生成一个 "人源化" 果蝇 对驱动蛋白-5药物抑制敏感的S2细胞系

本实验的总体目标是构建一种对驱动蛋白-5（Kinesin-5）小分子抑制剂敏感的黑腹果蝇S2细胞系，以便用于研究细胞分裂过程中的错误校正机制。细胞分裂过程中的错误校正，是指细胞通过破坏动粒与微管之间的错误连接，从而获得第二次机会或新的机会形成正确的连接，以确保基因组能够正确分离。该方法有助于解答细胞生物学领域中有关错误校正过程的关键科学问题。

该技术的主要优势在于，我们可以使用染色体数目较少且对驱动蛋白-5抑制剂敏感的黑腹果蝇S2细胞系，这两点均有助于观察单个错误校正事件。首先，取一个先前培养的、含有100%融合度的表达GFP-α-微管蛋白的S2细胞的25平方厘米培养瓶，将其中两毫升培养物转移至35毫米培养皿中。然后，在室温下孵育细胞约一小时，使其半贴壁。

移除培养皿中的培养基，向含有胎牛血清的1毫升Schneider培养基中加入2微克Eg5-mCherry质粒和转染试剂，按照生产商的说明书对细胞进行转染。用Parafilm封口膜密封培养皿，在25摄氏度条件下孵育细胞16至18小时。然后加入1毫升Schneider培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。

转染后第三天，将500微升转染细胞转移至一个新的35毫米组织培养皿中，该培养皿内含有1.5毫升Schneider培养基，用于测试诱导效果。为诱导Eg5-mCherry表达，加入硫酸铜至终浓度为500微摩尔。用Parafilm密封培养皿，并在25摄氏度下过夜培养。

将预先制备的22毫米×22毫米刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被的盖玻片放入洁净的35毫米组织培养皿中。随后，将500 µL 100%融合的诱导细胞接种至盖玻片上，并在室温下孵育使细胞贴壁。为检测Eg5-mCherry的表达，将盖玻片组装成玫瑰腔室（rose chamber），加入培养基，并根据文本方案中的指南，在室温下使用荧光显微镜进行成像。

在确认细胞同时表达 Eg5-mCherry 和 GFP 标记的 α-微管蛋白后，将剩余的转染但未诱导的细胞转移至一个 25 平方厘米的组织培养瓶中，内含 4 毫升 Schneider 培养基。向培养瓶中加入杀稻瘟菌素 S HCL（Blasticidin S HCL），使其终浓度为 25 微克/毫升，并在持续添加杀稻瘟菌素 S HCL 的条件下传代培养细胞，直至细胞死亡停止。根据文本方案制备 KLP61F 双链 RNA 后，将表达 Eg5-mCherry 的 S2 细胞以 25% 汇合度接种至 35 毫米培养皿中，并静置孵育 1 小时使其贴壁。

吸去培养皿中的培养基，向5微克双链KLP61F RNA中加入1毫升无血清Schneider培养基。室温孵育1小时后，加入1毫升含10% FBS的Schneider培养基。将细胞在25摄氏度下孵育。

dsRNA处理24小时后，加入硫酸铜至终浓度500微摩尔，诱导Eg5-mCherry表达。将细胞在25摄氏度下继续孵育24小时。进行活细胞成像时，将一块22毫米×22毫米的刀豆蛋白A包被的盖玻片放入洁净的35毫米组织培养皿中。

将经dsRNA处理并诱导过夜的细胞取500微升接种到盖玻片上，使其贴壁约1小时。根据正文方案收集双极纺锤体的时间推移图像后，从玫瑰培养腔中移除培养基，加入含有1微摩尔STLC的Schneider培养基，并更换该含STLC培养基两次，每次洗涤后弃去培养基，以观察纺锤体塌陷现象。为洗去药物并逆转纺锤体塌陷，小心地从玫瑰培养腔中移除含STLC的培养基并弃入废液容器中，随后使用总共6至8毫升的Schneider培养基分四次洗涤细胞，每次洗涤后均弃去培养基。

然后向腔室中加入新鲜培养基以重新填满，继续成像。若需更换药物或进行洗脱，可将玫瑰腔室固定在显微镜上后，小心移除顶部的盖玻片以接触培养基。或者，也可使用经刀豆蛋白A（Concanavalin A）处理过的玻璃底培养皿，其处理方式与盖玻片相同，可用于活细胞成像。

将经KLP61F dsRNA处理的S2细胞500微升接种至Concanavalin A包被的盖玻片上，待细胞贴壁后，加入1.5毫升Schneider培养基，使终体积达到2毫升。根据文本方案使细胞停滞于有丝分裂期后，加入1微摩尔STLC，孵育1小时，以诱导单极纺锤体形成。用2毫升新鲜Schneider培养基洗涤盖玻片三次，每次洗涤以去除STLC。

为了在双极纺锤体形成的不同时相固定细胞，并评估动粒附着位点，首先使用 2 毫升 1× BRB80 快速冲洗盖玻片。在通风橱中，加入含 10% PFA 的 1× BRB80 溶液 2 毫升，孵育 10 分钟。接着，为透化细胞，加入含 1% Triton X 的 1× PBS 溶液，孵育 10 分钟。

然后用 2 毫升含 0.1% Triton X 的 1×PBS 溶液洗涤细胞三次。接着将盖玻片（细胞面朝上）转移至一个 150 毫米培养皿中的 Parafilm 膜上。向盖玻片上加入 150 微升煮沸的驴血清（BDS），于室温孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。

孵育结束后，移除封阻物，根据文本方案加入150 µL一抗，于室温孵育1小时。盖玻片经洗涤三次后，加入用BDS稀释的Fluoro-4标记的二抗，于室温孵育30至60分钟。盖玻片再次洗涤三次后，加入含1 µg/mL DAPI的150 µL BDS，孵育5分钟。

盖玻片经两次洗涤后，取八微升封片剂，将样品细胞面朝下封于3英寸×1英寸的载玻片上。用指甲油封固盖玻片四角。最后，使用100倍物镜对表达Eg5-mCherry的具有双极纺锤体的细胞进行成像。

在所有通道中采集由30个平面组成的Z系列图像，每个平面间隔0.2微米。仔细分析动粒和微管，以确定其连接状态。KLP61F对于果蝇S2细胞中双极纺锤体的形成是必需的；然而，小分子驱动蛋白-5抑制剂对其无效。

这些图像表明，人源驱动蛋白-5（Eg5）能够挽救果蝇S2细胞中KLP61F的功能。当加入驱动蛋白-5抑制剂STLC后，马达蛋白在微管上的结合水平下降，纺锤体发生解体，导致因RNA干扰成功敲低内源性KLP61F的细胞形成单极纺锤体。该图显示，通过洗脱药物可逆转驱动蛋白-5的抑制作用，并可随时间观察双极纺锤体的恢复过程。在去除抑制剂后，Eg5-mCherry重新与微管结合，细胞可继续进入双极后期。

观看本视频后，您应能充分了解如何构建对驱动蛋白-5小分子抑制剂敏感的果蝇S2细胞系。若操作得当，掌握该技术后，整个过程约需六小时即可完成。在进行该实验时，提前规划至关重要，因为该方法需要提前数天进行准备工作。

请勿忘记，使用小分子抑制剂可能存在危险，因此务必佩戴手套。通过应用CRISPR-Cas9技术，并将黑腹果蝇的驱动蛋白Kinesin-5替换为其人类同源蛋白，即可构建人源化果蝇细胞。人源化果蝇细胞的开发将有助于未来加深对错误校正及其他重要细胞过程的理解。