纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

本方案的总体目标是检测纤毛突变小鼠耳蜗中是否存在平面细胞极性表型。这些技术可对耳蜗表型进行详尽描述，从而更精确地理解纤毛在建立脊椎动物平面细胞极性（PCP）信号通路中的作用。本方案的主要优势在于，一旦掌握后，分离得到的耳蜗上皮组织可用于多种不同类型的表型分析。

在准备实验动物的试剂和组织后，于发育阶段 E16.5 至 p3，使用手术刀片或小型剪刀从鼻部开始沿矢状中线向枕骨大孔方向解剖头部。用镊子从颅骨的每一半中取出脑组织。随后，辨认包含正在发育的内耳骨迷路的颞骨。

在解剖显微镜下操作样本时，使用镊子轻轻插入骨迷路下方，将骨迷路从颅骨上分离。解剖完成后，用解剖镊的尖端清理卵圆窗和圆窗，并在耳蜗螺旋的顶端打一个小孔。随后，将骨迷路置于1.5毫升的4%多聚甲醛中，在冰上固定5分钟，以便于后续顺利去除盖膜。

现在，将骨迷路置于含有 PBS 的黑色硅胶弹性体包被的解剖皿中，以利于解剖操作。使用5号镊子去除外层软骨，暴露耳蜗管。从卵圆窗开始，将镊子的尖端插入卵圆窗，轻轻撬开软骨，并缓慢向上朝顶端移动。

接下来，使用精细的镊子夹住蜗管基部的前庭膜，并以向上的动作将其剥离。观察蜗管的背侧，包括感觉上皮。然后，使用55号镊子夹住耳蜗基部的盖膜，并从基部向顶端方向向上剥离。

为了获得最佳的免疫组织化学图像，必须完全去除盖膜，而扫描电子显微镜观察则必须去除盖膜。暴露柯蒂器官后，进一步固定组织并进行免疫组织化学染色，或按本方案文字部分所述准备扫描电子显微镜样品。组织染色完成后，将样品置于含有PBS的黑色硅胶弹性体培养皿中。

使用精细镊子，从耳蜗螺旋中去除前庭区域。然后，非常小心地去除耳蜗螺旋下方的软骨和间充质。剩余的耳蜗螺旋包含内沟、柯蒂器官和外沟。

将耳蜗螺旋转移至载玻片上的一滴磷酸盐缓冲液（PBS）中。用吸水纸或滤纸吸去多余的PBS，若上皮组织发生移位并相互重叠，需轻轻调整耳蜗螺旋的位置。在耳蜗样本上直接加入一滴封片介质，并轻轻将盖玻片覆盖在样本上，注意避免产生气泡。

使用配备高倍率和高数值孔径物镜的落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜，采集耳蜗毛细胞顶面的图像。使用较低倍率的物镜拍摄耳蜗螺旋的重叠图像，以定量测量耳蜗管的长度。以下图像显示了出生后第一天基底回型耳蜗的免疫荧光染色结果。

鬼笔环肽标记毛细胞静纤毛中的丝状肌动蛋白以及细胞周边的皮质肌动蛋白。Myosin VIIA 是内毛细胞和外毛细胞的标志物。ZO_1 标记细胞间的紧密连接，是区分细胞边界的理想标志物。

乙酰化α-微管蛋白用作束顶动纤毛的标记物，如白色箭头所示。内部微管也由乙酰化α-微管蛋白标记，在支柱细胞中尤为丰富，如白色星号所示。该E18.5期解剖的耳蜗管图像经乙酰化微管蛋白染色后显示，IFT20条件性敲除小鼠的耳蜗管较对照组明显缩短。

下图是出生后第零天的BBS8基因敲除小鼠耳蜗基底转的全 mount 制备图像。BBS8基因敲除小鼠耳蜗中的静纤毛束表现出不同程度的旋转，如右箭头所示，或呈扁平化且定位异常，如中间箭头所示。动纤毛定位异常，或轴丝缺失，如左箭头所示。

在准备用于分析的耳蜗表型时，需要注意遗传背景的差异可能会影响耳蜗表型。因此，分析时应使用同窝出生的对照动物。进一步的分析包括听力测定以及耳蜗外植体的培养，后者可接受各种信号激活剂或抑制剂处理，从而有助于阐明相关发育过程的作用机制。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备耳蜗组织，以分析纤毛组分在平面细胞极性（PCP）信号通路中的作用及其各自的影响。