Name: 三维仿生技术:新型Biorubber创建自定义微观和宏观尺度架构的胶原凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习使用BSA橡胶牺牲材料制备三维胶原支架的技术，用于组织工程研究。该方法可高精度复制体内组织的微观几何结构，为研究细胞与细胞外基质相互作用及开发组织替代物提供可靠方案。

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本工作由美国国立卫生研究院-国家牙科与颅面研究所（NIH-NIDCR）资助项目 IRO1DE019355（MJ Yost，项目负责人）以及美国国家科学基金会-实验性项目伙伴计划（NSF-EPSCoR，EPS-0903795）资助。

1. 测定胶原蛋白批次中固体物的百分比
<ol>
	<li>按照先前发表的方法提取胶原蛋白13。解冻至少 20 ml 的胶原蛋白。测定该批次胶原蛋白的初始固体百分比，以便调控所形成水凝胶中的胶原蛋白浓度。
	<ol>
		<li>裁剪三片铝箔（约 6 × 6 cm），使用 25 ml 烧杯的底部将每片塑造成小盘状。记录每个铝箔盘的重量。</li>
		<li>向每个铝箔盘中加入少量胶原蛋白，并记录铝箔盘与胶原蛋白的总重量。每个铝箔盘上添加 0.5 - 0.8 g 胶原蛋白。 
		注意：此步骤完成后，应有三个铝箔盘，每个盘中均含有少量胶原蛋白。务必记录每个（共 3 个）空铝箔盘的重量以及加入胶原蛋白后的总重量。</li>
		<li>使用以下公式计算每个盘中胶原蛋白的重量： 
		胶原蛋白重量 = 铝箔盘与胶原蛋白总重量 - 铝箔盘重量</li>
		<li>将盛有胶原蛋白的三个铝箔盘置于 100 °C 烤箱中加热 24 小时。</li>
		<li>24 小时后，记录每个铝箔盘及其脱水后胶原蛋白的重量。</li>
		<li>使用以下公式计算脱水胶原蛋白的重量： 
		脱水胶原蛋白重量 = 铝箔盘与脱水胶原蛋白总重量 - 铝箔盘重量</li>
		<li>利用以下公式计算三个样品的固体百分比，以确定胶原蛋白固体浓度： 
		<img alt="胶原蛋白含量公式，静态平衡，胶原蛋白固体百分比计算方程。" src="/files/ftp_upload/53578/53578eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 2"></li>
		<li>根据三个样品的胶原蛋白固体百分比，计算该批次胶原蛋白的平均固体含量。 
		注意：后续使用的胶原蛋白为剩余的水合胶原蛋白。脱水后的胶原蛋白不会被使用。</li>
		<li>确定该批次胶原蛋白的固体百分比（初始胶原蛋白浓度）后，继续使用剩余的水合胶原蛋白。使用校准过的 pH 计将胶原蛋白溶液的 pH 值调节至 3。
		<ol>
			<li>每次加入少量（2–5 µl）12 N 盐酸（HCl）。始终将样品置于冰上。切勿将盐酸直接加入胶原蛋白中——应将酸液加至管壁侧面。加酸后，用刮勺将酸推入胶原蛋白中，并迅速搅拌混合物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当 pH 达到 3 后，将胶原蛋白在 4 °C 下静置过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. BSA 橡胶的制备
<ol>
	<li>按照以下步骤制备牛血清白蛋白（BSA）溶液。
	<ol>
		<li>制备2倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。将两片PBS片剂加入100 ml水中，配制成0.02 M PBS溶液。</li>
		<li>将BSA与2倍浓度PBS混合，按以下步骤制备30% BSA溶液。
		<ol>
			<li>例如，使用30 ml 2倍浓度PBS制备30% BSA溶液时，需称取12.9 g BSA。取1/3体积的2倍浓度PBS（例如，10 ml）加入带有搅拌子的烧瓶中。加入1/2质量的BSA（例如，6.45 g BSA），用刮刀将干燥的溶质润湿。</li>
			<li>重复加入PBS和BSA的操作，直至所有溶质和溶剂均加入烧瓶中。使用刮刀充分润湿所有溶质。此时溶液呈液体与团块混合状。静置约30分钟。</li>
			<li>然后将搅拌器调至低速搅拌，确保搅拌子周围无团块残留。完全溶解约需90分钟；也可在4 °C条件下过夜搅拌。待溶质完全溶解后，将溶液转移至20 ml注射器中，并安装0.20 µm注射器滤器。推动活塞使液体经滤器滤出，收集灭菌后的溶液至新离心管中。4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用经无菌过滤的2倍浓度PBS稀释25%戊二醛溶液，制备3%戊二醛溶液。例如，配制10 ml 3%戊二醛溶液时，取2 ml 25%戊二醛和8 ml 2倍浓度PBS混合。4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 模具处理
注意： 本文所述的原型使用了定制的不锈钢Y形模具部件。该模具包含一个流入通道和两个流出通道，直径分别为4 mm和3 mm。首先，清洗模具，喷洒不饱和猪油，并进行灭菌处理。按照下述步骤准备模具。
<ol>
	<li>使用频率为 35 kHz 的超声波清洗机清洗不锈钢模具。将模具放入超声波清洗机中，并用水和冰覆盖。在超声波清洗机运行期间，始终确保模具保持低温状态。超声处理分两次进行，每次 90 分钟。
	<ol>
		<li>每次处理后，使用针头检查鲁尔锁不锈钢或黄铜接头中是否残留材料。用肥皂和水清洁模具两面的整个表面。确认通道内无任何堵塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将模具、螺丝和鲁尔锁接头放入高压灭菌袋中，并进行高压灭菌。</li>
	<li>取一个可连接气雾喷壶的瓶子，加入市售猪油（混合脂肪酸脱模剂）至半满。将瓶盖更换为普通瓶盖。将其放入高压灭菌袋中并进行高压灭菌。 
	注意：猪油用于促进后续反应注射材料（BSA 橡胶）的脱模。请勿将喷雾瓶盖放入高压灭菌器中，以免损坏内部密封结构。</li>
	<li>将猪油在微波炉中加热 45 秒，或直至其变得透明且呈液态。将气雾喷壶盖拧紧至猪油瓶上。将瓶盖与喷雾装置连接。将喷雾装置连接至实验台的气源。打开气阀，并打开喷雾器喷嘴，直至其开始润湿纸巾表面。</li>
	<li>垂直于模具表面喷洒猪油，直至表面完全覆盖。每喷完一件模具后，立即将其放入培养皿中并密封。将模具置于 4 °C 环境中静置 2 小时。</li>
	<li>通过将模具表面暴露于紫外光下 30 分钟，进行进一步灭菌处理。处理完成后，将模具重新放回 4 °C 环境中，直至准备进行反应注射。</li>
</ol>
4. BSA 橡胶的反应注射
注意：所有材料和溶液均应保持低温，直至准备使用，以防止在后续步骤中牛血清白蛋白（BSA）橡胶过早凝固。
<ol>
	<li>按照以下步骤准备用于将 BSA 橡胶注入模具的分配器。
	<ol>
		<li>将所有混合组件（两个 O 形圈、注射器帽、双筒注射器、混合头和 4:1 分配器）置于聚合酶链式反应（PCR）生物安全柜中，暴露于紫外光下 30 分钟进行灭菌。 
		注意：使用 PCR 生物安全柜是因为该操作涉及固定剂。由于存在暴露风险以及对细胞的毒性，这些化学品不能在细胞/组织培养生物安全柜中使用。任何配备紫外灯的其他生物安全柜均可适用。</li>
		<li>将尖端帽安装到溶液 holder 上。</li>
		<li>以 BSA:戊二醛 4:1 的比例进行混合和注射。将 30% BSA 加入双筒注射器中用于输送较大量溶液的腔室（约需 4 ml 填满）。确保留出足够空间放置 O 形圈，以防止溢出并污染相邻腔室。</li>
		<li>将 3% 戊二醛溶液加入另一腔室（约需 1 ml 填满）。确保留出足够空间放置 O 形圈，以防止溢出并污染相邻腔室。</li>
		<li>将双筒注射器安装到分配器上。将装置垂直倾斜，使注射器帽位于上方。用混合头替换注射器帽。</li>
		<li>将两个不锈钢模具部件拧紧在一起。</li>
		<li>将组装好的模具放入高压灭菌袋中。</li>
		<li>为排除分配器中的空气，保持其直立状态，快速挤压手柄一次，释放少量 BSA 与戊二醛的混合液。然后迅速将不锈钢 Y 型模具的鲁尔锁接头连接至注射器尖端。</li>
		<li>用左手握住不锈钢 Y 型模具，右手持 BSA-戊二醛混合液分配器。交替按压流出通道的左右排气口，使其紧贴高压灭菌袋的侧壁，以确保模具内部空腔完全充满溶液。随后将模具水平放置并再次注射。</li>
		<li>将模具从分配器上取下，并放入 25 mm 培养皿中。</li>
		<li>用 Parafilm 封住培养皿，防止橡胶脱水。</li>
		<li>将模具置于 4 °C 冰箱中过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 调整胶原蛋白浓度
注意：在操作过程中，胶原蛋白应始终置于冰上保存。
<ol>
	<li>通过胶原固含量的百分比调整胶原浓度。
	<ol>
		<li>通过加入冷蒸馏水调节初始胶原浓度，配制10 ml的1.75%胶原溶液。</li>
		<li>使用校准的pH计，用12 N盐酸将pH调节至3。切勿将盐酸直接加入胶原溶液中——应将酸液加至离心管侧壁。加酸后，用刮刀将酸推入胶原溶液中，并迅速搅拌混合。</li>
		<li>在另一个锥形离心管中称取4 g胶原。</li>
		<li>在4 °C、9,343 × g条件下离心20–30分钟，以去除胶原中的气泡。</li>
		<li>对细胞培养超净台进行30分钟紫外灭菌，并向4 ml胶原溶液中加入14 µl层粘连蛋白，最终层粘连蛋白浓度为10 µg/µl。注意：层粘连蛋白可提供结构完整性、促进细胞黏附，并调控多种细胞反应。</li>
		<li>在使用超净台前，提前开启PCR用紫外灯照射20–30分钟进行灭菌。</li>
		<li>将用于连接20 ml注射器的鲁尔锁紧帽放入乙醇中浸泡2小时，随后取出晾干并置于紫外灯下灭菌。</li>
		<li>对胶原进行γ射线辐照8.6分钟，以达到1,200 cGy的辐照剂量。 
		注意：辐照时间取决于铯源的衰变情况，应根据实际情况调整时间以达到相同的剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 在 BSA 橡胶上浇铸胶原蛋白
<ol>
	<li>为使胶原蛋白聚合，使用8:1:1的比例（胶原蛋白:HEPES:MEM）。以下步骤基于初始4 g酸化胶原蛋白（来自步骤5.1.8）。
	<ol>
		<li>将HEPES溶于水配制成0.2 N的溶液，并通过逐次加入少量（1–5 µl）1–5 M氢氧化钠（NaOH）溶液将pH值调节至9。每次添加后，使用校准过的pH计监测溶液pH值。配制后储存于4 °C或置于冰上保存。</li>
		<li>开启组织培养超净台的紫外灯，照射20–30分钟以进行消毒。</li>
		<li>将镊子、刮刀和手术刀进行高压灭菌处理以实现消毒。</li>
		<li>在组织培养超净台内，将1.5 ml 0.2 N HEPES（pH 9）与1.5 ml 10x MEM混合。使用前确保将其保持在冰上，并涡旋振荡5秒。储存于4 °C或置于冰上保存。</li>
		<li>为消毒PCR超净台，开启紫外灯照射30分钟。</li>
		<li>将12孔板和20 ml注射器置于-20 °C环境中10分钟，或冷藏至准备继续操作。注意：所有材料在使用前均应保持低温。温度升高会引发胶原蛋白过早发生纤维形成。</li>
		<li>将所有即将放入超净台的离心管和孔板用70%乙醇喷洒，并静置晾干以完成消毒。将20 ml注射器置于冰上冷却，以备后续使用。</li>
		<li>在PCR超净台内，打开不锈钢模具以取出BSA橡胶，并使用手术刀切割BSA橡胶模具的排气通道。</li>
		<li>在PCR超净台内，打开无菌胶原蛋白管，加入1 ml HEPES-MEM溶液（确保在吸取前该溶液已充分混匀，且无固体沉淀物）。</li>
		<li>使用无菌刮刀，将胶原蛋白与缓冲液溶液彻底混合。</li>
		<li>迅速盖紧管盖并涡旋振荡，以确保形成均匀的水凝胶。</li>
		<li>将混合液转移至预冷的20 ml注射器中。</li>
		<li>一只手握住BSA橡胶置于孔内，另一只手将一半的胶原蛋白水凝胶溶液注入孔底。</li>
		<li>使用无菌镊子，确保橡胶的流入和流出端紧贴孔壁。</li>
		<li>继续将胶原蛋白溶液倒在橡胶上方，直至其完全被覆盖。</li>
		<li>确保BSA橡胶悬浮于胶原蛋白中，且无气泡产生，尤其注意橡胶两端附近区域。</li>
		<li>盖上盖子，并用Parafilm封膜包裹孔板边缘。</li>
		<li>将孔板放入37 °C培养箱中孵育1小时。保持PCR超净台的紫外灯开启。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原蛋白聚合完成后，通过以下步骤进行紫外交联处理。 
	注意：胶原蛋白的交联将使用可调控能量输出的紫外交联仪完成。
	<ol>
		<li>开启紫外交联仪，设置能量参数，对空腔室照射630,000 µJ/cm2的紫外光。</li>
		<li>从培养箱中取出凝胶。</li>
		<li>用乙醇喷洒双手，在腔室内迅速取下盖子。</li>
		<li>关闭腔室，选择能量设置，对水凝胶照射630,000 µJ/cm2的紫外光以完成交联。</li>
		<li>交联循环结束后，关闭PCR超净台的紫外灯。</li>
		<li>用乙醇喷洒双手，打开腔室，迅速将盖子重新盖回孔板上，并将孔板转移至PCR超净台内。</li>
		<li>使用无菌刮刀轻轻松动并取出凝胶。在超净台内将凝胶翻转，以对水凝胶底部进行交联。重复步骤6.2.3和6.2.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. BSA 橡胶的酶消化
<ol>
	<li>为了获得中空的胶原蛋白支架，需以不影响水凝胶内嵌结构尺寸的方式去除BSA橡胶。具体步骤如下：
	<ol>
		<li>开启紫外灯20-30分钟，对组织培养操作台进行灭菌。</li>
		<li>配制pH为7.8的0.25%胰蛋白酶溶液。例如，取15 ml水，加入0.0376 g胰蛋白酶至50 ml锥形管中。通过逐滴加入少量（2-5 µl）1 M NaCl调节pH至7.8。将溶液转移至20 ml注射器中，并连接0.20 µm注射器滤器。推动活塞使液体经滤器过滤，并将无菌溶液收集至新管中。</li>
		<li>开启水浴锅，设定温度为30 °C。</li>
		<li>30分钟后关闭紫外灯。用乙醇喷洒所有将在操作台内使用的试管和材料。</li>
		<li>将胶原蛋白水凝胶转移至操作台内，并分别放入不同的锥形管中。</li>
		<li>向每根试管中加入约3-5 ml（足以覆盖凝胶）pH为7.8的0.25%胰蛋白酶溶液。</li>
		<li>用Parafilm密封试管，轻轻涡旋约1分钟。</li>
		<li>将试管置于30 °C水浴中孵育15-24小时。孵育期间需频繁轻轻涡旋，直至BSA橡胶被完全消化或从水凝胶中去除。 
		注意：判断BSA橡胶是否已去除的方法为观察胰蛋白酶溶液中是否存在漂浮的橡胶或降解碎片。水凝胶内部不得有肉眼可见的暗区。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保水凝胶中所有BSA橡胶和胰蛋白酶均已被彻底去除，按以下步骤进行清洗：
	<ol>
		<li>开启PCR操作台的紫外灯，照射20-30分钟。</li>
		<li>配制Mosconas溶液。将氯化钾（KCl, 28.6 mM）、碳酸氢钠（NaHCO3, 11.9 mM）、葡萄糖（9.4 mM）和磷酸二氢钠（NaH2PO4, 0.08 mM）溶于水中。用1 M NaOH或12 M HCl溶液调节pH至7.4。将溶液装入20 ml注射器，使用0.20 µm注射器滤器过滤除菌。</li>
		<li>将所有物品用乙醇喷洒后放置于操作台内，并等待乙醇完全挥发。</li>
		<li>打开试管，将5-10 ml无菌Mosconas溶液转移至新的50 ml锥形管中。</li>
		<li>将胶原蛋白水凝胶转移至含有酶溶液的锥形管中，确保水凝胶完全浸没于溶液中。将试管置于4 °C冰箱内的摇床上，孵育30分钟。</li>
		<li>吸除Mosconas溶液，并重复步骤7.2.5两次。</li>
		<li>于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKundu%2C+J+%22Biofabrication%22">Biofabrication</a>. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).</li>
<li>Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+and+biomaterials+for+tissue+engineering%3A+a+review+of+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications.</a> Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).</li>
<li>Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+pore+structure+of+PCL+scaffolds+for+tissue+engineering+prepared+via+gas+foaming+of+multi-phase+blends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porous+Mater%22%5BJournal%5D)">Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends.</a> J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).</li>
<li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Compos.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).</li>
<li>Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+collagen%2Fbiopolymers+for+regenerative+medicine+and+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Collagen+Nanofibrous+Materials+for+Bone+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Eng.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering.</a> Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).</li>
<li>Cao, H., Kuboyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable+porous+composite+scaffold+of+PGA%2Fbeta-TCP+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering.</a> Bone. 46, 386-395 (2010).</li>
<li>Ankam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+topography+and+size+determine+the+fate+of+human+embryonic+stem+cells+to+neuronal+or+glial+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage.</a> Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).</li>
<li>Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+tissue+engineering+using+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Bone tissue engineering using 3D printing.</a> Mater. Today. 16, 496-504 (2013).</li>
<li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li>
<li>Yost, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tubular+scaffold+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).</li>
<li>Habeeb, A. J., Hiramoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+proteins+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Reaction of proteins with glutaraldehyde.</a> Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).</li>
<li>Tanford, C., Buzzell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Viscosity+of+Aqueous+Solutions+of+Bovine+Serum+Albumin+between+pH+4.3+and+10.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5.</a> J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).</li>
<li>Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscosity+analysis+of+high+concentration+bovine+serum+albumin+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions.</a> Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).</li>
<li>Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+viscosity+of+polyelectrolytes+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Int%22%5BJournal%5D)">The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited.</a> Polym. Int. 44, 338-347 (1997).</li>
<li>Arakawa, T., Timasheff, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+protein+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Theory of protein solubility.</a> Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37, 790-796 (2004).</li>
<li>Burmeister, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde+cross-linked+glutamate+oxidase+coated+microelectrode+arrays%3A+selectivity+and+resting+levels+of+glutamate+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS.</a> ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).</li>
<li>Chatterji, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+with+hydrophilic%2Fhydrophobic+grafts+and+glutaraldehyde+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks.</a> J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).</li>
<li>Freije, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified%2C+immobilized+trypsin+reactor+with+improved+digestion+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency.</a> J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).</li>
<li>Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+gels+for+intratumoral+delivery+of+beta-lapachone%3A+effect+of+cyclodextrins+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol.</a> ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).</li>
<li>Basak, R., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophobic+drugs+in+Pluronic+F127+micelles%3A+effects+of+drug+hydrophobicity%2C+solution+temperature%2C+and+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH.</a> Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生物制造是一个高度跨学科的领域，生物学与工程学原理在此融合，以生成模拟天然组织的复杂材料。为了实现这一目标，需要开发能够利用从以下方面获取信息的技术 体内 组织并将其转化为 体外 支架。通过这种方式，可构建一个在结构、功能和力学特性上均高度模拟目标组织的平台 在体内 组织。理想的支架材料应具备某些特性，例如具有生物相容性、能够模拟目标组织的力学性能、可实现可控降解、能够支持细胞存活，并允许组织重塑。2,3.
已开发出多种制造技术以生成可存活的三维结构。这些技术可分为两大类：传统技术和先进技术。传统技术包括使用合成和天然的传统材料来制备多孔结构，例如溶剂浇铸、冷冻干燥和熔融成型。这些技术的缺点包括对结构内部孔隙率（孔径大小及孔隙连通性）的控制较差，以及难以在支架内部形成通道。先进技术则包括立体光刻、成型、三维打印和静电纺丝等。1这些技术存在一些缺点，例如缺乏长程微结构通道、材料选择需在提供最佳机械强度的同时能够通过小直径喷嘴挤出、工艺优化依赖于材料特性、需要复杂的后处理步骤（可能具有毒性...

在组织工程领域，制备组织支架的能力至关重要。理想的组织支架应具备三维结构，由生物相容性材料构成，并能模拟 在体内 组织结构以促进细胞和组织的生长与重塑。该支架必须允许营养物质的输送和代谢废物的清除1-4生产这些支架的主要障碍之一是将特定的几何特征复制到生物相容性材料中的能力。已有多种生物制造技术被报道用于控制这些支架的几何特征，例如静电纺丝。5-8溶剂浇铸9立体光刻10，以及3D打印11，以及其他技术。这些技术在相对简便地实现可控的内部和外部结构特征转移方面存在不足，且成本较高，分辨率和可打印性也受到限制（例如， 喷嘴规格、材料限制），或需要耗时较长的后期加工技术才能制备出可用的支架12.
在许多商业制造系统中，内部空隙、通道和结构特征的形成通常采用砂子或其他可移除或牺牲性材料。金属或塑料部件在砂模周围成型，待其固化后，再将砂子去除。以类似的方式，下一代生物材料需要一种相当于“生物砂”的替代物。因此，开发了BSA橡胶作为生物砂的替代品。BSA橡胶是一种新配制的材料，由牛血清白蛋白与戊二醛交联而成。其最终目标是将特定的结构特征重建到一种可生物降解的胶原支架中。本文描述了一种牺牲性生物橡胶的特性，该生物橡胶在原始组织模具中能够保持尺寸保真度。
测试了多种BSA与戊二醛浓度组合，并使用了多种溶剂。该材料由BSA与戊二醛之间的反应生成。BSA橡胶可通过反应注射成型进入组织模具的复杂几何结构中。交联的BSA对胰蛋白酶敏感，在温和的pH和温度条件下可被该酶迅速消化。相反，完整的I型胶原对胰蛋白酶消化具有很强的抗性。利用这些特性，可以选择性地去除BSA橡胶而保留胶原。本研究旨在确定获得一种可降解模具所需的最佳参数，该模具能够将特定的结构特征传递给生物相容性支架。所评估的具体特性包括混合性、酶消化性、承载能力以及向阴模中进行反应注射的能力。30% BSA与3%戊二醛的组合满足这些要求。本方案提供了制备此类三维支架所需的必要指导。该原型由代表分支结构的胶原支架组成，具有一条流入通道和两条流出通道，直径分别为4 mm和3 mm。该技术有望模拟目标组织的宏观和微观环境。该技术提供了一种可行的方法，能够以相对简便、及时且高保真的方式，将特定的几何指令传递给可生物降解材料，并可调节以模拟目标组织的in vivo组织弹性及其他特性。

<table><tbody><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白</td><td></td><td></td><td>从小牛皮中提取的胶原蛋白</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS片剂）</td><td>MP Biomedical</td><td>U5378</td><td>每100 ml使用1片可配制1x PBS</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>有毒</td></tr><tr><td>猪油</td><td>Fields</td><td>3090</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢模具</td><td></td><td></td><td>使用Microlution机床加工</td></tr><tr><td>喷枪套装</td><td>Central Pneumatic</td><td>47791</td><td></td></tr><tr><td>双筒注射器混合头</td><td>Medmix</td><td>ML2.5-16-LLM</td><td>混合器，DN2.5X16，4:1 棕色，中等</td></tr><tr><td>双筒注射器小型O型圈</td><td>Medmix</td><td>PPB-X05-04-02SM</td><td>活塞B，5 ml，4:1，PE天然</td></tr><tr><td>双筒注射器盖帽&amp;nbsp;</td><td>Medmix</td><td>VLX002-SM</td><td>盖帽，4:1/10:1，PE棕色，中等</td></tr><tr><td>双筒注射器大型O型圈</td><td>Medmix</td><td>PPA-X05-04-02SM</td><td>活塞A，5 ml，4:1</td></tr><tr><td>双筒注射器</td><td>Medmix</td><td>SDL X05-04-50M</td><td>双筒注射器，5 ml，4:1</td></tr><tr><td>双筒注射器分配器</td><td>Medmix</td><td>DL05-0400M</td><td>分配器，5 ml，4:1，中等，普通型</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td></td><td></td><td>3.6 mg/ml —— USC实验室提取</td></tr><tr><td>20 ml 注射器鲁尔锁头</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁帽</td><td>Fisher</td><td>JGTCBLLX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Gibco最低必需培养基10x（MEM）</td><td>Life Technologies</td><td>1143-030</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>UV交联仪&amp;nbsp;</td><td>Spectroline UV</td><td>XLE1000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td>用于配制Mosconas</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250</td><td>用于配制Mosconas</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td>用于配制Mosconas</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8270</td><td>用于配制Mosconas</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7907</td><td>用于配制Mosconas</td></tr><tr><td>注射器用无菌滤器</td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr></tbody></table>

三维仿生技术：新型生物橡胶在胶原水凝胶中构建明确的微米与宏观结构

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

组织支架在组织再生过程中发挥着关键作用。理想的支架必须满足多项要求，例如具备适当的组成、特定的模量以及明确的结构特征。能够模拟天然组织内在结构的生物材料 体内 组织对于疾病研究以及修复缺失或畸形的软组织至关重要。本研究开发了一种新型生物制造技术，结合先进的成像技术、三维（3D）打印技术和选择性酶活性，用于构建新一代适用于科研与临床应用的生物材料。所开发的材料——牛血清白蛋白（BSA）橡胶，通过反应注射成型注入具有特定几何结构的模具中。该牺牲性材料可有效将结构特征转移至天然支架材料中。原型包含一个具有4 mm和3 mm通道的三维胶原支架，呈现分支状结构。本文重点阐述该生物制造技术在构建天然组织工程结构中的应用。本方案利用计算机辅助设计软件（CAD）制造实体模具，随后将BSA橡胶进行反应注射成型，再通过酶消化去除橡胶材料，从而在支架材料中保留其原有的结构特征

关键词：组织工程，生物制造，三维打印，牛血清白蛋白橡胶，胶原支架，酶消化，反应注射成型，计算机辅助设计.

结果表明，该生物制造技术在生成可模拟三维空间排列结构的3D支架方面具有高效性 体内 组织。其结构特征是组织工程应用中的关键参数，在组织工程中起着至关重要的作用 体内 细胞相互作用及组织的功能特性。
BSA 橡胶的一致性和可混匀性是制备均匀且能保持预期形状的 BSA 橡胶的重要参数。蛋白质的溶解度由分子间作用力决定，例如蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质与溶剂之间的相互作用，这些作用会引发蛋白质整体行为的变化。测定了 BSA 溶液的电导率，该数值可反映溶液中盐浓度的高低。表 1 列出了所测试的 BSA、溶剂和戊二醛的组合。与预期一致，电导率最高的样品（2x PBS 溶剂）更有利于 BSA 的溶解。
确定该牺牲材料合适制备条件的另一个参数是反应速率。如预期所示，随着戊二...

一种创新的生物制造技术被开发出来，用于构建在结构特征、组分和力学性能方面类似于天然组织的三维结构 体内 组织。该技术采用了一种新开发的牺牲材料——BSA橡胶，可转移精细的空间特征，实现对 体内 多种组织的结构。

组织支架在组织再生过程中发挥着关键作用。理想的支架必须满足多项要求，例如具备合适的……

本方案的总体目标是构建三维胶原支架，以模拟体内组织的结构特征、组成成分和力学性能。该方法有助于解答组织工程领域中的关键问题，例如细胞外基质与细胞的相互作用、结构特征对工程化组织构建的影响，以及组织替代物的开发等。该技术的主要优势在于，能够在可生物降解材料中高保真地重现内部流道和通路的微观几何结构，提供一种可行的操作流程。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Veronica Rodriguez-Rivera 演示。用于制备 BSA 橡胶的材料必须在使用前一直低温保存，以防止 BSA 橡胶过早凝固。该操作过程中的无菌条件也极为重要。首先，对分配器进行灭菌。在非细胞培养超净台中，放置好O型环、注射器、注射器盖帽、混匀头以及四比一分配器，用紫外灯对这些材料灭菌30分钟。首先，将两个不锈钢模具部件拧在一起，并安装鲁尔锁接头。在组装分配器之前，使用70%乙醇喷洒移液器和试剂，然后将其放入超净台中。首先将吸头帽安装到溶液 holder 上。接下来，将30% BSA溶液加入较大的腔室中，注意不要污染另一个腔室。留出足够的空间用于安装O形圈。然后，将3%戊二醛加入较小的分配腔室中，并安装另一个O形圈。现在，将注射器连接到分配器上。然后倾斜装置，使盖子位于上方，并用混合尖头替换盖子。接着轻轻敲击侧面，使气泡向上移动。接下来，将分配器放入灭菌袋内，以容纳排出的溶液。在袋内，保持分配器直立，挤出少量溶液以排尽注射器内的所有空气。排除空气非常重要。然后，迅速将不锈钢 Y 型模具的鲁尔锁紧接头连接到注射器尖端。现在，用非惯用手持握模具，交替将溶液注入流出通道的左侧和右侧出口。按压出口，使溶液充满内部空腔。然后将模具水平放置，并继续注入溶液，直至用掉一半的分配器体积。将模具放入培养皿中，用封口膜包裹，并在4°C下过夜保存。该步骤按4克酸化胶原的量进行缩放。使用前保持冷藏。胶原蛋白称重后，通过γ射线辐照对溶液进行灭菌。准备过程中，用纯水新鲜配制0.2当量的HEPES溶液。然后将内容转移至一个50毫升的锥形管中。使用浓氢氧化钠将pH值调节至9。务必对超净台进行紫外线灭菌，并对镊子、刮勺和手术刀进行高压灭菌。在通风橱中，将 1.5 毫升 HEPES 溶液与 1.5 毫升 10x MEM 混合。将此混合液置于冰上保存。同时，将一个 12 孔板和一个 20 毫升注射器放入冰箱中预冷 10 分钟。为确保更高的无菌性，在将试管和培养皿放入超净台前，用70%乙醇喷洒其表面。喷洒模具培养皿后，将其放入超净台中，随后用镊子取出BSA橡胶模具。然后，使用手术刀将模具上的排气通道切下。接着，短暂涡旋混匀 HEPES-MEM 混合液，并取一毫升加入到胶原蛋白中。随后，用无菌刮勺充分混匀溶液。轻轻涡旋混匀后，迅速将溶液转移至预冷的20毫升注射器中。接着，在固定好BSA橡胶于孔内后，将一半的胶原蛋白水凝胶溶液注入孔底。然后，使用镊子调整模具位置，使橡胶的流入端和流出端紧贴孔壁。然后，用胶原蛋白水凝胶覆盖模具。现在用封口膜密封孔板，并将板放入37°C培养箱中。静置1小时，使胶原蛋白聚合。在此期间，保持生物安全柜内的紫外灯开启。同时，将紫外交联仪设置为提供630,000微焦耳/平方厘米的辐照剂量。现在，用70%乙醇喷洒戴着手套的双手，将覆盖有胶原的模具平板放入交联仪中，并启动照射程序。照射完成后，再次喷洒手套，并从交联仪中取出培养板。然后使用无菌刮勺将凝胶从孔中取出并翻转，对水凝胶的底部进行交联。完成最终的交联循环后，进行酶消化处理。为了在不破坏胶原支架的情况下去除BSA橡胶，请使用pH值为7.8的无菌0.25%胰蛋白酶溶液，并通过0.20微米滤膜过滤。将足量过滤后的胰蛋白酶溶液转移至新的50毫升锥形管中。然后，将胶原水凝胶转移至含有酶溶液的锥形管中。确保水凝胶完全被溶液覆盖。用封口膜密封试管，轻轻涡旋约1分钟。然后将试管置于30 °C条件下孵育，消化反应持续15至24小时。在最初的四个小时内，每隔15至30分钟取出试管，轻轻涡旋振荡，以促进BSA橡胶完全消化。第二天，当溶液中无橡胶漂浮或水凝胶中无破碎的橡胶碎片时，视为消化完成。现在，将胰蛋白酶溶液更换为无菌的Mosconas溶液，并将试管置于4°C下振荡30分钟。随后，吸除 Mosconas 溶液，并重复此步骤两次，以彻底清洗胶原支架。为优化生物橡胶的使用，进行了大量测试，具体细节已在文本方案中详细描述。采用优化后的方案及三个固体模具部件，制备了胶原水凝胶并进行了详细检测。所需的Y形模具是在Microlution机床上加工而成。将30% BSA和3%戊二醛注入Y形模具中，在4°C下反应过夜。接着，将BSA橡胶与胶原蛋白混合浇铸，并在37°C下加热一小时。将橡胶酶解15小时，使其弱化至从胶原水凝胶上自然脱落，且不影响胶原水凝胶的几何形态。使用卡尺测量模具所形成的4毫米流入通道，确认其在胶原水凝胶中精确为4毫米。通过测试模具的稳定性发现，可稳定构建小至300微米的结构尺寸。此外，对经过Mosconas洗涤后的支架检测了残留的戊二醛，未发现任何残留物。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备可模拟体内几何结构的三维胶原支架。在完成本操作步骤后，还可采用其他补充该技术的方法，例如构建体内组织的三维模型，或制备具有特定结构特征的模具，以回答更多科学问题。该技术问世后，为组织工程领域的研究人员探索体内结构特征和基质成分与细胞在体外模型中的相互作用开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

三维仿生技术：新型Biorubber创建自定义微观和宏观尺度架构的胶原凝胶

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。...

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

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微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

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以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。...

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

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利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

学习使用BSA橡胶牺牲材料制备三维胶原支架的技术，用于组织工程研究。该方法可高精度复制体内组织的微观几何结构，为研究细胞与细胞外基质相互作用及开发组织替代物提供可靠方案。

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