三维仿生技术：新型生物橡胶在胶原水凝胶中构建明确的微米与宏观结构

本方案的总体目标是构建三维胶原支架，以模拟体内组织的结构特征、组成成分和力学性能。该方法有助于解答组织工程领域中的关键问题，例如细胞外基质与细胞的相互作用、结构特征对工程化组织构建的影响，以及组织替代物的开发等。该技术的主要优势在于，能够在可生物降解材料中高保真地重现内部流体通道和通路的微观几何结构，提供一种可行的操作流程。

为演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员 Veronica Rodriguez-Rivera。用于制备 BSA 橡胶的材料必须在储存和使用前保持低温，以防止 BSA 橡胶过早凝固。该操作步骤中无菌条件也极为重要。

首先，对分配器进行灭菌。在非细胞培养超净台中，放置好O型圈、注射器、注射器盖帽、混匀头以及四比一分配器，用紫外灯对这些材料灭菌30分钟。

首先，将两个不锈钢模具部件拧在一起，并安装鲁尔锁接头。在组装分配器之前，使用70%乙醇喷洒移液器和试剂，然后将其放入超净台中。首先将吸头帽安装到溶液 holder 上。

接下来，将30% BSA溶液加入较大的腔室中，注意不要污染另一个腔室。留出足够的空间以安装O形圈。然后，将3%戊二醛加入较小的分配腔室中，并安装另一个O形圈。

现在，将注射器连接到分配器上。然后倾斜装置，使盖子位于上方，并用混合尖端替换盖子。接着轻轻敲击侧面，使气泡向上移动。

接下来，将分配器放入已灭菌的袋中，以容纳排出的溶液。在袋内，保持分配器直立，先少量排出溶液，以清除注射器中的所有空气。去除空气非常重要。

然后，迅速将不锈钢 Y 型模具的鲁尔锁连接到注射器尖端。现在，用非惯用手握住模具，交替将溶液注入流出通道的左侧和右侧出口。按压出口，使溶液充满内部空腔。

然后，将模具水平放置，并继续注入溶液，直至用掉一半的分配体积。此时应将模具放入培养皿中，用封口膜包裹，并在4°C下过夜保存。该步骤适用于4克酸化胶原。

使用前保持冷藏。胶原蛋白称重后，通过γ射线辐照对溶液进行灭菌。准备过程中，用纯水新鲜配制0.2当量的HEPES溶液。

然后将内容转移至一个50毫升的锥形管中。使用浓氢氧化钠将pH值调节至9。务必对超净台进行紫外线灭菌，并对镊子、刮勺和手术刀进行高压灭菌。

在通风橱中，将1.5毫升HEPES溶液与1.5毫升10x MEM混合，将此混合液置于冰上保存。同时，将一个12孔板和一个20毫升注射器放入冰箱冷冻10分钟。

为提高无菌程度，在将试管和培养皿放入超净台前，用70%乙醇喷洒其表面。喷洒模具培养皿后，将其放入超净台中，然后用镊子取出BSA橡胶模具。

然后，使用手术刀将模具上的排气通道切下。接着，短暂涡旋混匀 HEPES-MEM 混合液，并取一毫升加入到胶原蛋白中。随后，用无菌刮勺充分混匀溶液。

轻轻涡旋混匀后，迅速将溶液转移至预冷的20毫升注射器中。接着，在固定好BSA橡胶于孔内后，将一半的胶原蛋白水凝胶溶液注入孔底。然后，使用镊子调整模具位置，使橡胶的流入端和流出端紧贴孔壁。

然后，用胶原蛋白水凝胶覆盖模具。接着用封口膜密封孔板，并将板放入37°C培养箱中。静置一小时，使胶原蛋白聚合。

在此期间，请保持生物安全柜内的紫外灯开启。同时，将紫外交联仪设置为提供 630,000 微焦耳/平方厘米的照射剂量。现在，用 70% 乙醇喷洒戴着手套的双手，将覆盖有胶原的模具板放入交联仪中，并启动照射程序。

照射后，再次喷洒手套，并从交联仪中取出培养板。然后使用无菌刮勺将凝胶从孔中取出并翻转，对水凝胶的底部进行交联。完成最终交联循环后，进行酶消化处理。

为了在不破坏胶原支架的情况下去除BSA橡胶，请使用pH值为7.8的无菌0.25%胰蛋白酶溶液，并通过0.20微米滤膜过滤。将足量过滤后的胰蛋白酶溶液转移至新的50毫升锥形管中。然后，将胶原水凝胶转移至含有酶溶液的锥形管中。

确保水凝胶完全被溶液覆盖。用封口膜密封试管，并轻轻涡旋约1分钟。然后将试管置于30 °C下孵育，消化反应持续15至24小时。

在最初的四个小时内，每隔15至30分钟取出试管，轻轻涡旋振荡，以促进BSA橡胶的完全消化。第二天，当溶液中无橡胶漂浮，且水凝胶中无破碎的橡胶碎片时，视为消化完成。现在，将胰蛋白酶溶液更换为无菌的Mosconas溶液，并将试管置于4°C下振荡30分钟。

随后，吸除 Mosconas 溶液，并重复此步骤两次，以彻底清洗胶原支架。为优化生物橡胶的使用，进行了大量测试，具体细节在文本方案中有详细描述。采用优化后的方案及三个固体模具部件，制备了胶原水凝胶并进行了详细检测。

所需的Y形模具是在Microlution机床上加工而成。将Y形模具注入30% BSA和3%戊二醛，在4°C下反应过夜。接着，将BSA橡胶与胶原蛋白混合浇铸，并在37°C下加热一小时。

将橡胶进行酶消化处理15小时，使其弱化至可自然脱落，且不影响胶原蛋白水凝胶的几何结构。使用卡尺测量模具形成的4毫米流入通道，证实其在胶原蛋白水凝胶中精确为4毫米。通过测试模具的稳定性发现，可稳定构建小至300微米的结构尺寸。

此外，对经过Mosconas洗涤后的支架检测了残留的戊二醛，结果未发现任何残留物。观看本视频后，您应能充分理解如何制备可模拟体内几何结构的三维胶原支架。在此方法基础上，还可采用其他补充技术，例如构建体内组织的三维模型，以及制备具有特定结构特征的模具，以回答更多科学问题。

该技术问世后，为组织工程领域的研究人员探索体内结构特征和基质成分与体外模型中细胞之间的相互作用开辟了道路。