全山解剖和成年小鼠耳蜗的免疫

我们提出了一个方法，以分离科尔蒂的成年器官三个完整耳蜗匝（先端，中间，和碱）。我们还演示了一个程序，用荧光标记的抗体免疫染色。连同这些技术允许毛细胞，支持细胞，以及其他细胞类型中的耳蜗研究发现。

这种全支架解剖方法的总体目标是将钙化成人耳蜗的感觉区域分离为三个完整的转弯：顶端、中部和基部。这种解剖方法保留了 Corti 器官的三维结构，当与免疫染色和共聚焦显微镜相结合以在 Z 轴的不同平面上成像时，允许所有细胞的可视化。与以前的解剖方法相比，我们使用不同的策略来产生三个耳蜗转，这些转圈更大，在免疫染色过程中不太可能丢失或损坏。

这种方法的视觉演示至关重要，因为解剖很难学习。因为 Corti 的器官很脆弱，所以在切除螺旋韧带时有很小的误差余地。根据批准的程序对动物实施安乐死并取出大脑后，首先确定小鼠头骨底部的颞骨。

然后使用标准图案镊子刮掉颅神经。将镊子放在耳囊的尖端，用另一只手的拇指向下按压后半规管，以去除包膜的耳蜗。用拇指和食指手动或使用 10.5 厘米的细剪刀将颞骨的下半部分从颅骨中释放出来，并放入无甲醇电子显微镜下 4% 多聚甲醛进行固定。

固定后，根据方案书面部分的说明对颞骨进行脱钙。为了确定样品是否充分脱钙，将颞骨放在涂有硅橡胶的解剖皿上，然后用镊子轻轻压在蜗牛形耳蜗上。如果组织是海绵状的，则脱钙完全。

将 PBS 加入解剖皿中，然后在立体解剖显微镜下工作时，使用 4 号或 5 号镊子将颞骨固定在前庭区域，并使用 5 毫升 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀沿侧面和根尖上方切掉多余的耳囊组织。使用 2.5 毫升 Vannas 弹簧剪刀，将一个刀片插入椭圆形窗口，并沿着基底转动的螺旋韧带进行几次小切割。现在，将 5 毫升 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀的一个刀片插入刚刚切割的区域，然后将另一个刀片放在颞骨的外侧，椭圆形窗口的内侧。

这个切口将基部转弯与中间和顶端转弯分开。接下来，要完成基底转动的解剖，请使用 2.5 毫升弹簧剪刀剪断连接到 modiolus 的螺旋神经节神经纤维，以释放基底转动中的张力。切开基底轮以下，与前庭器官分离。

使用镊子引导组织并将螺旋神经节纤维固定到硅胶弹性体涂层培养皿上。进行一系列小切口，以去除 Corti 器官上方和下方的螺旋韧带。将螺旋神经节纤维固定在硅胶弹性体涂层培养皿上，使用镊子从 Corti 器官中取出任何残留的 Reissner 膜。

进行几次切割以减少螺旋神经节轴突的厚度。然后用镊子抓住螺旋神经节的剩余轴突，并将解剖的基底转向含有约 500 微升 PBS 的 48 孔板中。现在，首先将耳蜗顶端的剩余三分之二侧朝下，将中间和顶端分开。

然后将 2.5 毫升剪刀的一把刀片插入鳞片介质中，其中中间转弯先前连接到基底转弯，并沿着中间转弯的螺旋韧带进行几次切割。使用 5 毫升剪刀，将一把刀片插入切割区域，中间的一圈放在刀片的顶部。将另一个刀片放在骨迷宫的外侧，与顶端成 90 度角。

这个切口将中间转弯与顶端转弯分开。接下来，通过从 Corti 器官中取出螺旋韧带来完成中转的解剖。像以前一样，将解剖的转身转移到 48 孔板中。

现在，使用 2.5 毫升 Vannas 弹簧剪刀打开覆盖根尖转动的盖子，然后重复该过程以从 Corti 器官中取出根尖转动螺旋韧带。像以前一样，将解剖的转身转移到 48 孔板中。要开始免疫染色程序，首先从每个孔中吸出 PBS，然后更换为 200 至 300 μL 封闭溶液，并在室温下在 3D 旋转器上孵育 1 小时。

孵育时间过后，去除封闭溶液，用 100 μL 一抗替换，在载体溶液中适当稀释。在 4 摄氏度下在 3D 旋转器上孵育过夜。第二天，去除一抗溶液，并在室温下用 500 μL PBS 洗涤每个孔，每次至少 5 分钟。

重复洗涤两次。最后一次洗涤后，吸出 PBS，注意不要吸吮移液器吸头中解剖的转身。用每孔 100 μL 的荧光标记二抗替换，该二抗在载体溶液中稀释。

将 48 孔板置于黑盒中避光，并放在 3D 旋转器上，在室温下孵育 2 至 3 小时。孵育后，吸出二抗溶液，并像以前一样用 PBS 洗涤 3 次。去除最后一次洗涤后，加入 100 微升 Hoechst 以标记细胞核。

避光，在室温下在 3D 旋转器上孵育 15 至 20 分钟。最后，去除 Hoechst 溶液，并像以前一样用 PBS 洗涤 3 次。标记每张载玻片后，将 50 微升封固剂吸取到每张载玻片上。

然后使用 4 号或 5 号直珠宝商的镊子，抓住螺旋神经节的轴突，轻轻地将 48 孔板的耳蜗转动一次转移到安装介质上。使用显微镜确保解剖的车削没有折叠或扭曲。将盖玻片的一端放在载玻片上，然后轻轻松开，让盖玻片落下。

使用立体解剖显微镜确保耳蜗转动不位于气泡附近。如果发生这种情况，请轻轻地来回移动盖玻片以重新定位人工耳蜗转动。对其他耳蜗转动重复该过程。

每张载玻片安装一圈人工耳蜗，以防止成像过程中的光照和光漂白。将幻灯片放在幻灯片文件夹中，使其平放。避光，让封片剂在室温下固化过夜。

第二天，用透明指甲油密封盖玻片，并在室温或 20 摄氏度下储存直至成像。该共聚焦切片图像显示了从 p15 小鼠中分离的耳蜗中间转。叠加 420X 图像以重建整个中间转弯。

用兔抗肌球蛋白 VIIa 一抗和 Alexa 647 偶联二抗标记的毛细胞呈品红色。用山羊抗 SOX2 一抗和 Alexa 568 偶联二抗标记的支持细胞显示为绿色。由于 Hoechst 染色，细胞核呈蓝色。

比例尺代表 100 微米。该图显示了在 X、Z 平面上与一只 6 周龄的小鼠隔离的中间转弯的光学横截面。同样，毛细胞用洋红色荧光团标记，支持细胞用绿色荧光团标记。

这是前一图像的放大倍数增加，其中移除了十字线。比例尺代表 20 微米。以下四张图片显示了整个安装器解剖过程中或安装人工耳蜗打开载玻片时可能出现的一些问题。

在这里，在图像的左侧，耳蜗组织被切割在最后一排外毛细胞旁边，导致其中许多细胞以不同的角度安装。在这张图片中，左侧 Corti 器官的一部分已被切断。在图像中间的外部毛细胞区域打了一个孔。

在这里，Corti 的器官在几个地方折叠起来。一旦掌握，整个安装解剖技术可以在 20 到 30 分钟内完成。在执行此程序时，重要的是要避免将镊子放在 Corti 的器官上，并避免拉扯或抓住螺旋韧带。

相反，关闭镊子并将螺旋神经节纤维固定到硅胶弹性体涂层培养皿上。来自 1 到 3 周龄小鼠的样本更宽容，有助于学习解剖方法。此外，毛细胞受损的样本更难解剖，噪声暴露的组织尤其困难和脆弱。

在此解剖程序之后，可以执行其他方法，例如扫描电子显微镜。但是，需要一种不同的固定剂。此外，我们对该方案进行了轻微的修改，用于解剖大鼠耳蜗组织，将来，我们希望进一步修改用于解剖龙猫、沙鼠和豚鼠的耳蜗。