Name: 准备和测试阻抗为基础与RTgill-W1细胞饮用水进行快速评估水样进行毒性射流生物芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习使用虹鳟鱼鳃上皮细胞制备生物芯片，并通过阻抗传感器快速检测饮用水中的化学毒性。该方法可在野外条件下进行，芯片冷藏保存九个月仍保持活性，为环境健康评估提供实用解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国陆军医学研究与物资司令部以及小企业创新研究计划和小企业技术转移计划资助；合同编号：W81XWH-13-C-0093。我们感谢弗雷泽大学的Lucy Lee博士作为我们的RTgill-W1细胞培养指导老师，同时感谢滑铁卢大学的Niels Bols博士开发了RTgill-W1细胞系。

1. 测试材料的准备
注意：为了准备生物芯片的测试，需要准备好若干瓶汇合的RTgill-W1细胞。所需培养瓶数量的一个良好估算标准是，每接种16个生物芯片需要1瓶汇合的T175培养瓶。
<ol>
	<li>使用无菌技术在 II 级生物安全柜（生物安全柜）中执行以下步骤。使用 70% 乙醇对生物安全柜及放入柜内的所有材料进行消毒。
	<ol>
		<li>通过解冻一管 1 mg 的纤连蛋白，并将其溶于 100 ml 无菌 L-15 培养基中，配制成浓度为 10 µg/ml 的纤连蛋白基质溶液，用于流体生物芯片的准备。将溶液分装为每份 40 ml，置于无菌 50 ml 锥形聚丙烯管中，于 -20 °C 冷冻保存。在接种生物芯片前数小时于室温下解冻。一旦解冻后，不得再次冷冻。</li>
		<li>向 500 ml L-15 培养基中加入 50 ml 胎牛血清、5 ml 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂以及 5 ml 青霉素/链霉素溶液（储存液含青霉素 10,000 单位/ml 和链霉素 10,000 µg/ml），配制细胞培养基。最终得到 560 ml 含 9% 血清的完全细胞培养基。置于冰箱中冷藏保存。 
		注意：此即用于培养瓶和生物芯片的完全细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>粉末培养基小瓶
	<ol>
		<li>使用自动粉末分装仪预先分装 L-15ex 粉末至 0.1 dram 带扣盖小瓶中，每瓶含 60 mg ± 0.5% 的粉末。在小瓶上标注粉末分装日期，并将小瓶（每 50 个为一组）装入可重复封口的金属化聚酯袋中冷藏保存，每袋内放置三个 1 g 硅胶干燥剂包。 
		注意：L-15ex 粉末培养基小瓶可提前制备并储存长达 9 个月，以备后续检测使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将家用漂白剂与去离子水（DI 水）稀释，配制 100 ml 的 20% 漂白剂溶液。预计每个生物芯片需要 5 ml 漂白剂溶液。</li>
	<li>通过截取 27 mm 长的可高压灭菌生物相容性管路（每个待接种的生物芯片需准备 2 段），并在管路两端安装聚碳酸酯滑入式鲁尔接头，制备生物芯片管路组件。将管路组件放入可高压灭菌袋中，在 134 °C 下高压灭菌 8 分钟。同时，在另一个独立的灭菌袋中以相同条件高压灭菌生物芯片塞子（每个生物芯片 2 个）。</li>
	<li>将去离子水在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。 
	注意：该水将用于接种后冲洗生物芯片。预计每个生物芯片需要 10 ml。 
	注意：每个生物芯片通道的实际体积为 2 ml，但在去除漂白剂溶液后，需向每个通道中冲洗 5 ml 无菌水。</li>
	<li>通过截取 27 mm 长的生物相容性管路，并在管路两端连接雄性滑入式鲁尔接头，制备注射器进样管路组件。将管路组件放入纸质热封灭菌袋中，在 134 °C 下高压灭菌 8 分钟。</li>
</ol>
2. 流体生物芯片接种程序
注意：所有涉及生物芯片或培养基的操作均须在II级生物安全柜中进行，并采用无菌技术。
<ol>
	<li>在预定接种前24小时，于生物安全柜中将生物芯片从生产商包装中取出，并置于已灭菌的塑料器械盒内。</li>
	<li>使用20%的漂白剂溶液对生物芯片进行灭菌，步骤如下 
	注意：从历史经验来看，该漂白程序可防止生物芯片在长期储存期间出现真菌生长，以防制造商对生物芯片进行的等离子体灭菌未能有效。
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，使用连接有注射管组件的20 ml无菌注射器，向生物芯片的每个通道注入2 ml的20%次氯酸钠溶液。加入次氯酸钠溶液后，静置生物芯片1小时。</li>
		<li>一小时后，使用连接至真空抽吸管路的无菌公型鲁尔接头组件，从两个通道中真空抽吸漂白溶液。冲洗生物芯片时，使用其中一个生物芯片管路组件作为排水口。</li>
		<li>使用连接无菌注射装置的20 ml无菌注射器，向芯片的每个通道注入5 ml无菌水冲洗，使多余的水在生物安全柜中流入容器内。随后按照前述漂白液的处理方法进行真空抽吸以去除水分，将生物芯片放回塑料仪器盒中，并置于生物安全柜内，直至次日接种细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在接种生物芯片前60分钟，注入2 ml的 10 µg/ml 将纤维连接蛋白溶液加入生物芯片的每个通道中。将生物芯片置于生物安全柜中孵育60分钟，然后在接种细胞前用真空抽吸法去除纤维连接蛋白（操作方法见步骤2.2.3）。将两段无菌生物芯片管路组件（参见第1.4节）连接至生物芯片的端口上。</li>
	<li>使用美国典型培养物保藏中心（ATCC）产品说明书中所述方法，对每16个生物芯片消化一个汇合的RTgill-W1 T175培养瓶16.
	<ol>
		<li>吸出汇合培养瓶中的培养基。</li>
		<li>用 15 ml PBS 冲洗细胞层，然后吸除。</li>
		<li>向每个T175培养瓶中的细胞层加入6 ml胰蛋白酶/EDTA溶液，室温消化约5分钟。</li>
		<li>向每个培养瓶中加入15 ml完全L-15细胞培养基以终止消化。</li>
		<li>将细胞悬液合并至无菌一次性容器中。 
		注意：容器体积可根据接种的生物芯片数量在150–500 ml之间调整。每片生物芯片约需5 ml细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除约 1 ml 细胞悬液，置于微量离心管中用于计数。使用配备 10X 物镜的明场显微镜和血细胞计数板，计数 10 µl 取一份细胞样品，计算所需完全L-15细胞培养基的体积，以制备浓度为2.5 × 10⁶ 个细胞/mL的细胞悬液5 cells/ml 
	注意：如果使用细胞悬液接种培养瓶以继续培养，此时应进行此操作。使用完全L-15细胞培养基调整细胞悬液浓度。</li>
	<li>使用连接无菌注射管组件的无菌 20 ml 注射器（参见第 1.6 节），向生物芯片每个通道的外端口注入 2.5 ml 细胞悬液即未连接导管的端口，使多余的细胞悬液经导管流出至生物安全柜中的废液容器内。 
	注意：这将确保整个通道及相连的管路均充满细胞悬液。
	<ol>
		<li>通过将带有鲁尔接头的软管自由端插入每个通道的外侧端口，为每条生物芯片通道创建一个封闭回路。</li>
		<li>用沾有70%乙醇的纸巾擦拭闭合环上多余的培养基，然后将生物芯片放回塑料盒中 20 °C 培养箱。为每张生物芯片分配一个唯一的识别编号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第4天和第7天，将生物芯片从 20 °C 培养箱中，并用温度平衡的完全L-15细胞培养基为所有生物芯片补充培养基。操作步骤同2.6，但仅使用L-15细胞培养基（不含细胞悬液）。将生物芯片重新放回培养箱中 20 °C 第4天换液后的培养箱培养。
	<ol>
		<li>第7天喂养后，移除并丢弃芯片上的软管，并将已灭菌的排水塞插入生物芯片中。</li>
		<li>将生物芯片放入盒中 6 °C 孵育器中保存，直至用于检测。 
		注意：芯片可在冷藏条件下保存长达9个月，并仍可用于ECIS检测仪中的检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用生物芯片进行 ECIS 检测
<ol>
	<li>若使用，请配制测试化学品。（参见 Brennan， 等., 20127 用于测试化学品的制备。</li>
	<li>从携带箱中取出ECIS读取仪和测试用品。从准备好的生物芯片中取出一个 6 °C 培养箱。将生物芯片置于纸巾上。开启ECIS读取器。</li>
	<li>使用10 ml注射器，将10 ml对照水加入已标记的0.5盎司透明塑料对照瓶中，将10 ml测试样品加入已标记的0.5盎司透明塑料测试瓶中。 
	注意：1）务必去除气泡以确保测量准确。2）注射器和容器已用颜色编码；蓝色代表对照组，红色代表实验组。</li>
	<li>从铝箔袋中取出两个粉末培养基小瓶。打开其中一个粉末培养基小瓶（必要时使用多功能工具），将整瓶内容物倒入对照水样瓶中，并将空瓶也一并投入溶液中。对测试瓶重复此操作。盖紧瓶盖并振荡，确保粉末完全溶解。</li>
	<li>从相应的西林瓶中，用9 ml的对照溶液（蓝色注射器）或测试溶液（红色注射器）分别填充各支彩色10 ml注射器。去除注射器中的气泡。</li>
	<li>移除生物芯片端口的塞子并连接排水管。</li>
	<li>将生物芯片放入ECIS读取仪的可拆卸塑料托盘中，并盖上盖子。</li>
	<li>将装满液体的注射器连接到生物芯片的外侧端口，并安装注射器活塞。</li>
	<li>从主界面选择“NEXT”以启动预测试。 
	注意：读取软件将检测阻抗。如果阻抗处于用户设定的范围内（通常为1,000至3,000欧姆），屏幕将显示“Cartridge Passed”，如图所示 图3，然后提示用户选择“下一步”，软件将继续进入步骤 3.10。如果由于生物芯片缺陷或生物芯片与读取器连接不良（通常由电极错位引起）导致阻抗不在设定范围内，则屏幕将显示“芯片失败”，用户可选择“中止”或“验证”该检测。
	<ol>
		<li>选择“中止”返回步骤 3.9）；在收到“ cartridge Passed”消息并选择“下一步”后，选择“验证”以进入步骤 3.10）。 
		注意：如果收到“芯片失败”提示，在继续使用新生物芯片前，最好将其取出并目视检查是否存在缺陷或泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="墨盒阻抗检测结果表；对照组与样本数据比较；系统验证。" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：生物芯片阻抗读数符合要求时ECIS读取仪的截图。 该截图显示了流体生物芯片中4个对照电极（CE）和4个测试样本电极（SE）各自的初始阻抗读数（单位：欧姆）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="10">
	<li>当读取器提示时，使用软键盘输入样品信息，完成后选择“Accept”。 
	注意：ECIS 读取器软件会自动为每个数据集添加日期、时间以及用户输入的其他信息，例如生物芯片编号、化学物质类型和浓度。将从插入的生物芯片收集 2 分钟的阻抗数据，屏幕上的计时器将倒计时剩余时间。</li>
	<li>两分钟后，当屏幕内红色框中闪烁的提示出现时，点击“NEXT”。当绿色框闪烁提示“Inject samples now”时，立即从连接的注射器中同时将对照和待测培养基注入生物芯片通道。注射完成后，将注射器保留在生物芯片上。 
	注意：阻抗值将每分钟采集一次，持续 60 分钟。如果 ECIS 读取器软件在实验开始后 10 至 60 分钟之间的任意时间点判断处理通道与对照通道存在统计学差异，则屏幕将显示该样品“Contaminated”（受污染）。如果处理通道与对照通道无显著差异，则测试结束时屏幕将显示“No Contamination Detected”（未检测到污染）。</li>
	<li>记录每个样品的测试结果，标明是否受污染。</li>
	<li>测试结束后，取下并丢弃生物芯片。清洗注射器、测试管及用于承载生物芯片的可拆卸塑料托盘，并使其自然风干。 
	注意：ECIS 读取器内置 4 GB 存储空间，用于存放操作软件、控制模型以及测试过程中生成的测试文件，可存储数千个测试文件。如需进行科研分析，可通过 U 盘将文件导出并传输至计算机。</li>
</ol>

<ol><li>Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Development and application of cell-based biosensors.</a> Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).</li>
<li>States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility-based+analytical+methods+to+ensure+public+water+supply+security%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Water+Works+Assoc%22%5BJournal%5D)">Utility-based analytical methods to ensure public water supply security.</a> J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).</li>
<li>Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly%2C+T+%22EPA%2F600%2FR-08%2F034%22">EPA/600/R-08/034</a>. , Washington, DC. 1-25 (2008).</li>
<li>van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+battery+of+rapid+toxicity+sensors+for+drinking+water+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).</li>
<li>Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+responses+of+a+melanophore+cell+line+to+chemical+contaminants+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water.</a> J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).</li>
<li>Curtis, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+invertebrate+and+vertebrate+cells+in+a+portable+impedance-based+toxicity+sensor%3A+temperature+mediated+impacts+on+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival.</a> Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).</li>
<li>Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+and+impedence-based+water+toxicity+testing+capabilities+of+fluidic+biochips+seeded+with+RTgill-W1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells.</a> Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).</li>
<li>Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+refinement+of+a+field-portable+drinking+water+toxicity+sensor+and+a+fluidic+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip.</a> J. Appl. Toxicol. , (2014).</li>
<li>O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+neuronal+networks+as+environmental+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cultured neuronal networks as environmental biosensors.</a> J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).</li>
<li>Eltzov, E., Marks, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+aquatic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Whole-cell aquatic biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li>
<li>Curtis, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+cell-based+impedance+sensor+for+toxicity+testing+of+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water.</a> Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).</li>
<li>Xiao, C., Luong, J. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cytotoxicity+by+emerging+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.Appl.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy.</a> Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).</li>
<li>Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+cell+sensor+assay+for+detection+of+cytotoxicity+and+prediction+of+acute+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity.</a> Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).</li>
<li>Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+potential+uses+of+fish+gill+cell+lines%3A+examples+with+RTgill-W1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Develop.+Biol.-+Animal%22%5BJournal%5D)">Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1.</a> In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).</li>
<li>RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Type+Culture+Collection+%28ATCC%29%22">American Type Culture Collection (ATCC)</a>. , Manassas, VA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c">https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c</a> (2015).</li>
</ol>

观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国陆军的立场。本报告中提及的商业机构或商品名称并不构成美国陆军对该机构产品或服务的官方认可或批准。作者 Linda M. Brennan 和 Mark W. Widder 均来自美国陆军环境健康研究中心，声明其无任何竞争性经济利益。Michael Mayo、Michael McAleer 和 Alex Greis 为 Nanohmics 公司员工，该公司生产本文所使用的 disposable biochips 和仪器。10251980

ECIS 技术在实验室环境中表现出色，能够检测与人类健康相关的水污染物潜在浓度。该技术的便携性和封装设计使其适用于野外应用。
确保该技术成功的关键步骤如下：1）在培养、接种和喂养生物芯片的过程中保持无菌条件；2）将接种后的生物芯片保存在冷藏条件下，直至准备进行测试，因为RTgill-W1细胞一旦暴露于高于25 °C的温度下将无法长期存活；3）准确称量粉末培养基小瓶中的L-15ex，并准确量取水样，以避免因培养基渗透压改变而非样品毒性引起假阳性结果；4）按照ECIS仪器屏幕上的用户说明运行测试。当生物芯片首次插入读数仪时，仪器内的软件会根据初始阻抗读数判断其是否适用于测试，并在生物芯片不符合要求时向用户发出提示。如果阻抗水平不符合测试要求，软件将不允许用户继续测试，直至更换新的生物芯片。阻抗读数不合格的原因通常为生物芯片电极与ECIS读数仪针脚之间存在轻微错位，或生物芯片封胶边缘出现液体泄漏。
该技术存在一些局限性，因为ECIS传感器仅在饮用水中进行过测试，尚未在地表水中验证。生物芯片上的RTgill-W1细胞无法耐受冷冻或长时间暴露于明显高于25 °C的温度（具体耐受时间范围取决于温度，可能从数小时到数天不等）。生物芯片在冷藏至室温范围内性能最佳7。从冷藏环境中取出后，可立即投入使用。目前，军队人员在野外使用便携式冷藏容器来运输对温度敏感的物资，这些容器同样可用于接种后的生物芯片运输。
该技术的另一个局限性在于，尽管它是一种宽带毒性传感器，但对于胆碱酯酶抑制类化合物（如某些农药）几乎没有响应或完全无响应。为了弥补这一能力上的不足，在检测水样时，可将ECIS传感器与一种市售的快速农药检测试剂盒联合使用，从而为用户提供更广泛的毒性检测能力。该试剂盒是一种快速酶法检测试剂，可在30分钟内检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。
ECIS 传感器可作为军事预防医学人员目前使用的 WQAS-PM（水质分析系统 - 预防医学）野外水质检测系统的补充，用于检测饮用水样本中的砷、铅或氰化物。尽管 ECIS 传感器无法确定污染物的具体种类，但它能够提示是否存在某些金属或有机化合物，从而表明该水样可能不适合人类饮用。ECIS 检测结果在 1 小时内即可获得。若检测结果呈阳性，可将水样送至实验室进行进一步分析，以确定污染物的具体成分。
如上所述，ECIS读数仪的设计旨在与单独的酶法ACE试剂盒配合使用，以覆盖更广泛的污染物检测。这两种读数仪都将被封装在一个坚固的箱体中，供士兵在野外运输和现场使用。

总体目标是开发一种用于ECIS生物传感器中流体生物芯片的细胞接种、储存和检测方法。该生物传感器的开发目标是满足美国陆军对野外便携式设备的要求，以检测士兵饮用水源可能受到的污染。毒性传感器的要求包括：能够在与人类健康相关的浓度下快速（一小时内）检测广泛类型的有毒工业化合物，设备需具备野外便携性，且其生物组件的保质期至少达到九个月。允许对易腐组件进行冷藏，但不得冷冻。
从历史上看，带有生物组分（如抗体、酶或核酸）的现场便携式水质检测技术通常针对特定分析物1-3。这类生物传感器的缺点在于每次只能检测一种化学物质。如果怀疑水中存在多种化学物质，则需要使用多个传感器。若检测项目中未包含某种特定传感器，水中的化学污染物就可能轻易地未被检出。
另一方面，广谱毒性传感器有望填补这一技术空白。这类传感器通常包含细胞组分4-8。广谱毒性生物传感器的优势在于，能够在相对较短的时间内检测出多种化学污染物的存在，包括混合物和未知物质5,9,10。
利用细胞单层的电学阻抗测量作为潜在毒性传感器的概念，也被称为细胞-基底电学阻抗传感技术（electric cell-substrate impedance sensing, ECIS），最早由Giaever和Keese11描述。在过去的二十年中，该技术已被证明是细胞活力和细胞毒性的敏感指标。基本原理是：贴附在生物芯片电极上的细胞单层被施加高频、低电压和低电流的交流信号。融合的细胞单层会阻碍电子的流动。当细胞单层的完整性受到破坏时（例如引入有毒化学物质），ECIS传感器会记录到电学阻抗的变化11-14。图1展示了ECIS技术与生物芯片上细胞单层之间关系的基本原理。
<img alt="膜片钳示意图；膜电容、锁相放大器、数据处理装置。" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：ECIS 原理。 生物芯片上细胞单层的示意图，附简化的 ECIS 读数器电路图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
最初，哺乳动物细胞系被接种于流体生物芯片中，并用于本文所述的ECIS传感器技术12。然而，这些细胞不适用于现场检测，因为它们需要频繁更换培养基，保质期有限，且必须在人工CO2环境和37 °C的培养温度下维持。研究发现，一种 commercially available 的源自虹鳟鱼鳃上皮细胞的细胞系（RTgill W-1细胞）可在室温及环境CO2条件下进行测试，在生物芯片中形成融合的单层细胞，可在冷藏温度下储存，并对与人类健康相关的多种化学物质在相关浓度下表现出快速响应（1小时或更短）12。Lee et al.15综述了RTgill-W1细胞在毒理学以及基础研究中的应用。
本文描述了在ECIS生物传感器中，于流体生物芯片上接种、储存和检测RTgill-W1细胞单层的方法。这些流体生物芯片可在冷藏条件下保存长达9个月，并可使用冷藏容器运输，用于饮用水供应的检测。配套的ECIS读数仪（即检测单元）需单独运输。生物芯片包含两个部分：上层为带有两个独立流体通道的聚碳酸酯层，下层为电子层，每个通道内含四个用于阻抗检测的电极垫。每个电极垫包含10个工作电极，每个电极直径为250 µm。组装后的生物芯片具有金电极连接点，插入ECIS检测单元后可获取阻抗读数。两个封闭的U形流体通道各自可容纳2 ml RTgill-W1细胞悬液。图2展示了置于ECIS读数仪中的流体生物芯片，以及单个传感电极上融合细胞的放大图示。
<img alt="微流控装置示意图、细胞培养室、250 µm 比例尺、显微镜、细胞分析。" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：ECIS 读板仪中的流体生物芯片。 放大区域显示 RTgill-W1 细胞在单个传感电极上形成的融合单层。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存。使用前于室温下解冻。作为完全L-15细胞培养基的组分（10%）。</td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>EMD Millipore Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.emdmillipore.com&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存。使用前于室温下解冻。与L-15培养基混合至浓度为10 &amp;#956;g/ml，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。用作生物芯片的包被基质。</td></tr><tr><td>不含L-谷氨酰胺的L-15培养基</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>细胞培养及生物芯片喂养的基础培养基。6 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>含酚红的L-15ex粉末培养基</td><td>US Biological&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usbio.net</td><td>L1501</td><td>将培养基按60 mg分装至0.1 dram小瓶中，置于含干燥剂的铝箔袋内，6 &amp;deg;C 保存。保质期九个月。测试时与10 ml水样混合用于生物芯片检测。</td></tr><tr><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;或Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的PBS</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>室温保存。用于胰蛋白酶消化细胞培养瓶时冲洗培养基。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存。室温解冻后用于消化细胞培养瓶。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T175培养瓶</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>用于培养RTgill-W1细胞。</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Chlorox&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.chlorox.com</td><td></td><td>用Milli-Q水或蒸馏水稀释至20%，用于清洁ECIS芯片。任何家用漂白剂均可使用。</td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td></td><td></td><td>用于消毒生物安全柜表面及放入生物安全柜内的所有材料。</td></tr><tr><td>虹鳟鱼鳃细胞（RTgill-W1）&amp;nbsp;</td><td>美国典型培养物保藏中心&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>用于生物传感器的细胞培养与接种（生物芯片接种）。</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1补充剂，200 mM</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>室温保存。&amp;nbsp;作为完全L-15细胞培养基的组分（1%）。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素储备液 10K/10K</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存。使用前于室温下解冻。作为完全L-15细胞培养基的组分（1%）。</td></tr><tr><td>Pharmed BPT管路</td><td>U.S. Plastic Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>切成27 mm长的段，高压灭菌。用于向生物芯片接种细胞，以及在更换培养基时形成封闭回路。</td></tr><tr><td>Pharmed管路组件用聚碳酸酯鲁尔接头</td><td>Value Plastics&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>固定于裁剪后的Pharmed管路两端，用于插入生物芯片。</td></tr><tr><td>20 ml滑动接头注射器</td><td>VWR Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>用于注入细胞悬液以接种ECIS芯片，以及用于芯片喂养。</td></tr><tr><td>0.1 dram带卡扣盖的聚丙烯微量管</td><td>Bottles Jars and Tubes, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>用于储存60 mg的L-15ex粉末培养基分装样品。</td></tr><tr><td>60 mil Lexan流体ECIS生物芯片</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>由Nanohmics, Inc.定制生产。将RTgill-W1细胞注入生物芯片，接种后的芯片置于ECIS读数仪中进行测试。</td></tr><tr><td>可高压灭菌塑料器械盒&lt;br/&gt; 17 1/2&quot; x 7 3/4&quot; x 2 3/8&quot;</td><td>Medi-Dose EPS&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>用于储存以下物品：高压灭菌后的堵头、清洁后的生物芯片、已接种的生物芯片。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>纸质热封灭菌袋，7 &amp;frac12;&amp;rdquo; x 13&amp;rdquo;</td><td>CardinalHealth&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>用于高压灭菌管路、接头和堵头。</td></tr><tr><td>Quantos自动粉末分装仪</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>自动将60 mg的L-15ex粉末分装至0.1 dram小瓶中。</td></tr><tr><td>ECIS读数仪</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>由Nanohmics, Inc.定制生产。将接种后的生物芯片插入读数仪中进行水质毒性测试。</td></tr><tr><td>3 x 5英寸金属化2.5 mil聚丙烯可重复封口袋</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>用于包装和储存已接种的生物芯片及L-15ex粉末培养基小瓶。</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.Amazon.com</td><td></td><td>用于打开粉末培养基小瓶。</td></tr><tr><td>1 g硅胶干燥剂袋&amp;nbsp;</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>与L-15ex粉末培养基小瓶一同放入聚丙烯袋中，防止粉末吸潮。</td></tr><tr><td>无菌250或500 ml Nalgene瓶</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>09-740-25C 或 E</td><td>在生物安全柜中用于盛装接种ECIS芯片的细胞悬液。</td></tr><tr><td>生物芯片堵头</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>由Nanohmics, Inc.定制生产。用于在6 &amp;deg;C 储存前封闭生物芯片的端口。</td></tr><tr><td>ECIS生物芯片排水管</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>由Nanohmics, Inc.定制生产。在插入ECIS读数仪前安装于生物芯片的两个内侧端口。&amp;nbsp;测试注射期间允许过量培养基从通道中排出。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>在调整细胞悬液浓度以注入生物芯片前，用于细胞计数。</td></tr><tr><td>带10X物镜的明场显微镜</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>任何明场显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td></td><td></td><td>任何可在无菌条件下进行细胞培养的II级生物安全柜均可使用。</td></tr><tr><td>0.6 ml微量离心管</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>在细胞计数前用于盛装1 ml细胞悬液。</td></tr><tr><td>10 cc红色滑动接头注射器</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>吸取9 ml测试水样并用于注入生物芯片。</td></tr><tr><td>10 cc蓝色滑动接头注射器</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>吸取9 ml对照水样并用于注入生物芯片。</td></tr><tr><td>&amp;frac12; oz. 透明PET塑料瓶，带白色带衬垫螺纹盖</td><td>SKS Bottle &amp;amp; Packaging, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>用于混合L-15ex粉末与10 ml水样进行测试。</td></tr><tr><td>50 ml无菌聚丙烯锥形离心管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>用于盛装40 ml的10 &amp;#956;g/ml纤维连接蛋白溶液，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>NIDS ACE乙酰胆碱酯酶抑制剂检测测试</td><td>ANP Technologies, Inc.&lt;br/&gt;www.anptinc.com</td><td>ACE-400</td><td>用于快速检测饮用水中农药的传感器</td></tr></tbody></table>

基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用rtgill-w1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法

关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，rtgill-w1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

本文描述了如何制备含有虹鳟鱼鳃上皮（RTgill-W1）细胞的流体生物芯片，用于现场便携式水质毒性传感器。RTgill-W1细胞在生物芯片内部的感应电极表面形成单层细胞。随后，这些生物芯片被用于现场便携式电子细胞-基底阻抗传感（ECIS）设备中，以快速检测饮用水的毒性。本文进一步介绍了如何使用制备好的生物芯片进行毒性测试。将对照水样和待测水样分别与预先称量的粉末培养基混合后，注入生物芯片的不同通道中。通过自动化统计软件程序测量并比较各生物芯片通道中感应电极的阻抗读数。在样品注入后一小时内，ECIS仪器屏幕将显示“检测到污染”或“未检测到污染”。该方法的优点在于操作简便，能够快速响应多种无机和有机化学物质，其检测浓度与人类健康风险相关，同时生物芯片在储存状态下具有长期稳定性，可随时用于测试。局限性在于生物芯片需要冷藏保存，且对胆碱酯酶抑制类农药的敏感性有限。该毒性检测装置的应用场景包括军队预防医学人员对饮用水源进行快速现场检测，或用于市政水处理设施的水质监控。

本文所述的ECIS技术已在美国环境保护署（USEPA）资助的技术测试与评估计划（TTEP）中进行了测试。选取了13种化学物质作为代表性物质进行检测，这些物质涵盖了一大类可能污染饮用水的有毒工业化合物。在测试过程中，其中有9种物质在对人体健康具有相关性的浓度水平下，可在1小时内被ECIS检测出8。表1展示了此次污染物检测的结果。图4代表了ECIS读数仪屏幕上显示“受污染”结果的典型图像。大多数情况下，受污染样品的细胞阻抗相较于对照组有所下降。但偶尔某些化合物也可能导致阻抗升高。
清洁水检测结果也汇总于表1中。共检测了40份清洁水样本，所有样本均未检出污染（见图5），图中为“未检出污染”的代表性截图。
<img alt="电化学阻抗谱图，温度35°C，污染分析，时间与阻抗关系。" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：受污染水样的ECIS读数截图。 来自受污染水样的归一化阻抗图示例。蓝色线条代表各对照电极的归一化阻抗；红色线条代表各测试样品电极的归一化阻抗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="归一化阻抗图，污染检测，时间与阻抗关系，35°C，结果分析。" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5：ECIS读数仪显示“未检测到污染”的水样截图。 一个未受污染水样的归一化阻抗图示例及检测结果。蓝色线条代表各个对照电极的归一化阻抗；红色线条代表各个测试样品电极的归一化阻抗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类别</td>
			<td>污染物</td>
			<td colspan="3">测试浓度（mg/L）1</td>
			<td colspan="2">1小时内检测到       
			n = 4/4 芯片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">农药</td>
			<td>Aldicarb</td>
			<td colspan="3">0.17</td>
			<td colspan="2">无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>砷（亚砷酸钠）</td>
			<td colspan="3">4.5</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>叠氮化物（叠氮化钠）</td>
			<td colspan="3">46.7</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>芬胺磷</td>
			<td colspan="3">0.56</td>
			<td colspan="2">无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲胺磷</td>
			<td colspan="3">1.4</td>
			<td colspan="2">无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对硫磷甲酯</td>
			<td colspan="3">33.6</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>百草枯（二氯化物）</td>
			<td colspan="3">4.6</td>
			<td colspan="2">无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>五氯苯酚钠</td>
			<td colspan="3">71.9</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">工业化学品</td>
			<td>氨</td>
			<td colspan="3">924</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铜（硫酸铜 II）</td>
			<td colspan="3">103</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氰化物（钠）</td>
			<td colspan="3">14</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>汞（氯化物）</td>
			<td colspan="3">24.7</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲苯</td>
			<td colspan="3">444</td>
			<td colspan="2">是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清洁水2</td>
			<td>无</td>
			<td colspan="3">NA</td>
			<td colspan="2">无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">1测试的浓度与Widder论文中所使用的相同， 等. (2014).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">240 个洁净水样未检出污染。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过ECIS检测到的水样中的污染物。

本文描述了如何制备含有虹鳟鱼鳃上皮细胞的流体生物芯片，并将其用于便携式电细胞-基底阻抗传感器。同时还介绍了利用该传感器进行快速饮用水毒性检测的实验方案。

基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用RTgill-W1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法

关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

本文描述了如何制备含有虹鳟鱼鳃上皮（RTgill-W1）细胞的流体生物芯片，用于便携式水质毒性检测……

本实验的总体目标是演示如何利用生物传感器评估饮用水样品的毒性。该方法通过制备含有虹鳟鱼鳃细胞单层的生物芯片，并将其用于基于阻抗的生物传感器中来实现。该技术能够快速检测饮用水中与人类健康相关的化学毒性水平。该技术的主要优势在于，这些生物芯片可在野外条件下使用，细胞在冷藏状态下可保存长达九个月而无需任何护理或维护，并且芯片处于随时可用的待测状态，从冷藏环境中取出后可立即使用。本实验操作将由本实验室的本科生 Jordan McNairn 进行演示。细胞接种前一天，从包装中取出生物芯片，并将其放入已灭菌的塑料器械盒中。将其中一个管路组件连接到注射器上，并用20毫升注射器吸取20%的次氯酸钠溶液。将2毫升该溶液注入生物芯片的每个通道中。完成后，让生物芯片在次氯酸钠溶液中静置一小时。一小时后，使用装有一端为直螺纹鲁尔接头并连接至真空管路的无菌1毫升注射器，从两个通道中抽吸次氯酸钠溶液。从生物芯片中抽吸次氯酸钠后，将一端带有直螺纹鲁尔接头的无菌管路组件连接至生物游戏副本，作为冲洗时的排液通道。随后，用20毫升注射器吸取无菌水，对芯片的每个通道各用5毫升水冲洗。同前次一样，用真空泵抽吸去除水分，并将生物芯片放回塑料仪器盒中。将生物芯片留在生物安全柜中直至第二天。在接种生物芯片前一小时，向每个生物芯片的通道中注入两毫升浓度为每毫升10微克的纤连蛋白溶液。将生物芯片在生物安全罩内孵育60分钟，然后用真空抽吸除去纤连蛋白溶液。最后，将两套无菌生物芯片管路组件安装到生物芯片的端口上，并将生物芯片放置一旁，待细胞准备就绪后进行接种。 从培养箱中取出一个含有虹鳟鱼鳃上皮细胞的汇合T-175培养瓶，放入生物安全柜中。一个汇合的T-175培养瓶可接种约16个生物芯片。吸除细胞中的培养基。用 PBS 清洗，吸去 PBS。然后向细胞层加入 6 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养瓶在室温下孵育约 5 分钟。然后，向每个培养瓶中加入 15 毫升完全 L-15 细胞培养基，以中和胰蛋白酶。取少量细胞悬液，用血细胞计数板测定细胞浓度。使用配备 10 倍物镜的明场显微镜观察细胞。然后，计算当前细胞浓度，并将细胞悬液调整至每毫升25万个细胞的浓度。接着，使用无菌的20毫升注射器将2.5毫升细胞悬液注入生物芯片每个通道的外侧端口。让多余的细胞悬液通过管路流入废液容器中。然后，将带有鲁尔接头的软管自由端插入每个通道的外侧端口，为每个生物芯片通道创建一个封闭回路。接着，用70%乙醇润湿一张纸巾，擦拭封闭回路上多余的培养基。然后，将生物芯片放回塑料盒中。在第4天和第7天，从培养箱中取出生物芯片，并用温度平衡的完全L-15细胞培养基更换生物芯片中的培养基。第7天换液后，移除并丢弃芯片上的软管，将高压灭菌排水塞插入生物芯片中。将生物芯片放入盒中，并置于6 °C的培养箱内，直至用于检测。从携带箱中取出ECIS检测仪及相关耗材，然后开启检测仪。同时，从6 °C的培养箱中取出一块预先制备的生物芯片，放置在纸巾上。使用一个10毫升注射器，将10毫升对照水加入已标记的0.5盎司透明塑料对照瓶中。务必去除气泡以确保准确测量。然后，使用另一个注射器将10毫升测试样品加入一个0.5盎司的透明塑料测试瓶中。接下来，取出两个粉末状培养基小瓶。打开其中一个粉末状培养基小瓶，将整瓶内容物倒入装有对照水的容器中，同时将空瓶也一并投入溶液中。对测试容器重复此操作。然后，盖紧罐子并摇晃，以确保粉末完全溶解。用蓝色10毫升注射器从相应的试剂瓶中抽取9毫升对照溶液，用红色10毫升注射器从相应的试剂瓶中抽取9毫升待测溶液。从注射器中清除所有已存在的气泡。接着，移除生物芯片端口的密封塞，并连接排水管。将生物芯片放入ECIS读板仪的可移动塑料托盘中，盖上盖子，然后将装满液体的注射器连接到生物芯片外侧的端口上。最后，安装注射器推杆。从读取仪的主界面选择“下一步”以启动预测试。软件将检测初始阻抗。如果阻抗在正常范围内，屏幕将显示“试剂盒通过”，并提示用户选择“下一步”。然后，使用软键盘输入样本信息，完成后选择“确认”。此时，将从插入的生物芯片收集两分钟的阻抗数据，屏幕上的计时器将倒计时剩余时间。两分钟后，点击“下一步”。当出现闪烁的绿色提示框要求“立即注入样品”时，从连接的注射器中同时将对照介质和测试介质注入生物芯片通道中。注入完成后，将注射器保留在生物芯片上原位不动。如果 ECIS 读板软件在测试过程中的任何时间点判定处理通道与对照通道之间存在统计学差异，屏幕显示将提示样本被污染；否则，在监测期结束时将提示未检测到污染。对每个样本的测试结果记录为“污染”或“未污染”。测试运行结束后，取出并丢弃生物芯片。用清水冲洗注射器、测试管以及用于固定生物芯片的可拆卸塑料托盘，并将其晾干。此处列出的13种化学物质被选为测试对象，代表了可能污染饮用水的多种有毒工业化合物。在检测过程中，13个样本中有9个在与人类健康相关的浓度下，于一小时内通过细胞电学基底阻抗传感技术被检出。此处展示了进行细胞电学基底阻抗传感测试后典型的输出结果。与对照的洁净水样本相比，受污染样本的阻抗水平显著降低。观看本视频后，您应能充分了解如何制备负载虹鳟鱼鳃上皮细胞单层的生物芯片，并进一步利用该生物芯片开展基于阻抗的毒性检测，以评估饮用水的毒性。在进行该实验操作时，必须注意在制备生物芯片过程中保持无菌操作，并在使用前将生物芯片冷藏保存。每枚生物芯片仅可使用一次，之后必须丢弃。一旦掌握，生物芯片的制备可在约10分钟内完成。此时间为估计值，因为芯片是批量制备的。若操作得当，样品阻抗测试（包括样品准备）大约需要1小时10分钟。通过该方法，可对产生污染结果的样品进一步开展分析化学等其他检测，以鉴定疑似存在的化学物质或多种化学物质。该技术的开发为致力于水质毒性传感的研究人员提供了利用虹鳟鱼鳃上皮细胞及阻抗传感技术的新途径。我们希望您能发现这些技术的实用价值，并期待这些新能力有助于推动未来的创新进展。谢谢，祝您有美好的一天。

preparation-testing-impedance-based-fluidic-biochips-with-rtgill-w1

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

准备和测试阻抗为基础与RTgill-W1细胞饮用水进行快速评估水样进行毒性射流生物芯片

在本视频中，我们演示了实时监测细胞事件的过程，包括贴壁细胞的增殖 通过...

基于细胞阻抗的实时细胞过程监测分析

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

一种用于检测水样（包括处理后的废水中和地表受纳水）有机提取物内分泌活性的方案，已通过商业可得的分裂阻滞法（“冻融”法）进行改良。 体外...

使用市售试剂盒检测水中内分泌活性 体外 转录激活生物测定

采用低成本干膜光刻胶技术设计并制备了一种微流控生物传感器平台，用于多种分析物的快速、高灵敏度定量检测。该一次性使用系统通过停流技术实现对芯片上固定的酶联检测方法进行电化学读出。...

基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

本方案描述了一种通用策略，用于再生市售的阵列式金微电极，该电极专为无标记细胞分析仪设计，旨在降低基于微芯片检测的高昂运行成本。再生过程包括胰蛋白酶消化、乙醇和水冲洗以及离心步骤，可实现微芯片的重复使用。...

用于实时细胞分析仪的阵列式金微电极的再生

本文介绍了一种集成电极的器官芯片装置的制备方法，用于直接定量跨内皮细胞电阻（TEER）。为验证该方法，利用该微流控装置模拟了血脑屏障，并对其屏障功能进行了监测。所提出的电极集成与直接TEER定量方法具有广泛的适用性。...

集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

基于电润湿的数字微流控技术是一种利用电压驱动微升体积液滴的表观接触角变化来实现液滴操控的方法。将该技术与功能化磁珠相结合，可集成多种实验室单元操作，用于基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的病原体样本制备与鉴定。...

基于电润湿的数字微流控平台用于自动化酶联免疫吸附测定

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

我们介绍一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。该实验设计通过监测细胞电阻抗的变化，采用实时细胞分析技术。可在复杂组织中捕获侵袭性癌细胞、免疫细胞、内皮细胞或间质细胞，并评估共培养的影响。...

共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

本研究利用细胞电阻抗传感技术（ECIS）——一种实时、高通量的筛选方法，评估了一种选定金属-有机框架材料的毒理学特征。...

用于实时评估金属有机框架毒理学特征的细胞电子基底传感技术

我们的详细方案概述了先进的肠芯片模型的构建与使用方法，该模型可模拟具有三维结构和多种细胞类型的肠黏膜，从而能够深入分析微生物定植引发的免疫反应和细胞功能。...

用于分析肠道黏膜免疫反应的免疫健全肠芯片模型

学习使用虹鳟鱼鳃上皮细胞制备生物芯片，并通过阻抗传感器快速检测饮用水中的化学毒性。该方法可在野外条件下进行，芯片冷藏保存九个月仍保持活性，为环境健康评估提供实用解决方案。

基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用RTgill-W1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

探索更多视频

基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用RTgill-W1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法 关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

探索更多视频

基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用RTgill-W1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析