Name: 成像的CD4 T细胞间质迁移发炎真皮 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 了解利用活体成像技术可视化发炎皮肤中CD4阳性T细胞动态行为的方法。该技术为研究免疫细胞在炎症组织中的运动机制提供了一种微创手段，有助于深入理解免疫应答过程。

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作者感谢罗切斯特大学多光子显微镜核心设施在活体成像方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为 AI072690 和 AI02851（授予 DJF）；AI114036（授予 AG）以及 AI089079（授予 MGO）。

作者无任何利益冲突需要披露。&#160;

意义
在此，我们提供了一套完整的方案，用于在完整小鼠耳部真皮中对转移的抗原特异性效应性Th1细胞进行4D可视化成像。该方法相较于当前一些成像技术具有多项优势。通过成像耳部腹侧真皮，可避免在对其他皮肤部位进行成像时通常所需的脱毛步骤。尽管脱毛剂通常较为温和，但已有研究表明其可能破坏皮肤屏障功能。 42，这一过程可刺激免疫反应 43,44通过避免采用侵入性外科手术暴露真皮或皮下组织，该方案可防止损伤诱导的炎症反应及中性粒细胞的快速募集。37 以及其它免疫细胞进入真皮。该系统采用静脉导管递送针对关键分子的阻断抗体，可实时探究CD4 T细胞的动态行为。该成像方案的应用揭示了CD4 T细胞在间质中运动所必需的关键条件。30 未在其中检测到的 体外 系统8.
实验步骤中的关键环节
任何成像方案中的一个关键步骤是确保组织样本...

CD4 T细胞的效应功能在很大程度上依赖于其快速进入并穿越多种外周组织的能力，以监测组织损伤、定位感染病灶，或在慢性感染及自身免疫状态下引发病理反应。尽管向炎症部位归巢的过程1-4 和外渗5-7 从血管进入组织的过程已被充分表征，但驱动和调控T细胞间质迁移的因素仍不明确。T细胞在复杂三维环境中的迁移已被研究 体外 通过使用人工基质8-10 或微流控装置11,12，但这些方法无法重现复杂且动态的体内环境 体内 系统。直到最近，随着高分辨率多色活体成像技术的出现，才使得研究免疫细胞的动态行为成为可能 原位，有助于更深入地理解完整的免疫应答。
十多年前，一些具有重要影响的研究首次利用双光子显微镜来解决免疫学问题并相继发表。早期的研究主要关注免疫细胞在离体淋巴器官中的行为13-16，随后很快发展出对麻醉小鼠暴露淋巴结进行成像的技术17。成像技术使得研究人员能够首次观察到T细胞在淋巴结中启动过程的各个阶段18、T细胞在次级淋巴器官中迁移的机制19、T细胞与其他免疫细胞之间的相互作用20,21，以及T细胞在淋巴结内的动态定位22。尽管早期许多研究集中于淋巴结内的动态过程，但活体成像技术此后已被广泛应用于多种外周组织中的免疫应答研究，包括脑23-25、肝26、肺27和皮肤28-30。
小鼠耳部真皮非常适合成像，因其耳部皮肤较薄、毛发相对稀疏，且易于与呼吸运动隔离31事实上，耳部真皮已被用于成像树突状细胞的间质行为32,33，T细胞28,29,34,35和中性粒细胞36,37，是研究皮肤炎症的成熟模型位点。近年来，非侵入性操作正逐渐取代包括分层真皮在内的外科皮肤制备方法38,39，侧翼39,40或背部皮肤瓣窗39,41 模型，可诱导局部炎症微环境的变化。采用转输的， 体外-引发的抗原特异性CD4效应T细胞可用于研究在皮肤炎症反应背景下细胞群体的同质性30在此，我们描述了一种非侵入性成像方法，该方法可实现对炎症小鼠耳部真皮间质中抗原特异性效应CD4 T细胞的可视化，并可通过静脉导管实时引入阻断抗体以操控这些细胞。我们证明，该模型可用于追踪CD4 T细胞在真皮中的迁移行为，并探究调控其运动机制的分子途径。

<table><tbody><tr><td>BALB/c小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000651</td><td>实验所用小鼠为本单位自行繁育</td></tr><tr><td>DO11.10 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>003303</td><td>实验所用小鼠为本实验室自行繁育</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>10-013-CV</td><td>多个等效</td></tr><tr><td>新生牛血清（NCS）</td><td>赛默飞/海克隆</td><td>SH30118.03</td><td>56℃热灭活 &amp;deg;30 分钟，37°C</td></tr><tr><td>豚鼠补体</td><td>Cedarlane</td><td>CL-5000</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8抗体</td><td>ATCC</td><td>3.155 (ATCC TIB-211)</td><td>源自的抗体&amp;nbsp; 该杂交瘤</td></tr><tr><td>抗MHC II类抗体</td><td>ATCC</td><td>M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)</td><td>源自的抗体&amp;nbsp; 该杂交瘤</td></tr><tr><td>抗CD24抗体</td><td>ATCC</td><td>J11d.2 (ATCC TIB-183)</td><td>源自的抗体&amp;nbsp; 该杂交瘤</td></tr><tr><td>抗Thy1.2抗体</td><td>ATCC</td><td>J1j.10 (ATCC TIB-184)</td><td>源自的抗体&amp;nbsp; 该杂交瘤</td></tr><tr><td>Ficoll（Fico/Lite-LM）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>I40650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>21-040-CV</td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>15323591</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗CD62L抗体（克隆MEL-14）</td><td>BD</td><td>553149</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性分离珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 分离柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>抗IFNγ抗体（克隆XMG 1.2）</td><td>eBioscience</td><td>16-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>抗IL-4抗体（克隆11b11）</td><td>eBioscience</td><td>16-7041-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>VWR</td><td>45000-412</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Fisher</td><td>15303641</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher</td><td>15323671</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白肽</td><td>生物活性肽</td><td></td><td>ISQAVHAAHAEINEAGR-OH 肽</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SV30014.03</td><td>56℃热灭活 &amp;deg;30 分钟，37°C</td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>LPS</td><td>3526</td><td>多个等效</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>28 支 G1/2 规格胰岛素注射器，1 ml</td><td>BD</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 胰岛素注射器，300 支&amp;mu;l</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>27 支 G1/2 TB 注射器，1 ml</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 医用导管</td><td>BD</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯兽用粘合剂（Vetbond）</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>WPI</td><td>61830</td><td></td></tr><tr><td>加热板控制器</td><td>WPI</td><td>ATC-2000</td><td></td></tr><tr><td>水毯控制器</td><td>盖玛尔</td><td>TP500</td><td>已停产，有更新的等效产品可供选择</td></tr><tr><td>水毯</td><td>Kent Scientific</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>LEI 医疗</td><td>Isotec 4</td><td>已停止生产，有更新的等效产品可供选择</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td></td><td>通过兽医人员订购</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>3M</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷鼻罩</td><td></td><td></td><td>自行构建，见图2</td></tr><tr><td>成像平台</td><td></td><td></td><td>自行构建，见图2</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>WPI</td><td>15915-G</td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6802</td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td></td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Fisher</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td>多个等效</td></tr><tr><td>精细操作擦拭</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>多个等效项</td></tr><tr><td>奥林巴斯Fluoview 1000 AOM-MPM直立显微镜，配备Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa激光器</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>询价</td></tr><tr><td>带振动控制的光学平台</td><td>纽波特</td><td></td><td>索取报价</td></tr><tr><td>25倍 NA 1.05 水浸物镜，用于多光子成像</td><td>奥林巴斯</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>目标加热器</td><td>Bioptechs</td><td>PN 150815</td><td></td></tr><tr><td>检测滤光片组</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRVGR/XR</td><td>专用滤光立方体，可通过单个滤光片/二向色镜组合近似实现</td></tr><tr><td>抗整合素 &amp;beta;1 抗体（克隆 hMb1-1）</td><td>eBioscience</td><td>16-0291-85</td><td>无叠氮化物，低内毒素</td></tr><tr><td>抗整合素 &amp;beta;3 抗体（克隆 2C9.G3）</td><td>eBioscience</td><td>16-0611-82</td><td>无叠氮化物，低内毒素</td></tr><tr><td>Texas Red 葡聚糖（70,000 MW）</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

成像炎症真皮中cd4 t细胞的间质迁移

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

CD4 T细胞发挥效应功能的能力依赖于这些细胞通过某种尚未明确的机制，在炎症外周组织中快速而高效地迁移。将多光子显微技术应用于免疫系统研究，为在完整组织内测量免疫应答动态提供了有力工具。本文介绍了一种非侵入性活体多光子成像小鼠炎症耳部真皮中CD4 T细胞的实验方案。通过使用定制的成像平台和静脉导管，可实现对真皮间质中CD4 T细胞动态行为的可视化，并能够通过添加针对运动相关关键分子成分的阻断抗体，实时探究这些细胞的行为。该系统相较于传统方法具有多项优势 体外 模型和侵入性外科成像技术。深入了解CD4 T细胞运动所依赖的通路，最终可能揭示CD4 T细胞的基本功能，以及自身免疫性疾病和慢性感染所致病理的发病机制。

研究免疫反应的能力 原位 在不改变免疫环境的情况下，研究效应T细胞与炎症组织的实时相互作用至关重要。通过本方案对完整耳部真皮进行成像，其步骤概述如下： 图1A 和 B，可实现对迁移至真皮间质的荧光标记T效应细胞的可视化观察。这使得高分辨率（图1C）以及延时（图1D, 视频 1炎症真皮中效应T细胞动态的图像。
<img alt="使用CFSE标记和二次谐波成像T细胞的过程；包括Th1细胞培养示意图。" src="/files/ftp_upload/53585/53585fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 在完整真皮间质中对T效应细胞进行高分辨率及4D成像</...

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

CD4 T细胞执行效应功能的能力依赖于这些细胞在炎症性外周组织中的快速而有效的迁移。

本成像方案的总体目标是可视化观察炎症皮肤中CD4阳性T细胞的动态行为。该方法有助于解答免疫学领域的一些关键问题，例如，免疫细胞在炎症组织中的运动机制及其功能机制是什么。该技术的主要优势在于，它提供了一种微创的方式，用于原位研究CD4 T细胞的动态行为。该方法的可视化演示至关重要，因为制备耳朵以进行成像的步骤难以掌握，且必须正确放置耳朵位置才能获得高质量图像。我是研究生 Alison Gaylo，将由我来进行本实验方案的演示。首先，用配备27.5号针头的注射器吸取300 µL荧光标记的效应T细胞悬液，每只小鼠注射300 µL。然后将注射器针头朝上，轻轻弹动注射器管体，必要时上下移动活塞，以排除所有气泡。待细胞悬液准备就绪后，将小鼠转移至清洁的笼子中，并置于加热灯下，直至尾部静脉充分扩张。随后将第一只小鼠放入固定器中，用酒精棉片擦拭尾部。确定侧尾静脉后，缓慢向静脉内注射 200 微升细胞。待所有细胞转移完毕后，用 28½ 号胰岛素注射器吸取 50 微升完全荧光素乳剂，并用力下压活塞以排除任何较大的气泡。然后将指套戴在左手食指上，用左手拇指和指套小心夹住小鼠耳朵，使耳腹面朝上。然后将针头斜面向上，插入耳廓外侧三分之一处的真皮层，位置略偏离中心，缓慢向组织内注射10 μL乳剂。完成所有动物的注射后，观察小鼠直至其完全恢复。免疫后第3天，按照前述方法扩张已注射动物的尾静脉。麻醉后，用一对镊子固定第一只小鼠的尾巴。用酒精棉片擦拭尾巴，然后小心地将30½号针头导管插入侧尾静脉，通过轻轻按压注射器活塞检查导管是否通畅。导管就位后，在注射部位涂抹一至两滴氰基丙烯酸酯组织粘合剂，并让粘合剂干燥约30秒。然后使用剪刀小心修剪胡须以及耳朵背面和侧面的毛发。接着用棉签蘸取 PBS 润湿耳部内表面。随后旋转小鼠，将注射侧耳朵平整地贴在 24 × 50 毫米的 1.5 号玻璃盖玻片上，直至耳朵与玻璃表面完全贴合。用棉签吸去多余的 PBS。然后使用两对弯头镊子分别夹住一段长约 20 毫米的织物胶带顶端的两个角，沿长度方向固定，并将胶带底端贴至小鼠耳部盖玻片的上方。将胶带向下滚动覆盖整个耳部，必要时用镊子将多余的毛发拨开，再用干燥的棉签轻轻按压胶带边缘，使胶带紧贴耳部，注意避免直接按压耳部组织。必须将耳部用胶带平整地固定在盖玻片上，确保两侧密封良好且尽量减少气泡，因为这会影响所获得图像的质量。现在将一个荧光显微镜成像平台用胶带固定在37°C的加热板上，并在平台耳部区域的两侧涂抹真空润滑脂。旋转小鼠，使盖玻片准确放置于平台上，注意将耳部对准毛毡中心位置。当耳朵固定到位后，将异氟烷鼻罩卡入平台上的支架中，确保鼻罩稳固并完全覆盖小鼠的鼻子。然后使用棉签牢固但小心地将盖玻片压在成像平台上，使真空脂在盖玻片下均匀铺开。用两段20毫米和两段较长的胶带缠绕平台的上部，将盖玻片固定在平台上。接下来，将小鼠移至显微镜载物台上。用更多胶带固定平台，并在耳部周围的盖玻片周围涂抹一层双层真空脂。然后用充满水的加热毯包裹小鼠，并向真空脂储液槽中加入37°C的蒸馏水。进行活体时间序列成像时，首先将物镜置于耳部中央上方，然后降低物镜，使其刚好接触到储液槽中水面。接着，利用外部光源，缓慢降低物镜，直至耳部表面清晰对焦。随后，放下显微镜载物台周围的内层和外层遮光帘，在多光子激光控制器窗口中将激光波长调整为900纳米，在采集设置的激光窗口中调节激光功率，并在图像采集控制窗口中调节光电倍增管（PMT）电压。在采集设置的尺寸和模式窗口中，将显微镜设置为512×512像素分辨率，像素驻留时间为2微秒，并选择XY重复以启动活体成像模式，用于扫描组织。找到合适的成像区域后，定位真皮层中位置最高的细胞，点击“设为零”按钮将Z轴位置设为零。沿Z轴方向向下移动，以测量细胞的深度范围。然后在采集设置显微镜窗口中设定起始和结束位置，并在明亮的Z窗口中调整仪器的PMT电压和激光功率，以优化在整个成像视野深度范围内细胞的可视化效果。勾选深度和时间选项，并在图像采集控制滤镜模式窗口中设置通用滤镜，使每条扫描线对图像进行三次扫描。在图像采集显微镜窗口中调整Z轴切片深度，使完整采集一个图像堆栈所需时间约为一分钟，具体时间可在时间视图窗口中查看。然后，为了评估组织的稳定性，在采集设置的时间扫描窗口中将重复次数设为5，点击扫描按钮，获取该区域为期五分钟的延时图像。如果组织在五分钟内保持稳定，则在采集设置的时间扫描窗口中将重复次数设为30至45次，采集30至45分钟的延时图像，并在图像采集过程中监测是否存在轻微的组织漂移。将抗体前图像以适当格式保存，然后用1毫升结核菌素注射器吸取抗体混合液，注意彻底排除所有气泡。轻轻按压推杆，使抗体溶液在针头末端形成液滴，然后掀开载物台周围的遮光帘以定位导管。将PBS注射器更换为含有抗体的注射器，随后缓慢将抗体注入导管中。当抗体成功注入后，重新放下遮光帘，并记录注射时间。然后立即在同一位置使用与抗体前成像相同的仪器参数，开始采集一段新的20至40分钟的成像序列。最后，将抗体处理后的图像文件以适当的格式保存，并小心地将小鼠从显微镜载物台上取下，持续监测动物状态直至其完全恢复。通过本方案对完整耳部真皮进行成像，可实现对炎症真皮中效应T细胞动态的高分辨率及时间推移成像。在这段视频中，可以观察到绿色的过继转移效应T细胞在真皮组织中移动。然而，在通过导管给予抗β1和抗β3整合素阻断抗体后，原本具有运动能力的细胞在真皮内停止移动。抗体给药后，这些细胞的平均速度降低，且其迂回指数也显著下降。即总位移与总轨迹长度的比值。毛囊的自发荧光、表层毛发造成的阴影以及盖玻片与耳片表面之间滞留的气泡所产生的自发荧光，均可能导致成像伪影，从而遮蔽T细胞的观察，并干扰自动图像分析软件的运行。此外，使用多个热源可能引起组织稳定性问题，导致成像过程中出现大幅振荡，使结果难以解读。一旦掌握，若操作得当，可在两到三小时内完成对真皮中 CD4 T 细胞的成像。在尝试该操作时，务必牢记遵循适当的动物护理与使用指南，以确保小鼠实验的规范进行。该方法可进行调整，用于在耳部组织中观察其他 T 细胞亚群或类型的免疫细胞，适用于不同的感染模型或不同的炎症诱导方法。在该技术发展之后，活体成像为免疫学领域的研究人员探索活体动物中正在进行的免疫反应动态过程开辟了道路。请务必注意，使用多光子激光器可能具有极高危险性，在执行此操作时应始终采取适当防护措施，例如正确屏蔽。观看本视频后，您应能够充分理解如何在小鼠耳部真皮中诱导炎症，以及如何利用活体成像技术获取抗体给药前后CD4 T细胞活动的延时图像。

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免疫学与感染

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