Name: 一个行为分析对机械感觉MARCM为基础的克隆果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学习利用MARCM方法在果蝇中进行机械感觉行为分析，通过镶嵌筛选技术识别致死性机械敏感突变。该方法有助于揭示感觉神经生物学中的关键基因功能。

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作者谨此感谢布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington stock center）、Liqun Luo、Charles Zuker 以及 Lily 和 Yuh Nung Jan 慷慨提供果蝇品系，同时感谢以下机构对本研究的资金支持：SOMAS-URM（资助 JD 和 SW）、Bachelor Ford 教师暑期研究奖学金（资助 SW）、BD 公司暑期研究奖学金（资助 CL 和 DL）、Renee 和 Anthony M. Marlon 医学博士 '63 暑期研究奖学金（资助 DL）、James C. '75 与 Jane Colihan 暑期研究奖学金（资助 TO），上述后三项资助均来自圣十字学院校友/家长暑期研究基金，以及 Stransky 基金会暑期研究奖学金（资助 TO）。特别感谢圣十字学院生物学系及院长办公室对实验室全部工作的支持。

1. 构建 MARCM 果蝇的杂交实验
<ol>
	<li>将果蝇饲养在玉米粉糖浆培养基（6.5 g/L 琼脂；23.5 g/L 酵母；60 g/L 玉米粉；60 ml/L 糖浆；4 ml/L 酸混合物；0.13% Tegosept）或标准 Drosophila 培养基中，置于 22 摄氏度、12 小时光照/12 小时黑暗的条件下。 
	注意：使用低于标准的温度有助于维持 MARCM 品系的健康状态。这将使卵至成虫的发育时间延长至 14 天。</li>
	<li>使用 MARCM 准备就绪品系中的处女雌蝇（约 1–8 日龄），该品系包含必要的遗传元件（由上游激活序列控制的 GFP（UAS-GFP）、Gal80 抑制蛋白、Gal4 转录因子、热激启动的重组酶以及 FRT 重组位点）。 
	注意：我们的 MARCM 准备就绪品系包含以下基因型：elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80/CyO; tubGal4/TM3Sb。 
	注意：具体的 FRT 位点取决于突变在基因组中的位置。例如，FRT40A 用于检测位于第 2 染色体左臂的突变，如 NOMPC（有关 MARCM 实验方案的更多细节，请参见10）。</li>
	<li>将 MARCM 准备就绪的处女雌蝇与携带目标突变及其对应 FRT 位点的雄蝇（例如，w-; NOMPC3, FRT40A/CyO; +/+）杂交。为控制 MARCM 有效诱导，设置第二组杂交，使用携带相同 FRT 位点但无突变的雄蝇作为对照。杂交时雌雄比例约为 5:1。</li>
</ol>
2. 定时产卵
<ol>
	<li>让果蝇交配至少一个晚上后，将成虫转移至装有新鲜培养基的新试管中。在黑暗环境中让果蝇产卵约4小时，然后再次将果蝇转移到新的试管中。记录产卵期的开始和结束时间。 
	注意：若在4小时间隔结束前培养基上已有大量卵，可采用更短的时间间隔。
	<ol>
		<li>保留含有足够数量卵的试管（大约多于20个），并在22摄氏度、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养，以备后续进行热激处理。 
		注意：培养基上卵的数量较少（大约少于20个）的试管，通常难以获得足够数量的成虫用于行为学测试；为提高效率，建议不再保留这些试管进行后续实验。 
		注意：我们的果蝇在每天上午8点至晚上8点期间保持光照。我们发现傍晚时段产卵密度更高，因此通常在下午4点至8点以及晚上8点至午夜之间进行定时交配。果蝇在室温&#160;下于黑暗柜中产卵，次日再放回培养箱，以避免干扰培养箱内正常的光-暗循环。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 实施热激以诱导有丝分裂重组
<ol>
	<li>在卵孵化后约 85 - 100 小时，将试管放入 37 摄氏度的水浴中 1 小时。确保水位高于试管内培养基的高度，但不要完全浸没试管，以防止幼虫溺亡。</li>
	<li>从水浴中取出试管，在室温下恢复 1 小时。</li>
	<li>将试管再次放入 37 摄氏度的水浴中 1 小时。</li>
	<li>从水浴中取出试管，转移至 22 摄氏度、12 小时光照/12 小时黑暗循环的培养箱中，直至成虫羽化。</li>
</ol>
4. 行为学测试的准备工作
<ol>
	<li>羽化后，将果蝇置于冰上进行麻醉。根据亲本品系中使用的可见表型标记，挑选基因型包含MARCM所需全部遗传元件的果蝇，此类果蝇中应可观察到GFP表达标记的克隆。使用虹膜剪将果蝇去头。 
	注意：例如，我们选择不携带CyO（卷翅）和Sb（短硬毛）遗传标记的果蝇，以鉴定出含有生成GFP标记嵌合区域所需全部遗传元件的个体。 
	注意：去头操作是必要的，以防止成虫在受到刺激时飞走。</li>
	<li>将去头后的果蝇置于密闭湿润环境中，恢复约10–20小时。仅使用在受到扰动后能够自行恢复直立姿态的果蝇进行后续实验。在去头后30小时内完成果蝇的测试。</li>
</ol>
5. 行为学测试
<ol>
	<li>在荧光解剖显微镜下观察无头果蝇，识别在刚毛外部感觉器官处以GFP标记的纯合克隆。记录刚毛名称及其位于左侧或右侧。为消除潜在偏差，进行刚毛刺激的实验人员应对刚毛的基因型（野生型或突变型）保持盲态。</li>
	<li>使用硬毛或精细镊子将标记有GFP的刚毛向果蝇身体方向偏转，以诱发梳理反射，并观察其腿部反应。若果蝇在刚毛刺激后抬起腿部，则记为1分；若果蝇腿部无任何动作，则记为0分。 
	注意：先前的研究6,7已对特定刚毛刺激所引发的腿部反应进行了表征，包括每根刚毛对应的响应腿别，以及对该特定刚毛刺激产生反应的果蝇比例。我们仅根据Vandervorst的分类法6，对预期应产生反应的腿部运动进行评分。</li>
	<li>进行五次试验，每次间隔2 min&#160;。</li>
</ol>

<ol><li>Grünert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+and+Ca%2B%2B+in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li>
<li>Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+auditory+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila.</a> Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).</li>
<li>Gillespie, P. G., Walker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of mechanosensory transduction.</a> Nature. 413, 194-202 (2001).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+fatigue+of+a+mechanosensory+neuron+in+wild-type+Drosophila+and+in+memory+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants.</a> J Neurosci. 10, 491-499 (1990).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Vandervorst, P., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+sensory+connections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic control of sensory connections in Drosophila.</a> Nature. 286, 65-67 (1980).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9, 56-62 (1989).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery-based+science+education%3A+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59(2005).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li>
<li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li>
<li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+mechanosensation%3A+direct+or+indirect+activation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPN%28%3DNOMPC%29+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012(2010).</li>
<li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOMPC%2C+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family%2C+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li>
<li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mechanosensation+using+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li>
</ol>

本方案利用成年果蝇的行为学检测方法，筛选影响Drosophila机械感知的突变体。由于突变体库中包含致死性的P因子插入突变，无法直接用于成虫阶段的筛选，因此本方案采用了一种复杂的遗传学技术，该技术最初由Lee和Luo（1999年）提出，并由Wu和Luo（2006年）详细描述为具体实验流程，以克服成虫致死的问题。MARCM技术通过诱导同源染色体之间的有丝分裂重组，产生纯合细胞的克隆区域。由于有丝分裂重组过程中抑制蛋白tub-GAL80的丢失，这些克隆区域可通过GFP标记进行识别。通过使用MARCM技术获得特定基因位点的纯合细胞，即可在成年果蝇中利用多种方法研究基因功能，包括本文所述的行为学检测方法。
限制可检测基因数量及具体基因的主要因素在于果蝇基因组中是否存在FRT位点。果蝇品系必须在目标突变所在的染色体臂上含有FRT位点。用于MARCM实验的果蝇品系必须携带与突变染色体相同的FRT位点，以实现有丝分裂重组。在本实验室中，我们已构建了含有MARCM遗传背景并携带FRT40A和FRT42D位点的果蝇品系。这些品系使我们能够筛选已分别与2L和2R染色体臂上相应FRT位...

人类依赖于将来自环境的机械刺激（如触觉、压力、振动或声波）转化为神经系统可处理的感觉信息的能力，这一过程称为机械转导。人类与无脊椎动物在机械转导的整体机制特征上具有许多相同之处1，这使得Drosophila成为研究机械转导分子机制的有用模型。Drosophila melanogaster具有两组特化的感受器器官（I型和II型），能够将机械刺激转化为动作电位。I型机械感受器包含一个具有单个树突或感觉过程的神经元，并由三个支持细胞包围2。I型机械感受器包括刚毛机械感受器、对听觉敏感的弦音器官（约翰斯通器官）以及传递翅膀拍打信息的杯状感器3。覆盖果蝇背部的刚毛是I型器官中最丰富且最容易获取的。与脊椎动物中与听觉和平衡相关的毛细胞所处的胞外环境类似，围绕果蝇机械敏感神经元的支持细胞会分泌富含钾离子的内淋巴液，从而形成异常的钾离子浓度梯度1。哺乳动物和果蝇系统的机械敏感神经元均利用这种高浓度的胞外钾离子使细胞去极化。当大刚毛受到朝向体壁方向的机械刺激时，感觉神经元会因细胞膜的钾离子去极化而产生一系列动作电位作为响应4。支配刚毛的Drosophila感觉神经元在结构和功能上均与包括脊椎动物毛细胞在内的其他生物体的机械敏感细胞相似1,5。由于Drosophila外部感觉器官易于进行实验操作，且研究人员可利用丰富的遗传学技术，因此Drosophila是研究机械感觉分子基础的优良模型系统。
在果蝇中，刺激支配刚毛的单个感觉神经元可引发可观察到的行为反应。刺激不同位置的刚毛会引发特定且可重复的行为反应，具体反应取决于被刺激的刚毛。当对野生型果蝇进行触觉刺激时，即使其头部已被切除，仍会表现出复杂的梳理反射，即使用特定模式的腿部动作清洁受刺激刚毛附近的区域5-7。当果蝇携带已知的干扰学习能力7或协调性与运动活动5的单基因突变且处于纯合状态时，其对机械刺激的反应会出现异常。因此，这种梳理反射是研究单基因突变对特定、可重复行为影响的有效工具。
单根大刚毛受到刺激后产生的稳定行为反应，有助于鉴定参与机械传导的新基因。本方案用于检测一组突变果蝇是否缺乏行为反应，从而表明该突变干扰了机械感知功能。所选用于筛选的突变品系在成虫期之前即致死，因此无法通过传统的成虫行为实验进行检测。最初，这一组致死型P因子突变体被结合FRT重组位点，用于检测克隆中的细胞生长缺陷。克隆特异性地在眼部产生，是因为成虫果蝇在实验室条件下即使丧失视觉功能仍可存活8。然而，若完全去除机械感知能力，可能导致成虫严重运动失调或在羽化前死亡5。本方案采用嵌合体策略，以规避突变的致死效应，实现在成虫阶段进行测试。通过一种名为“带可抑制细胞标记的嵌合体分析”（Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker, MARCM）9 的遗传技术，在少数成虫果蝇感觉器官中产生纯合突变细胞，而生物体其余部分仍保持杂合状态。这些MARCM果蝇能够顺利存活至成虫期，但其刚毛对所关注的致死基因呈纯合状态。
MARCM 技术能够产生并标记纯合突变细胞区域，这些细胞通过表达绿色荧光蛋白（GFP）进行标识，而生物体其余部分在该特定基因座上仍保持杂合状态且不被标记9。MARCM 将单个P因子突变与五个常见的遗传元件相结合：由上游激活序列驱动的绿色荧光蛋白（UAS-GFP）、由通用启动子驱动的Gal80抑制蛋白（tub-Gal80）、由通用启动子驱动的Gal4转录因子（tub-Gal4）、由热激启动子控制表达的FRT重组酶，以及FRT重组位点10。通过热激诱导的重组酶驱动有丝分裂重组，仅有少量细胞对该突变为纯合状态，并同时被GFP标记。在杂合细胞中，染色体野生型拷贝上的Gal80可抑制GFP的表达。
针对MARCM技术优化了热激方案，以在果蝇刚毛外部感觉器官中诱导重组，同时使生物体的大部分区域保持杂合状态，因而不带有GFP标记。利用该方案产生的嵌合果蝇，其突变纯合子最常出现在盾片表面的后翅上或背中央刚毛中。
我们已利用已知的机械敏感型突变体NOMPC，测试了MARCM技术与理毛行为筛选相结合的有效性。离子通道no mechanoreceptor potential C（NOMPC）是机械转导通路中的一个关键组分，在 果蝇5,11-13NOMPC 属于瞬时受体电位（TRP）阳离子通道超家族5 并满足作为机械敏感性通道的所有鉴定标准 黑腹果蝇14,15：1）NOMPC 在 I 型感觉神经元的纤毛尖端表达 果蝇 13,16-18，2）NOMPC 缺失型幼虫对触觉刺激无电生理反应133) 在对机械刺激不敏感的细胞中异位表达NOMPC可诱导其对机械刺激产生敏感性13，4）在Schneider 2细胞中异源表达NOMPC可产生一种机械敏感性通道13，且NOMPC成年突变体在对机械刺激的反应中表现出缺陷5基于上述证据，我们预测NOMPC突变克隆在刚毛受到机械刺激时，其梳理行为反应将发生改变或受到抑制。
为验证梳理行为实验的可行性，构建了含有NOMPC突变的MARCM品系。通过刺激携带纯合NOMPC突变细胞的粗刚毛，观察镶嵌型果蝇的反应。我们预期在刺激粗刚毛后，果蝇的梳理行为会受到抑制。实验结果显示，在检测的14只突变刚毛果蝇中，仅有2只在重复刺激下产生了一次反应；大多数果蝇对纯合突变刚毛的刺激无反应。在确认该基于MARCM的行为学实验方法可在已知的机械敏感性镶嵌突变体中产生异常梳理反射后，此技术可用于筛选其他机械敏感性突变。

<table><tbody><tr><td>啤酒酵母（25 磅）</td><td>MP Biomedicals&amp;nbsp;</td><td>ICN90331225&amp;nbsp;</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>玉米粉（25 磅）</td><td>MP Biomedicals&amp;nbsp;</td><td>ICN90141125&amp;nbsp;</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>琼脂（1 磅）</td><td>MoorAgar Inc.</td><td>41004</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯（5 千克）</td><td>Genesee</td><td>20-259</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>糖蜜（1 加仑）</td><td>Sugarmill Brand - Thomsen Food Service</td><td>0 2625</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Fisher</td><td>A258-500</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Fisher</td><td>A260-500</td><td>果蝇饲料</td></tr><tr><td>果蝇培养管，窄口（聚苯乙烯）</td><td>Genesee</td><td>32-109</td><td>果蝇培养</td></tr><tr><td>6 盎司方形底瓶（聚丙烯）</td><td>Genesee</td><td>32-130</td><td>果蝇培养</td></tr><tr><td>Flugs - 塑料果蝇培养瓶</td><td>Genesee</td><td>49-100</td><td>果蝇培养</td></tr><tr><td>大号人造纤维塞</td><td>Genesee</td><td>51-100</td><td>果蝇培养</td></tr><tr><td>窄口自动加料器（Droso-Filler）</td><td>Genesee</td><td>59-168</td><td>果蝇饲料制备</td></tr><tr><td>瓶用自动加料器（Droso-Filler）</td><td>Genesee</td><td>59-170</td><td>果蝇饲料制备</td></tr><tr><td>8A-C / 齿轮驱动实验室搅拌器，带C型夹安装架&amp;nbsp; 1/15 HP，700 rpm 可调转速，115 V，50/60 Hz</td><td>Cleveland Mixer</td><td>8A-C</td><td>果蝇饲料制备</td></tr><tr><td>水套式反应釜</td><td></td><td></td><td>果蝇饲料制备</td></tr><tr><td>昼夜生长培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td>温度及明暗循环控制</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td></td><td>用于热激处理</td></tr><tr><td>显微手术剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;15000-08</td><td>用于去除果蝇头部</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V8&amp;nbsp;</td><td>配备GFP滤光立方（KSC295-814D）带通滤光片</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Zeiss</td><td>X-Cite 120</td><td>光纤导光管便于系统配置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜用相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam ICc1</td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td>用于低温麻醉</td></tr><tr><td>自制低温麻醉操作盘</td><td></td><td></td><td>用于低温麻醉下的去头操作</td></tr><tr><td>塑料盒</td><td></td><td></td><td>用于在高湿度环境中恢复去头后的果蝇</td></tr></tbody></table>

基于marcm克隆的机械感知行为检测方法 黑腹果蝇

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

由于与哺乳动物内耳毛细胞在结构和功能上具有同源性，支配这些毛细胞的神经元 果蝇 外部感觉器官为研究机械感知提供了极佳的模型系统。本实验方案描述了一种果蝇的简单触觉行为，可用于鉴定干扰机械感知的突变体。当对果蝇胸部的大刚毛（macrochaete bristle）施加触觉刺激时，会引发第一或第三对足的梳理反射。影响机械转导（如NOMPC基因突变）或其他反射弧组分的突变，均可能抑制该梳理反应。传统的成体行为筛选方法会遗漏在发育过程中具有必需功能的致死突变体。本方案结合触觉行为检测与可抑制细胞标记的镶嵌分析（MARCM），仅生成并标记少量纯合突变细胞区域，这些细胞通过表达绿色荧光蛋白（GFP）进行可视化。通过对MARCM克隆进行异常行为反应检测，可筛选一系列致死性P因子突变，从而发现传统方法难以识别的、参与机械感知的新基因。

该实验方案的成功在很大程度上取决于可检测果蝇的总体产量、热激诱导有丝分裂重组的效率，以及在每2分钟刺激一次的条件下获得果蝇强烈行为反应的能力。由于估计仅有12.5%的胚胎含有必需的MARCM元件，且约16.67%的羽化成虫具有GFP表达潜力，因此在定时产卵期间获得大量卵至关重要。图1A展示了在4小时时间段内成功进行定时产卵的一个示例，该产卵结果将用于后续实验步骤中。
在卵孵化后85至100小时进行热激时，GFP标记的外部感觉器官产量最高，大多数果蝇均有一个大刚毛被标记。在此时间段内进行热激，许多感兴趣区域的可检测刚毛基部可含有纯合细胞，其中背中央刚毛和后翅刚毛最常被标记（图2A）。在此时间窗口之外进行热激，则会导致GFP表达出现在目标体区以外的区域，或无GFP表达（图2B）。
<p class="jove_content" fo:keep-to...

为了鉴定影响机械感知的新型突变，我们设计了一种检测方法，用于测量通过MARCM方法产生的突变克隆果蝇刚毛对触觉刺激的行为反应。该技术组合能够鉴定出原本可能导致致死的机械敏感性突变。

基于MARCM克隆的机械感知行为检测方法 黑腹果蝇

由于与哺乳动物内耳毛细胞在结构和功能上具有同源性，支配果蝇外部感觉器官的神经元……

本实验的总体目标是检测影响成年果蝇Meno感觉的突变。该方法有助于揭示Meno感觉领域的关键科学问题，例如鉴定Meno敏感通道。该技术的主要优势在于，通过使用嵌合体动物，我们能够筛选出原本对生物体致死的突变。通过使用嵌合体筛选方法，我们能够鉴定出那些可能被传统行为学筛选所遗漏的突变。该方法的可视化演示至关重要。行为学检测步骤难以掌握。准确识别相关刚毛需要稳定的手法和练习。实验开始时，将果蝇饲养在玉米粉糖蜜培养基中，并置于培养箱内保存。从含有必要遗传元件的标记品系储备中获取处女雌蝇。将标记的处女雌蝇与携带目标突变及其相应FRT位点的雄蝇进行杂交。接下来，设置第二组对照杂交，使用携带相同FRT位点但无突变的雄蝇。以五只雌蝇配一只雄蝇的比例，在让果蝇交配至少一个晚上后，将成虫转移至含有新鲜培养基的新离心管中。将果蝇置于暗柜中，在室温下让其产卵。果蝇产卵后，将杂交个体转移至新的培养瓶中。记录产卵期的起始和结束时间。保留产卵数超过20个的样品管用于热激处理，并将其放回培养箱。在产卵后85至100小时，将样品管放入水浴中，确保水位高于培养基高度，但不要完全浸没样品管。一小时后，将样品管从水浴中取出，让果蝇进入恢复期。复苏后，将冻存管重新放入水浴中孵育一小时。将冻存管从水浴中取出，并在麻醉后放回培养箱中继续培养。果蝇置于冰上。待果蝇完全不动后，挑选出具有所有目标性状的个体。随后，使用虹膜剪小心地将所选果蝇的头部剪下，注意将剪刀置于头部与胸部之间，切断连接时避免损伤胸部。将去头的果蝇置于封闭的湿润环境中，在恢复后让其恢复10至20小时。取回果蝇进行检查。仅使用能够自行书写的果蝇。当扰动时，在荧光解剖显微镜下观察无头果蝇，以鉴定带有GFP标记的纯合子克隆。在刚毛外部感觉器官处，记录该刚毛的名称及其位于果蝇左侧或右侧，并用硬毛或精细镊子将带有GFP标记的刚毛向果蝇身体方向偏转以引发梳理反射，观察其腿部反应。对在刚毛刺激下抬腿的果蝇记为1分的窦房评分，对不抬腿的果蝇记为0分。在可能的情况下，我们检测后AOR刚毛上具有镶嵌组织的果蝇，这些刚毛在行为检测中对刺激反应良好；同时将实验果蝇与已知的机械敏感性突变体“无机械受体电位C”（no mechanoreceptor potential C，NMSI）进行比较，后者表现出 grooming 反应受损。对照组果蝇对其34%的刚毛刺激产生了反应。相比之下，刚毛为 NMSI 纯合子的动物表现出 2% 的反应率。在完成该实验流程并鉴定出一个新的行为反应基因后，可进一步开展其他实验，例如电生理学和蛋白质定位实验。为了进一步表征该基因的功能，例如，我们可以回答该基因是否参与了柄感受觉信号转导，或是参与了柄感受觉神经元的发育。

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科研

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Neuroscience

神经科学

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