Name: 白银纳米胶体的盐度依赖性毒力测定使用青鳉鸡蛋 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 了解白银纳米胶体盐度依赖性毒力测定方法，使用青鳉鱼卵评估不同盐度下化学物质对水生生物的毒性影响。该技术为生态毒理学研究提供高通量检测框架。

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我们感谢东洋大学生命科学研究生院的清水香织女士和高须正树先生提供的技术支持。本项目得到了东洋大学特别研究基金和生物纳米电子研究中心研究经费（资助对象：SK）；日本私立学校振兴与共济事业团科学研究促进基金（资助对象：SK）；日本经济产业省新风险评估项目基金（资助对象：SK）；日本学术振兴会挑战性探索研究资助项目（编号23651028，资助对象：SK）；日本学术振兴会科学研究资助项目（B）和（C）（编号23310026和26340030，资助对象：SK）；以及日本文部科学省私立大学战略研究基地建设项目资助（编号S1411016，资助对象：SK）的支持。

本研究中使用的日本青鳉鱼均按照东京理科大学的机构指南人道对待，在实验过程中充分考虑减轻其痛苦与不适。
1. 银纳米胶体（SNCs）
<ol>
	<li>购买纯化的SNCs（20 mg/L−1，纯度99.99%，平均粒径约为28.4 ± 8.5 nm，悬浮于蒸馏水中）。</li>
	<li>根据操作手册8，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析验证银的纯度和浓度。ICP-MS分析的前处理方法见第7节。</li>
</ol>
2. 不同盐度的SNC溶液（银胶体与Ag+的混合物）的制备
<ol>
	<li>配制60× ERM溶液：在1 L超纯水中加入60 g NaCl、1.8 g KCl、2.4 g CaCl2·2H2O和9.78 g MgSO4·7H2O；用超纯水配制的1.25% NaHCO3溶液调节pH至7.0。</li>
	<li>将ERM溶液在25 °C下搅拌过夜。</li>
	<li>将SNCs与稀释后的ERM溶液混合，每种SNC-ERM混合溶液配制40 ml。最终SNCs浓度为10 mg/L−1，ERM浓度分别为1x、5x、10x、15x、20x或30x。</li>
	<li>用超纯水配制的0.625% NaHCO3溶液调节SNC-ERM混合溶液的pH至7.0。在SNC溶液的制备过程中，pH调节至关重要，因为酸性条件会促进Ag+ 的释放9。</li>
	<li>使用AgNO3作为SNCs的参比化合物。
	<ol>
		<li>将AgNO3与稀释后的ERM溶液混合，配制40 ml AgNO3-ERM混合溶液，AgNO3浓度为15.7 mg/L−1（相当于10 mg/L−1的银），ERM浓度分别为1x、5x、10x、15x、20x或30x。 
		注意：为评估银胶体的毒性，采用可溶性银来源的AgNO3溶液作为SNCs的参比化合物，SNCs为银胶体与可溶性银的混合物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 青鳉鱼培养与卵的收集
<ol>
	<li>获取青鳉（O. latipes）（橙红色品系）（60条雄鱼和60条雌鱼）。</li>
	<li>使用青鳉流水养殖系统，将青鳉按群体培养（每组20条雄鱼和20条雌鱼），置于3 L水箱中，使用1x ERM培养液。
	<ol>
		<li>培养条件如下： 
		培养液pH范围：6.2至6.5 
		光照-黑暗周期：16:8小时 
		培养液温度：24 ± 0.5 °C 
		培养液渗透压：257 mOsm</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天于10:00投喂卤虫（Artemia salina）无节幼体一次，并于09:00、11:00、13:00、15:00和17:00投喂人工干燥鱼饲料（每日五次）。
	<ol>
		<li>获取A. salina无节幼体。</li>
		<li>在塑料烧杯中配制5 L的3.0%盐溶液。</li>
		<li>向烧杯中的盐溶液加入30 g卤虫卵。</li>
		<li>使用曝气泵在25 °C下充气（4 L/min−1）孵育卵48小时。</li>
		<li>48小时后，停止充气。</li>
		<li>静置溶液5至10分钟，使孵化出的A. salina无节幼体（溶液下层）与未孵化卵及卵壳（溶液上层）分离。</li>
		<li>通过倾析法去除上层液体。</li>
		<li>将溶液下层部分通过孔径283 µm的筛网过滤，并用孔径198 µm的网筛收集通过的无节幼体。</li>
		<li>在6小时内将无节幼体投喂给青鳉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雌性青鳉产卵后，轻轻从雌鱼体表取下外部卵团，或使用小网（网尺寸5 cm × 5 cm，孔径0.2 mm × 0.2 mm）从鱼缸底部收集卵。</li>
	<li>用流动的自来水冲洗卵团5秒。</li>
	<li>将所有冲洗后的卵团加入30x ERM溶液中。</li>
	<li>1分钟后将卵团从溶液中取出，置于干燥的纸巾之间轻轻滚动。</li>
	<li>将卵重新放回30x ERM溶液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下挑选受精卵。</li>
	<li>用镊子将挑选出的810枚卵放入六孔塑料培养板中，置于1x ERM溶液中。</li>
	<li>将卵置于25 ± 0.1 °C的培养箱中孵育至发育阶段21。（青鳉胚胎的发育阶段根据岩松的研究10定义。）</li>
	<li>在解剖显微镜下挑出发育至阶段21的孵育卵。</li>
	<li>用1x ERM溶液冲洗挑选出的卵。</li>
	<li>将冲洗后的卵用于暴露实验（第4节）。</li>
</ol>
4. 不同 ERM 盐度下 SNCs 或 AgNO3 的毒性测试
<ol>
	<li>用测试溶液 [SNCs（10 mg/L−1）或 AgNO3（15.7 mg/L−1，相当于 10 mg/L−1 银）] 在 pH 7 条件下，对青鳉鱼卵（21 期）进行三次冲洗，每次冲洗均在不同浓度的 ERM（1x、5x、10x、15x、20x 或 30x）中进行。对照组使用在 pH 7 条件下 1× 至 30× ERM 中的鱼卵。</li>
	<li>将 15 枚已冲洗的鱼卵加入六孔塑料培养板的每孔 5 ml 测试溶液中。（每种测试溶液均需重复三次暴露实验，用于 SNC 或 AgNO3 毒性检测。）</li>
	<li>用铝箔包裹培养板。</li>
	<li>将包裹后的培养板置于 25 °C 黑暗环境中孵育，直至孵化或孵育 14 天。</li>
	<li>每 24 小时观察一次暴露的鱼卵，记录生物学变化及死亡鱼卵（图 1 和 图 2）。</li>
	<li>每 24 小时更换一次测试溶液。</li>
	<li>按以下方式开展观察：
	<ol>
		<li>暴露第 6 天，在解剖显微镜下使用秒表计数青鳉胚胎的心率（每 15 秒）（图 3a）。</li>
		<li>暴露第 6 天，在解剖显微镜下使用千分尺测量青鳉胚胎的眼部大小（直径）（图 3b）。</li>
		<li>在孵化当天，在解剖显微镜下使用千分尺测量仔鱼的全长（图 3c）。</li>
		<li>统计 14 天内成功孵化的暴露鱼卵总数（图 3d）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从SNC溶液中分离可溶性银及银含量分析
<ol>
	<li>通过使用3 kDa膜过滤器在14,000 × g和4 °C条件下离心10分钟，从每种SNC溶液（银胶体与可溶性银的混合物）中分离可溶性银。采用3 kDa膜过滤器分离SNC中的可溶性银，因为已有报道显示，在1× ERM中聚集态SNC的平均直径为67.8 nm11，而Ag+的直径为0.162 nm12；3 kDa膜可截留直径为2 nm或更大的颗粒13。</li>
	<li>根据ICP-MS操作手册8，采用ICP-MS分析法测定50 µl滤液中的银浓度（即为可溶性银浓度）（图3e）。ICP-MS分析的前处理方法见第7节。</li>
</ol>
6. 青鳉胚胎中银生物累积的测量
<ol>
	<li>将青鳉鱼卵（21期）暴露于SNCs或AgNO₃中3 如第4节所述</li>
	<li>在暴露的第6天，从卵中去除卵膜（即，使用根据所述方案的青鳉孵化酶进行去卵膜处理 青鳉手册14.</li>
	<li>根据ICP-MS操作手册，采用ICP-MS分析法测定去壳卵中的银浓度8 (图 3f）。ICP-MS分析的预处理方法见第7节。</li>
</ol>
7. 通过ICP-MS分析测定银浓度
<ol>
	<li>将样品 [50 µl 银溶液（用于验证银浓度；第1节）；三个去壳胚胎（第5节）；或50 µl 过滤溶液（第5节）] 加入50 ml 聚四氟乙烯烧杯中。</li>
	<li>向50 ml 烧杯中加入2.0 ml 超纯硝酸。</li>
	<li>在电热板上于110 °C 加热混合物，直至接近干燥（约3小时）。</li>
	<li>为完全溶解有机物质，向烧杯中加入2.0 ml 超纯硝酸和0.5 ml 过氧化氢。</li>
	<li>再次在电热板上加热混合物，直至接近干燥（约3小时）。</li>
	<li>用4 ml 1.0% 超纯硝酸溶液溶解残留物。</li>
	<li>将4 ml 溶液转移至离心管中。</li>
	<li>重复步骤7.6至7.7两次（共三次）。最终体积为12.0 ml。</li>
	<li>根据操作手册8，采用ICP-MS分析测定样品（溶解于1.0% 超纯硝酸中）的银浓度。
	<ol>
		<li>使用内标和外标溶液（见材料列表）定量银浓度。内标和外标溶液经美国实验室认可协会（A2LA）认证。银的检测限为0.0018 ng/ml−1（溶液）和0.016 ng mg-weight−1（胚胎体）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2+Effects+on+Biotic+Systems%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems</a>. , OECD. Available from:
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<li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li>
<li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li>
<li>Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from:
 <a target="_blank" href="http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html">http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html</a> (2015).</li>
<li>Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from:
 [cited 2015] <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme">https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme</a> (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

青鳉是一种对海水耐受性很强的淡水鱼；鲜为人知的是，这种鱼最初的自然栖息地是日本沿海的海水环境6。因此，青鳉具有发育良好的氯细胞7。这一独特特性为科学家提供了一种新方法，仅利用单一鱼类物种，即可在不同盐度（从淡水到海水）条件下检测环境中化学物质的毒性。
为了获得处于21期的青鳉卵，必须每天早晨收集卵并在20期进行筛选。通常，青鳉配对在清晨（日出前）开始交配，并在日出时产卵。早晨收集的卵通常处于10或11期左右。如果在实验开始前需要控制卵的发育进程，可在达到21期之前将温度控制在15至20 °C以减缓卵的发育速度。在研究硫化纳米银（SNC）毒性的盐度依赖性时，测定测试溶液及去壳胚胎中银浓度（可溶性银）对我们的研究至关重要。孵化酶是去除卵膜最符合生物学特性的酶，因其具有高度特异性，不会产生有害的蛋白酶活性，因此是最佳选择。不建议使用其他蛋白酶。目前唯一可获得的孵化酶是针对青鳉的，这是本方法的一个局限性。
盐度对化学毒性测试结果的显著影响表明，在实验中尽可能真实地模拟此类天然水体特性，对于研...

自1979年经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）发布化学品测试指南以来，该指南第2部分“生物系统效应”已发布了38项测试指南1。所测试的水生生物均来自淡水生境，包括淡水植物、藻类、水生无脊椎动物（如溞类和摇蚊）以及鱼类（如青鳉、斑马鱼和虹鳟）。与海水环境相比，淡水环境更直接受到人类经济和工业活动的影响，因此因面临更高的污染风险而被优先列为测试对象。
在包括河口在内的沿海地区，盐度在半咸水和海水条件之间变化，这些区域常常受到工业活动的污染2。沿海地区及其相关的湿地具有高度的生态多样性和生产力。因此，必须保护沿海生态系统免受化学污染。然而，在半咸水和海水生境中开展的生态毒理学研究仍然有限。
Sakaizumi3 研究了甲基汞与盐度对日本青鳉卵的联合毒性作用，发现提高测试溶液的渗透压会增强甲基汞的毒性。Sumitani 等.4 利用青鳉卵研究了垃圾填埋场渗滤液的毒性，发现渗滤液与卵之间的渗透当量是诱导胚胎发育异常的关键因素。此外，Kashiwada5 报道了塑料纳米颗粒（直径为 39.4 nm）在半咸水条件（15 倍胚胎培养基（ERM））下可轻易穿透青鳉卵的卵膜。
日本青鳉（Oryzias latipes）是一种典型的小型鱼类模型，已被广泛应用于基础生物学和生态毒理学研究6。由于具有高度发达的氯细胞，日本青鳉能够在从淡水到海水的不同环境条件下生存7。因此，它们可能适用于在多种盐度条件下进行测试。

<table><tbody><tr><td>银纳米胶体</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>用于制备 ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>用于制备 ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>用于制备 ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>用于制备 ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>用于制备 ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>青鳉（&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;）橙红色品系</td><td>国立环境研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青鳉流水式养殖系统</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>卤虫（Artemia salina）无节幼体卵</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>曝气泵</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime 幼体 &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime 幼体 &amp;beta;-1</td><td>人工干燥鱼饲料</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>千分尺</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6 孔塑料板</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>秒表</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa 膜滤器</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml 离心式滤器</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚四氟乙烯烧杯</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas 标准品</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>作为内标</td></tr><tr><td>Custom claritas 标准品</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>作为外标</td></tr><tr><td>超纯硝酸</td><td>关东化学公司</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢&amp;nbsp;</td><td>关东化学公司</td><td>18084-1B</td><td>用于原子吸收光谱法</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>电热板</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

利用青鳉鱼卵进行银纳米胶体的盐度依赖性毒性检测

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

盐度是水生环境的一个重要特征，对于水生生物而言，它定义了淡水、半咸水和海水等不同生境。化学物质对水生生物的毒性测试及其生态风险评估通常在淡水中进行，但化学物质对水生生物的毒性受pH、温度和盐度的影响。然而，目前尚无评估化学物质毒性随盐度变化的标准方法。本研究采用青鳉（Oryzias latipes）作为实验对象，因其能够适应淡水、半咸水和海水环境。通过使用不同浓度的胚胎培养基（ERM）（1x、5x、10x、15x、20x 和 30x）（其中1x ERM和30x ERM的渗透压分别相当于淡水和海水），测试银纳米胶体颗粒（SNCs）对青鳉卵的毒性。实验在六孔塑料板中进行，每孔放入15枚青鳉卵，设三个重复，于pH 7、25 °C、避光条件下，暴露于浓度为10 mg/L−1的SNCs溶液中。
我们使用解剖显微镜和测微尺，在第6天测量心率（每15秒）和眼径，并在孵化当天测量仔鱼的全长（第4节）。胚胎持续观察至孵化或第14天；随后我们每天记录孵化率，持续14天（第4节）。为观察胚胎中银的积累情况，我们采用电感耦合等离子体质谱法测定测试溶液中的银浓度（第5节）以及去壳胚胎中的银含量（第6节）。SNCs对青鳉胚胎的毒性随盐度升高而明显增强。该新方法使我们能够在不同盐度条件下检测化学品的毒性。

盐度对SNC毒性的效应非常明显：畸形或死亡的诱导具有盐度依赖性（图1 和 图2）。我们检测了暴露于SNC（10 mg/L−1）的胚胎的表型生物标志物（心率、眼径、全长和孵化率）。这些表型生物标志物揭示了SNC毒性的盐度依赖性。
对照组中，从1x到30x ERM条件下，心率范围为29.6至32.2次/15秒。然而，在30x ERM条件下，经SNC或AgNO3暴露后，心率显著下降（P &lt;0.01）（图3a）。心率降低表明健康状况恶化。在盐度为5x至30x ERM的对照组或AgNO3暴露条件下，幼虫全长与相应1x ERM溶液相比均无显著差异，体长始终为4.55至4.69 mm。然而，在15x和20x ERM条件下经SNC暴露后，体长显著降低至4.33 mm和3.77 m...

胚胎阶段对异源物质最为敏感。尽管化学毒性依赖于盐度，但目前尚无方法用于检测毒性对水生生物的盐度依赖性。本文中，我们描述了一种测定水生胚胎毒性盐度依赖性的新型高通量方法。

盐度是水生环境的重要特征。对于水生生物而言，它界定了淡水、半咸水和海水的栖息环境。

本实验的总体目标是测试化学物质对水生生物的盐度依赖性毒性。该方法有助于回答生态毒理学领域中的关键问题，例如评估化学物质在淡水、半咸水和海水条件下的毒性。该技术的主要优势在于，青鳉鱼无需被用于测试不同盐度下化学物质的毒性。此外，该技术的应用还可拓展至其他化学物质毒性的治疗或诊断研究。文本方案中涵盖了在不同盐度条件下制备商用银纳米溶胶溶液的方法，以及青鳉鱼的培养与卵的收集。首先用测试溶液对六组21期的青鳉鱼卵进行冲洗，每组冲洗三次。使用不同浓度的ERMs处理每组鱼卵。然后，从每组已冲洗的鱼卵中分别转移15枚至六孔塑料培养板的不同孔中，每个孔内含有相应的测试溶液。将本实验设置三个重复组，每组分别进行洗涤。用铝箔纸包裹培养板，于25 °C避光孵育，直至卵孵化或孵育14天，以较早者为准。孵育期间，每天观察卵的生物学变化以及是否有死亡的卵。每天更换测试溶液，并同时进行观察。在观察的第六天，计算每个胚胎在15秒内的心率。同样在第六天，使用显微测微尺测量每种实验条件下每个胚胎眼睛的直径。每当胚胎孵化为幼虫时，使用显微测微尺测量其全长。此外，在14天内，记录孵化的卵总数。为了测定银的生物累积，在第6天采用标准方法收集卵的卵膜。去膜后的卵可按照如下章节所述，与SNC溶液同样进行分析。为了从每种SNC溶液中分离可溶性银，首先使用3 kDa膜过滤胶体与可溶性银的混合物，然后在冷藏离心机中以14,000 ×g离心10分钟，使滤膜上的样品沉降。取50微升滤液，通过ICP-MS分析测定银浓度。将等分试样加入50毫升聚四氟乙烯烧杯中，并向烧杯中加入2毫升超纯硝酸。然后，在电热板上于110摄氏度加热该混合物。加热约三小时，使溶液几乎完全蒸干。待烧杯冷却后，将有机固体完全溶解。向烧杯中加入2毫升超纯硝酸和0.5毫升过氧化氢。然后再次加热混合物，直至其几乎完全干燥。接着，将剩余残渣溶解于4毫升由超纯水配制的1%超纯硝酸中。将溶液转移至15毫升离心管中。将剩余固体在聚四氟乙烯烧杯中重复溶解过程两次，将三次收集的溶液冷却至同一试管中。现在使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定样品中的银浓度。采用制造商推荐的方案分析样品。务必使用内标和外标。盐度对SNC毒性的效应显而易见。畸形或死亡的诱导效应明显依赖于盐度。进行了多种生理指标的测量。心率在盐度达到30倍ERM之前未受到影响。在盐度为15倍和30倍ERM时，体长显著缩短。眼径也减小，与体长变化一致。在15倍ERM条件下孵化可能性降低，在30倍ERM条件下仅有2%的卵发生孵化。在实验溶液中，随着盐浓度的增加，水溶性金属复合物更易形成。对胚胎中金属配合物在六天后的检测结果显示，随着溶液中浓度的增加，胚胎中的浓度也随之升高。在进行该操作时，需注意调节测试条件的pH值，因为酸性条件有利于银离子的释放。

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科研

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发育生物学

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