基于阻抗的流体生物芯片的制备与检测及使用RTgill-W1细胞快速评估饮用水样品毒性的方法 关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

本实验的总体目标是演示如何利用生物传感器评估饮用水样品的毒性。该方法通过构建含有虹鳟鱼鳃细胞单层的生物芯片，并将其用于基于阻抗的生物传感器中来实现。该实验方案提供了一种快速检测饮用水中化学毒性的方法，其检测水平与人类健康密切相关。

该技术的主要优势在于，这些生物芯片可在野外条件下使用，细胞在冷藏条件下无需任何护理或维护即可保存长达九个月，且芯片处于随时可用的待测状态，从冰箱取出后可立即使用。本实验操作将由本实验室的本科生 Jordan McNairn 进行演示。细胞接种前一天，将生物芯片从包装中取出，并放入已灭菌的塑料器械盒中。

将其中一个管路组件连接到注射器上，并用20毫升注射器吸取20%的次氯酸钠溶液。将2毫升该溶液注入生物芯片的每个通道中。完成后，让生物芯片在次氯酸钠溶液中静置一小时。

一小时后，使用装有公型滑入式鲁尔接头并连接至真空管线的无菌1毫升注射器，从两个通道中吸出次氯酸钠溶液。从生物芯片中吸出次氯酸钠溶液后，将一端带有公型滑入式鲁尔接头的无菌管路组件连接至生物芯片，作为冲洗芯片时的排水装置。然后，用20毫升注射器抽取无菌水，向芯片的每个通道注入5毫升水进行冲洗。

如前所述，用真空泵抽吸去除水分，并将生物芯片放回塑料仪器盒中。将生物芯片留在生物安全柜中直至第二天。

在接种生物芯片前一小时，向每个生物芯片的通道中注入2毫升浓度为10微克/毫升的纤连蛋白溶液。将生物芯片置于生物安全罩内孵育60分钟，随后用真空抽吸法除去纤连蛋白溶液。最后，将两套无菌生物芯片管路组件安装到生物芯片的端口上，并将生物芯片放置一旁，待细胞准备就绪后进行接种。

从培养箱中取出一个含有虹鳟鱼鳃上皮细胞的汇合T-175培养瓶，放入生物安全柜中。一个汇合的T-175培养瓶可接种约16个生物芯片。吸除细胞中的培养基。

用 PBS 清洗，吸去 PBS。然后向细胞层中加入 6 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养瓶在室温下孵育约 5 分钟。

然后，向每个培养瓶中加入 15 毫升完全 L-15 细胞培养基以灭活胰蛋白酶。从细胞悬液中取少量等分试样，使用血细胞计数板测定细胞浓度。使用配备 10 倍物镜的明场显微镜观察细胞。

然后，计算当前细胞浓度，并将细胞悬液调整至每毫升25万个细胞的浓度。接着，使用无菌的20毫升注射器将2.5毫升细胞悬液注入生物芯片每个通道的外侧端口。让多余的细胞悬液通过管路流入废液容器中。

然后，将软管带有鲁尔接头的自由端插入每个通道的外端口，为每个生物芯片通道创建一个封闭回路。接着，用70%乙醇浸湿一张纸巾，擦拭封闭回路上多余的培养基。然后，将生物芯片放回塑料盒中。

在第4天和第7天，从培养箱中取出生物芯片，并用温度平衡的完全L-15细胞培养基更换芯片中的培养基。第7天换液后，移除并丢弃芯片上的软管，将高压灭菌的封堵塞插入生物芯片中。

将生物芯片放入盒中，并置于6 °C的培养箱内，直至用于检测。从携带箱中取出ECIS检测仪及相关用品，然后开启检测仪。同时，从6 °C的培养箱中取出一块预先制备的生物芯片，放置在纸巾上。

使用一个10毫升注射器，将10毫升对照水加入已标记的0.5盎司透明塑料对照瓶中。务必去除气泡以确保准确测量。然后，使用另一个注射器，将10毫升测试样品加入一个0.5盎司的透明塑料测试瓶中。

接下来，取两个粉末状培养基小瓶。打开其中一个粉末状培养基小瓶，将整瓶内容物倒入装有对照水的容器中，同时将整个空瓶也投入溶液中。对测试用容器重复此操作。

然后，盖紧罐子并摇晃，以确保粉末完全溶解。用蓝色10毫升注射器从相应的样品瓶中抽取9毫升对照溶液，用红色10毫升注射器从相应的样品瓶中抽取9毫升测试溶液。

从注射器中去除所有已存在的气泡。接着，移除生物芯片端口的塞子并连接排水管。将生物芯片放入ECIS读板仪的可拆卸塑料托盘中，盖上盖子，然后将装满液体的注射器连接到生物芯片外侧的端口上。

最后，安装注射器推杆。从读板仪的主界面选择“下一步”以启动预测试。软件将检测初始阻抗。

如果阻抗在正常范围内，屏幕将显示“试剂盒通过”，并提示用户选择“下一步”。然后，使用软键盘输入样品信息，完成后选择“确认”。此时，将从插入的生物芯片收集两分钟的阻抗数据，屏幕上的计时器将倒计时剩余时间。

两分钟后，点击“下一步”。当出现闪烁的绿色提示框要求“立即注入样品”时，将连接在注射器上的对照介质和待测介质同时注入生物芯片通道中。注射完成后，将注射器保留在生物芯片上原位不动。

如果ECIS读取软件在测试期间的任意时间点判定处理通道与对照通道之间存在统计学差异，则屏幕显示将提示样品已被污染。否则，在监测期结束时将提示未检测到污染。对每个样品的测试结果记录为“污染”或“未污染”。

测试运行结束后，取出并丢弃生物芯片。用清水冲洗注射器、测试小瓶以及用于固定测试期间生物芯片的可拆卸塑料托盘，并将其晾干。此处所示的13种化学物质被选为测试对象，代表了可能污染饮用水的多种有毒工业化合物。

在检测过程中，13个样本中有9个在与人类健康相关的浓度下，于一小时内被电细胞基底阻抗传感技术检测出。此处展示了电细胞基底阻抗传感测试后典型的输出结果。与对照的洁净水样本相比，受污染样本的阻抗水平显著降低。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何制备负载虹鳟鱼鳃上皮细胞单层的生物芯片，并进一步利用该生物芯片开展基于阻抗的毒性检测，以评估饮用水的毒性。在尝试该实验流程时，必须注意在制备生物芯片过程中实行无菌操作，并在使用前始终将生物芯片置于冷藏环境中。每枚生物芯片仅可使用一次，之后必须丢弃。

一旦掌握，生物芯片的制备可在约10分钟内完成。此时间为估计值，因为芯片是批量制备的。样品阻抗测试，包括样品准备，若操作得当，大约需要1小时10分钟。

采用此方法后，可对产生污染结果的样品进行其他分析，例如分析化学方法，以鉴定可疑的一种或多种化学物质。该技术的开发为致力于水质毒性检测的研究人员铺平了道路，使其能够利用虹鳟鱼鳃上皮细胞与阻抗传感技术。我们希望您能发现这些技术具有实用价值，并期待这些新能力有助于推动未来的创新。

谢谢，祝您有美好的一天。