相似的峰。

例如，质荷比 539.03 处的峰代表汞与肽的一比一复合物。放大视图显示了对应于七种主要天然汞同位素的特征性汞同位素分布模式。此外，还观察到一比二的汞与 CGGC 复合物，这与先前报道的汞-双半胱氨酸三肽的结果一致。

该复合物出现在所有三种汞与CGGC的反应混合物中。通过独特的汞同位素分布模式可轻松对其进行分析，其单一同位素峰位于877。然而，当汞过量时，例如在汞与CGGC为1:0.5的反应混合物中，会检测到额外的二汞与CGGC复合物。

该汞同位素特征对应于通过 chem cal 程序计算得到的两种汞复合物。理论质子化单一同位素质量对应的质荷比为 1077，即在观测到的同位素簇中为第九个峰。图中展示了一个显示多种汞与 CEEC 复合物的代表性谱图。

值得注意的是，在正一价态下，与汞相关的 CEEC 加合物出现重叠峰，其单同位素峰位于 883；而在正二价态下，计算得到的单同位素峰值为 1765。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时之内完成。

在进行该实验操作时，务必记住要对缓冲液进行脱气，并彻底冲洗管路，以避免分析物的交叉污染。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如质子、碳-13和汞-199核磁共振波谱法或电位滴定法，以更准确地确定溶液中配合物的组成。观看本视频后，您应能够利用电喷雾电离轨道阱质谱法分析多种汞配合物及其独特的汞同位素分布模式和电荷形态，并通过串联质谱分析区分重叠的质谱峰。

请注意，操作汞溶液可能具有极高危险性，进行此实验时必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。