成像的CD4 T细胞间质迁移发炎真皮

该成像方案的总体目标是可视化发炎皮肤中的 CD4 阳性 T 细胞动力学。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如，免疫细胞运动的基础机制是什么，并在发炎组织中发挥作用。该技术的主要优点是它提供了一种原位研究 CD4 T 细胞动力学行为的微创方法。

这种方法的视觉演示至关重要，因为准备耳朵成像的步骤很难学习，并且必须正确定位耳朵才能捕获高质量图像。我是研究生 Alison Gaylo，我将演示该协议。首先将每只小鼠 300 微升荧光标记的效应 T 细胞悬液吸入配备有 27 号半针头的注射器中。

然后将注射器针头面朝上，轻轻弹动注射器的轴，根据需要上下移动柱塞以去除任何气泡。当细胞准备好后，将小鼠转移到一个干净的笼子中，并将它们放在加热灯下，直到尾静脉血管舒张。然后将第一只鼠标转移到限制器中，并用酒精棉签擦拭尾巴。

确定外侧尾静脉后，将 200 微升细胞缓慢注入静脉。转移完所有细胞后，将 50 微升完全荧光乳剂吸入 28 号半号胰岛素注射器中，然后用力按压柱塞以去除任何大气泡。然后将顶针放在左手食指上，小心地用左手拇指和顶针夹住鼠标的耳朵，腹耳朝上。

然后将针头斜面朝上滑入耳廓外侧三分之一处的真皮中，略微偏离中心，然后慢慢将 10 微升乳剂注入组织中。注射所有动物后，监测小鼠直至它们完全恢复。免疫接种后三天，如刚才所示，对注射动物的尾静脉进行血管扩张。

麻醉后，用一对镊子固定第一只老鼠的尾巴。用酒精棉签擦拭尾部，然后小心地将 30 号半规格的针头导管滑入尾部侧静脉，轻轻按压注射器柱塞以检查是否通畅。导管就位后，将一到两滴氰基丙烯酸酯组织粘合剂涂抹在注射部位，并让粘合剂干燥约 30 秒。

然后用剪刀小心修剪耳朵后面和两侧的胡须和头发。接下来，用棉签用 PBS 润湿耳朵内表面。然后旋转鼠标，将注射的耳朵压平到 24 x 50 毫米的 1 号 1 点 5 玻璃盖玻片上，直到它与玻璃齐平。

吸去多余的 PBS。然后用两对弯曲的镊子在顶角纵向抓住一条大约 20 毫米长的布带，并将胶带的底部放在鼠标耳朵顶部的盖玻片上。将胶带卷在耳朵的其余部分，必要时用镊子将多余的毛发推出，然后用干棉签轻轻按压胶带在耳朵周围，以确保紧密密封，注意不要压在耳朵本身。

必须将耳朵正确地贴在盖玻片上，两侧密封良好，气泡最小，因为这会影响可以获得的图像质量。现在将荧光显微镜成像平台贴在 37 摄氏度的加热块上，并在平台的耳区域两侧涂抹真空润滑脂。旋转鼠标将盖玻片放在平台上，注意将耳朵对准毛毡的中心。

耳朵就位后，将异氟醚鼻锥卡入平台上的支架中，确保鼻锥牢固，并完全覆盖鼠标的鼻子。然后用棉签用力但小心地将盖玻片压在成像平台上，将真空润滑脂涂抹在盖玻片下方。在平台的上部缠绕两片 20 毫米的胶带和两条较长的胶带，以将盖玻片固定到平台上。

接下来，将鼠标移动到显微镜载物台。用更多胶带固定平台，并将双层真空润滑脂通过管道输送到耳周围的盖玻片上。然后将装满水的加热毯包裹在鼠标周围，并在真空油脂储液罐中加入 37 摄氏度的蒸馏水。

对于体内延时成像，首先将物镜放在耳朵中心，然后降低物镜，直到它刚好接触到储液池中的水面。接下来，使用外部光源，慢慢降低物镜，直到耳朵表面聚焦。然后，降低显微镜载物台周围的内外窗帘，并在 MP 激光控制器窗口中将激光波长调整到 900 纳米，在采集设置激光窗口中调整激光功率，在图像采集控制窗口中调整 PMT 电压。

在采集设置大小和模式窗口中，将显微镜设置为 5 个 12 x 5 个 12 像素的分辨率，每个像素的停留时间为 2 微秒，然后选择 XY 重复以激活实时成像模式以扫描整个组织。找到合适的成像区域后，找到真皮中最高的细胞，然后单击设置零按钮将 Z 位置设置为零。沿 Z 方向向下滚动以测量像元深度的范围。

然后在采集设置显微镜窗口中设置开始和结束位置，并在明亮的 Z 窗口中调整仪器 PMT 电压和激光功率，以优化整个成像场深度中细胞的可视化。检查深度和时间按钮，并在图像采集控制滤镜模式窗口中设置一个通用滤镜，以每行扫描图像 3 次。调整图像采集显微镜窗口中的 Z 切片深度，以便捕获完整的堆栈大约需要一分钟，如时间视图窗口中所示。

然后，要评估组织的稳定性，请在采集设置时间扫描窗口中将重复次数设置为 5，然后单击扫描按钮以捕获该区域的 5 分钟延时图像。如果组织在 5 分钟后保持稳定，请在采集设置时间扫描窗口中将重复次数设置为 30 到 45 次之间，并收集 30 到 45 分钟的延时图像，在收集图像时监测任何轻微的组织漂移。以适当的格式保存抗体前图像，然后将抗体混合物吸入 1 毫升结核菌素注射器中，注意去除所有气泡。

轻轻按压柱塞，使抗体溶液在针头末端形成液滴，然后掀起载物台周围的窗帘以定位导管。用抗体注射器更换 PBS 注射器，然后将抗体缓慢注入导管中。成功注射抗体后，重新拉下窗帘并注意注射时间。

然后立即开始在相同的位置使用与抗体前图像相同的仪器设置收集新的 20 至 40 分钟成像序列。最后，以适当的格式保存抗体后图像文件，并小心地将小鼠从显微镜载物台上移开，监测动物直至完全恢复。通过该方案对完整的耳真皮进行成像有助于获取发炎真皮中效应 T 细胞动力学的高分辨率和延时图像。

在这部电影中，可以观察到绿色过继转移的效应 T 细胞在整个真皮组织中移动。然而，在通过导管施用抗 β 1 和抗 β 3 诱因素阻断抗体后，先前的运动细胞停滞在真皮内。抗体给药后，细胞的平均速度降低，并且其蜿蜒指数显着降低。

即，总位移与总轨道长度的比率。毛囊发出的自发荧光、覆盖头发的阴影和自发荧光，以及耳表面和盖玻片之间的气泡，都可能导致成像伪影，从而掩盖 T 细胞的可视化，并干扰自动图像分析软件。此外，使用多个热源会导致组织稳定性问题，导致成像过程中出现大振荡，从而难以解释结果。

一旦掌握，如果程序执行正确，可以在两到三个小时内完成真皮中 CD4 T 细胞的成像。在尝试此程序时，请务必记住遵循适当的动物护理和使用指南来处理老鼠。该程序可以适应使用不同的感染模型或不同的炎症诱导方法，以可视化耳朵中的其他 T 细胞亚群或免疫细胞类型。

开发后，活体成像为免疫学领域的研究人员铺平了道路，以探索活体动物持续免疫反应的动力学。不要忘记，使用多荧光体激光器可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如适当的屏蔽。看完这个视频，你应该对如何诱导小鼠耳真皮发炎，如何使用活体成像捕捉抗体给药前后CD4 T细胞活性的延时图像有了很好的了解。