Au- Slp1 聚合物与单层膜的相互作用 Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D、ICP-MS 和 AFM 作为生物分子-金属相互作用研究的工具

本实验的总体目标是从生态学和工艺技术角度，研究该细菌菌株表面层蛋白对金的吸附行为。这些方法可用于解答环境相关科学领域的关键问题，例如吸附过程以及金属的去除与回收。这些技术的主要优势在于，能够在另一个尺度范围内检测金属吸附和纳米颗粒的吸附现象。

通过使用QCM-D，可以在实时测量中检测到这一点。开始此操作时，使用传感器假体装配流体池。将至少20毫升每模块的2%碱性液体清洁剂溶于超纯水中，通过QCM-D和管路系统进行泵送。

随后，按照制造商方案，以每分钟每模块不超过 300 微升的流速，向系统中泵入每模块五倍体积的超纯水。将流路模块外部的二氧化硅传感器置于 2% 十二烷基硫酸钠溶液中孵育至少 20 分钟进行清洗。然后，用超纯水多次冲洗传感器。

用过滤的压缩空气干燥晶体后，将其放入臭氧清洗室中处理20分钟。随后，重复清洗步骤两次，以彻底去除所有有机物。为去除传感器表面结合的金属，需用1摩尔硝酸冲洗传感器。

然后用超纯水将传感器冲洗数次。接着，通过浸涂法采用逐层（LBL）技术，使用每升含三克的聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸交替层对传感器进行修饰。将传感器置于深孔板中的相应聚电解质溶液内，在室温下孵育10分钟。

然后，将传感器从聚电解质溶液中取出，并在每次浸涂步骤之间用超纯水彻底冲洗。外部修饰完成后，将传感器放入流动模块中。实验开始前，先用超纯水冲洗传感器以使其达到平衡状态。

此时，将先前分离纯化的 Slp1 溶解于变性液尿素中，以使聚合物转化为单体。将单体化的蛋白质在 15,000 × g 离心力下、4 °C 条件下离心 1 小时，以去除较大的蛋白质聚集体。将溶解并离心后的 Slp1 上清液与重结晶缓冲液混合，使最终蛋白质浓度达到 0.2 克/升。

在流动模块内经聚电解质修饰的传感器表面成功实现蛋白质重结晶后，使用重结晶缓冲液以每分钟125微升的流速对包被的传感器进行充分冲洗，直至检测到频率和耗散变化值稳定。在流动模块中成功包被Slp1后，使用pH为5.0的1.6毫摩尔柠檬酸盐缓冲液对所得Slp1层进行充分冲洗，直至频率和耗散变化值稳定。随后，以每分钟125微升的流速将预先配制的1毫摩尔纳米粒子溶液泵入流动模块中。

然后，追踪质量吸附至 Slp1 层的过程。完成金属纳米颗粒相互作用后，用不含纳米颗粒的缓冲液冲洗该层，以去除弱结合的金属或纳米颗粒。使用带有倒置光学显微镜的原子力显微镜（AFM），在涂覆的 QCM-D 传感器上直接利用超纯水在液体环境中记录图像。

QCM-D 实验结束后，用超纯水冲洗传感器，并将其放入原子力显微镜的液体池中。选择在水中共振频率约为 25 千赫、弹性系数小于 0.1 牛顿/米的悬臂。调节扫描速度在 2.5 至 10 微米/秒之间。

在压电陶瓷以共振频率激发悬臂梁的条件下，采用动态接触模式采集图像。最后，通过振荡阻尼确定悬臂梁与表面之间的距离。金三价离子在悬浮 Slp1 蛋白上的最大结合容量表明，在所考察的 pH 范围内，该蛋白在 24 小时孵育期间保持稳定结合。

频率的立即下降表明蛋白质对聚电解质修饰表面具有快速吸附性和高亲和性。耗散也立即增加，表明黏弹性分子吸附到表面，导致因快速阻尼而耗散值上升。将预先合成的金零维纳米颗粒与Slp1孵育后进行SDS-PAGE分析，结果验证了QCM-D数据，显示纳米颗粒不会干扰Slp1的结构。

通过QCM-D实验中的ΔF-ΔD图以及厚度和质量分布图，展示了预合成的金属金零价纳米颗粒的吸附情况。图中显示了在聚电解质修饰的传感器上重结晶的Slp1蛋白晶格，其晶格常数确定为13至14纳米，层厚度为10 ± 2纳米。

原子力显微镜（AFM）研究证实，在金三相互作用后，Slp1晶格仍保持完全完整，这验证了石英晶体微天平-耗散（QCM-D）结果所预测的涂层稳定性。AFM证实了零价金纳米颗粒在Slp1晶格上的吸附，但由于颗粒尺寸较大，这些颗粒并不遵循Slp1的p4对称性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一个工作日内完成。

采用这些方法后，还可进一步开展其他技术，如红外光谱法或氦离子显微镜，以回答更多问题，例如特异性结合位点或与金及金纳米颗粒的相互作用。本研究所展示的技术为uzrachem研究生物分子与金属之间的相互作用铺平了道路，例如在不同类型表面上的吸附与解吸行为。观看本视频后，您应已充分了解如何研究金属与生物溶剂之间的相互作用；在使用该方法时，请务必佩戴护目镜、实验服，当然还有手套。