Name: CN-GELFrEE - 透明天然凝胶洗脱液体馏分偷天陷阱电泳 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习CN-GELFrEE技术用于分离天然蛋白质复合物并保持非共价相互作用。该方法具有高回收率和低稀释优势，适用于质谱分析和下游蛋白质组学研究。

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W. M. Keck基金会为本研究提供了慷慨资助。本研究工作得到了巴西里约热内卢州政府FAPERJ研究基金（项目编号100.039/2014）对R.D.M.的资助、巴西政府高等教育人员提升协调办公室“科学无国界”奖学金（项目编号88888.075416/2013-00）对H.S.S.的资助、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（编号2014171659）对O.S.S.的资助，以及巴西政府CNPq研究基金（项目编号202011/2012-7）对L.H.F.D.V.的资助。P.C.H.获得了西北大学生命过程化学研究所博士后奖学金奖。

注意：本视频方案基于相关出版物9。执行本方案中所述所有步骤所需的特定试剂、材料和设备均列于材料部分。所有所需溶液的配制方法和相关信息详见表1。
1. 梯度管胶的灌制
<ol>
	<li>组装灌胶系统
	<ol>
		<li>使用火焰加热的剃刀刀片或手术刀，在移液管尖端上方10 cm处沿垂直方向切割一支20 ml的刻度移液管。确保切面光滑。保留底部带尖端的部分，丢弃上部。将移液管底部垂直夹在支架上（锥形尖端朝下）。 
		注意：切勿触碰加热后的金属刀片，应使用合适的把手或钳子以避免烫伤。</li>
		<li>截取一段3 cm长的软管，通过拉伸将其套在移液管的尖端上。将流量控制阀连接至软管的另一端。</li>
		<li>使用一段软管将阀的底部与梯度混合器的出液口连接。保持阀门处于打开状态。</li>
		<li>将梯度混合器置于磁力搅拌器上方，并在混合腔内放入磁力搅拌子。</li>
		<li>将梯度混合器的出液口置于移液管上端5–10 cm的高处，以便利用重力将凝胶倒入。</li>
		<li>使用去离子水测试系统是否泄漏。若无泄漏，继续用空气吹干系统内部。</li>
		<li>在移液管上端开口处覆盖两层或更多层胶带。在圆形开口中心位置刺穿一个小孔，确保孔径足够使玻璃管紧密穿过。</li>
		<li>将用于灌胶的玻璃管穿过胶带上的小孔，拉紧胶带以确保玻璃管固定紧密。插入玻璃管，使其底端距离移液管底部约2 mm。</li>
		<li>检查玻璃管是否被稳固居中固定，且未接触移液管管壁。系统现已准备就绪，可进行灌胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌制凝胶
	<ol>
		<li>配制凝胶缓冲液、APS和考马斯亮蓝溶液（溶液1–3，表1）。</li>
		<li>配制12% T（溶液4，表1）和1% T（溶液5，表1）的分离胶溶液。向12% T分离胶溶液中加入10 µl考马斯亮蓝溶液。在即将倒入梯度混合器前，立即向两种溶液中分别加入APS和TEMED。 
		注意：丙烯酰胺具有高度神经毒性，操作时必须佩戴手套。</li>
		<li>确保梯度混合器的出液阀处于关闭状态。将12% T分离胶溶液加入距离出液口最远的混合腔中。打开两腔之间的阀门，使溶液流入相邻腔室。</li>
		<li>关闭阀门，并用移液器将已流入相邻腔室的12% T分离胶溶液吸回原腔。此操作可避免腔室间产生气泡。</li>
		<li>将1% T分离胶溶液加入靠近出液口的混合腔中。开启磁力搅拌器。</li>
		<li>同时打开梯度混合器的两个阀门，使两种分离胶溶液在流动过程中混合，并流入移液管和玻璃管中。</li>
		<li>当梯度混合器中的分离胶溶液耗尽后，将软管从混合器上拆下，并连接至一支10 ml注射器。在牢固连接注射器前，确保软管末端始终高于移液管内液面。</li>
		<li>使用注射器缓慢将残留在软管中的分离胶溶液推入移液管和玻璃管中。在空气进入前关闭移液管阀门。</li>
		<li>在玻璃管内的凝胶溶液上方，轻轻加入约0.25 ml的水饱和正丁醇（溶液6，表1），以隔绝氧气，防止聚合反应受阻，并使凝胶表面形成平整的弯月面。</li>
		<li>立即用去离子水清洗灌胶装置（切勿使用洗涤剂）。</li>
		<li>在室温下静置过夜，以完成凝胶的完全聚合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从装置上取下凝胶管并储存
	<ol>
		<li>次日，小心地从装置顶部剥离胶带。</li>
		<li>断开移液管下方软管与阀门的连接。从夹具上取下移液管，并在水槽上方执行步骤1.3.3和1.3.4。</li>
		<li>将一支装有去离子水的10 ml注射器连接至软管。推动水流经软管进入移液管，缓慢将聚合完成的凝胶从移液管中推出。</li>
		<li>将移液管水平持握，小心接住从开口端滑出的凝胶。</li>
		<li>使用剃刀刀片切除玻璃管下方及周围多余的聚丙烯酰胺凝胶。确保凝胶末端与玻璃管尖端齐平，形成平整的端面。</li>
		<li>从凝胶顶部去除残留的正丁醇，将凝胶管放入一个未加盖的15 ml离心管中。将0.5 ml凝胶缓冲液（溶液1，表1）与4.5 ml超纯水混合，分别向凝胶管顶部（玻璃管内）和底部（离心管内）各加入约2 ml该溶液。</li>
		<li>用封口膜完全覆盖离心管顶部，包括玻璃管开口处，以防止缓冲液蒸发。凝胶可在4 °C下保存约两周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>称取两个小鼠心脏，使用剃刀片在培养皿中将其切碎。</li>
	<li>将处理后的组织转移至研钵中，加入足量液氮以完全覆盖样品。用研杵充分研磨组织，当液氮挥发时及时补充更多液氮。</li>
	<li>待组织彻底研磨后，让液氮自然挥发，随后按每100 mg组织加入1 ml预冷至4 °C的裂解缓冲液（溶液7，表1）。将溶液转移至离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟。小心收集上清液至新管中，弃去沉淀。使用二辛可宁酸法12或所选方法测定上清液中的蛋白浓度。注意：天然细胞裂解物或亚细胞组分可根据需要进行制备。CN-GELFrEE技术适用于多种不同的天然样品制备方式。</li>
	<li>配制溶解缓冲液和上样缓冲液（溶液8和溶液9，表1）。</li>
	<li>若样品为沉淀物，将其重悬于50–150 µl溶解缓冲液中，并在冰上孵育15分钟。</li>
	<li>使用30 kDa截留分子量的超滤离心滤器，将重悬后的样品或细胞裂解物与溶解缓冲液进行缓冲液置换。</li>
	<li>在4 °C条件下以10,000 × g离心5–10分钟，或直至保留液体积减少至约20 µl。弃去滤过液。</li>
	<li>向保留的样品中加入400 µl溶解缓冲液，用移液器吹打混匀。在4 °C条件下以10,000 × g离心5–10分钟，或直至保留液体积减少至约20 µl。弃去滤过液。</li>
	<li>重复步骤2.9两次。</li>
	<li>将过滤后的样品（约20 µl）用100 µl溶解缓冲液稀释。</li>
	<li>向样品中加入20 µl上样缓冲液。</li>
</ol>
3. CN-GELFrEE 装置
<ol>
	<li>为进行CN-GELFrEE分级分离，请参考机械加工车间制造装置部件，并使用聚四氟乙烯（Teflon）材料制造。有关制造各部件的所有必要信息，请参见图1；有关单个装置所需部件数量，请参见表2。 
	安全注意事项：穿戴适当的个人防护装备。操作高压电源时应格外小心，所有连接点必须正确安装。通电期间切勿触碰装置或任何邻近的湿润区域，电泳过程中应保持周围实验台面干燥。此外，在操作装置和/或收集组分时，应完全关闭电源。</li>
	<li>配制阳极缓冲液和阴极缓冲液（溶液10-11，表1），并将其保存在4 °C或冰上。</li>
	<li>将凝胶管顶部（无凝胶端）依次穿过一个垫片、一个O型圈和第二个垫片，以“三明治”方式组装。</li>
	<li>在第二个垫片后安装缓冲液室（阴极），将螺钉完全穿过侧孔，两侧加螺母并拧紧。确保玻璃管顶部固定在缓冲液室上端开口之前，而不是正下方或超出该位置。</li>
	<li>将凝胶管底部依次穿过一个垫片、一个O型圈、收集室和第二个垫片。</li>
	<li>在第二个垫片后安装缓冲液室（阳极），将螺钉完全穿过侧孔，加螺母并拧紧两侧。确保凝胶管底部固定在缓冲液室上端开口之后，靠近但不接触后壁。</li>
	<li>使用带夹具的支撑架将CN-GELFrEE装置垂直放置，阴极缓冲液室朝上。</li>
	<li>向阳极缓冲液室（底部）加入阳极缓冲液，向阴极缓冲液室（顶部）加入阴极缓冲液。所有缓冲液均保持在4 °C。</li>
	<li>轻轻敲击玻璃管以去除管内气泡，并检查系统是否泄漏。</li>
	<li>确保铂电极与各室中的缓冲液接触，并且凝胶管两端均浸入各自腔室的缓冲液中。</li>
	<li>将电源线连接至相应的香蕉插头：阴极缓冲液室（顶部）接负极，阳极缓冲液室（底部）接正极。</li>
	<li>使用凝胶加样吸头将样品加至凝胶管内凝胶的顶部表面。</li>
	<li>以1 W恒定功率运行凝胶，避免过热，直至红色染料前沿到达凝胶管底部。 
	警告：继续操作前请关闭电源。</li>
	<li>弃去阳极和阴极缓冲液。</li>
	<li>松开阳极缓冲液室侧的螺母，拆下底部垫片和腔室，保留一个垫片和O型圈。将凝胶管底端置于收集室内，位于其上端开口之前，不可超出或正下方。推动垫片和O型圈靠近收集室。</li>
	<li>裁剪一段纤维素透析膜，将其浸入阳极缓冲液中重新水化。用该透析膜覆盖收集室与底部垫片之间的开口。</li>
	<li>在第二个垫片后组装阳极缓冲液室，插入螺钉并拧紧螺栓。</li>
	<li>将装置水平放置于冰桶上。向缓冲液室加入新鲜的阳极和阴极缓冲液，并检查系统是否泄漏。</li>
	<li>向收集室中加入150 µl阳极缓冲液。重新连接电源线至相应的香蕉插头。</li>
	<li>开启电源，设置为3 mA恒定电流。此时染料前沿应开始洗脱进入收集室的缓冲液中。</li>
	<li>当整个染料前沿完全洗脱后，关闭电源，收集第一组分（0 min），并转移至低蛋白吸附的微量离心管中。</li>
	<li>用150 µl阳极缓冲液重新填充收集室。所有收集的组分均需置于冰上保存。</li>
	<li>从第一组分收集时间起，按以下时间间隔收集后续组分：2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、45 min和60 min。电源关闭期间的时间不计入。每次收集组分前务必关闭电源，并在两次收集之间用150 µl阳极缓冲液重新填充收集室。收集完成后再次开启电源，开始下一组分的洗脱。</li>
	<li>60 min后更换阳极和阴极缓冲液，向缓冲液室加入新鲜溶液。分别在90 min和120 min时收集组分。</li>
	<li>每小时更换一次阳极和阴极缓冲液。</li>
	<li>对所得组分进行透明天然PAGE或蓝色天然PAGE电泳，并按需染色。遵循试剂盒说明书或所选实验方案。</li>
	<li>进行还原型SDS-PAGE电泳，并按需染色。遵循试剂盒说明书或所选实验方案。</li>
	<li>对GELFrEE分级组分进行纯化处理，并按照先前所述方法9提交进行天然质谱分析。</li>
</ol>
<img alt="芯片实验室微流控腔室装置；包含缓冲液室和收集室，以及垫片示意图。" src="/files/ftp_upload/53597/53597fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：CN-GELFrEE 装置。 （A）GELFrEE 装置各部件的示意图；（B）已制造部件的照片；（C）CN-GELFrEE 装置组装示意图：（1）缓冲液室，（2）垫片，（3）O型圈，（4）凝胶管，（5）收集室，以及（6）透析膜。
<img alt="电泳凝胶制备表，详细列出缓冲液、丙烯酰胺、考马斯亮蓝染色体系。" src="/files/ftp_upload/53597/53597table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表1：溶液配制表。
<img alt="实验室设备组装的零件列表表，包括玻璃管、聚四氟乙烯腔室和导线。" src="/files/ftp_upload/53597/53597table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 2"> 
表 2：GELFrEE 装置零件表。

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell+as+a+Collection+of+Protein+Machines%3A+Preparing+the+Next+Generation+of+Molecular+Biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).</li>
<li>Gavin, A. C., Bösche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+vanadium+complexes+in+serum%2C+packed+cells+and+tissues+of+Wistar+rats+by+means+of+gel+filtration+and+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22JBIC+J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography.</a> JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+Density+Gradient+Sedimentation+to+Separate+and+Analyze+Multiprotein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+GELFrEE%3A+A+New+Separation+Technique+for+Biomolecular+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies.</a> Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).</li>
<li>Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+electrophoresis+to+study+mitochondrial+and+other+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes.</a> Methods. 26 (4), 327-334 (2002).</li>
<li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-Eluted+Liquid+Fraction+Entrapment+Electrophoresis%3A+An+Electrophoretic+Method+for+Broad+Molecular+Weight+Range+Proteome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation.</a> Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CN-GELFrEE 源自透明天然（CN）PAGE 缓冲系统，该系统使用阴离子和中性去污剂的混合物作为载体分子9，通过凝胶基质实现基于分子量的蛋白质分级分离。将 CN-GELFrEE 应用于天然小鼠心脏蛋白质提取物时，可获得复杂度较低且条带分明的组分，同时保持生物分子复合物中的非共价相互作用。对 CN-PAGE 与还原性 SDS-PAGE 胶片分离的组分进行比较，发现存在分子量偏移，表明大分子间非共价相互作用的丧失以及蛋白质链间二硫键的断裂。该结果证实了 CN-GELFrEE 分离过程的天然状态特性。
本方案中的某些步骤至关重要，需要格外注意。首先，在制胶完成后，应缓慢将凝胶管从装置上取下，并小心切除外部的聚丙烯酰胺。操作不当可能损伤凝胶，导致凝胶网络中产生气泡，或使凝胶从玻璃管上脱落。这些损伤会降低分离分辨率，必须彻底避免。其次，在电泳过程中，系统的电阻会随时间逐渐升高，从而产生热量，因此必须在低温室中进行操作，或在样品上样至凝胶后，将装置转移至冰桶中，以防止蛋白质因受热而发生变性。此外，在执行本方案时，还需注意该技术的一些关键局限性。过高的蛋白载量会降低C...

人们认为，细胞内发生的大多数生物过程是由蛋白质复合体而非单个蛋白质执行的1。因此，为了阐明某个蛋白质亚基在细胞中的特定生物学功能，必须了解其在复合物中与其他蛋白质或配体之间的结构相互作用2。然而，对蛋白质进行天然状态下的研究，同时保持其非共价相互作用和生物活性，仍然具有挑战性。天然蛋白质研究的局限之一在于缺乏一种合适的天然分离技术，能够与多种下游蛋白质分析方法兼容。因此，近年来人们对能够表征生物分子非共价复合物的分离技术的兴趣急剧增加3。
蛋白质分离技术对于生物化学、生物物理学及多种其他研究至关重要。目前的天然分离技术存在固有缺陷，会降低与下游分析的兼容性，例如分辨率低、通量低、因沉淀导致样品损失，以及需要大量初始样品。串联亲和纯化常用于蛋白质相互作用研究，但必须针对每种目标蛋白质单独进行，因此无法适用于高通量分析4。凝胶过滤色谱5、离子亲和色谱结合选择性沉淀5以及密度梯度分离6虽均可实现天然状态下的分离，但本质上均为低分辨率技术，且需要较高的初始样品量。
此外，基于凝胶的技术（如蓝色天然电泳（BN-PAGE）和透明天然电泳（CN-PAGE），无论是1维还是2维）可实现高分辨率分离。更重要的是，与其他上述技术不同，这两种天然PAGE方法能够维持多种大分子（包括疏水性蛋白质）的溶解性及其天然构象。这一特性进一步拓展了这些方法所覆盖的蛋白质组范围7,8，其原理源于CN-PAGE与BN-PAGE之间不同的化学机制。CN-PAGE通常依赖弱带电去垢剂作为载体分子，取代BN-PAGE中的考马斯亮蓝染料。尽管BN-PAGE具有更高的分辨率，但也存在一些局限性，例如分离后的蛋白质酶活性降低8，以及考马斯亮蓝分子加合物的形成，后者会严重干扰后续质谱（MS）分析9。然而，由于染色和凝胶提取的限制，这两种方法传统上均存在回收率低和蛋白质组覆盖范围窄的问题7。
在变性蛋白质研究中，存在多种技术可在实现高分辨率分级分离并保持高蛋白回收率的同时，维持大分子的可溶性，并且兼容多种分离后的蛋白质分析技术。凝胶洗脱液相分馏电泳（GELFrEE）便是满足上述所有特性的分级分离技术之一。该方法广泛应用于高通量自上而下蛋白质组学研究，表明其具有快速且多用途的特点。在GELFrEE中，蛋白质经变性后，通过可调节孔隙度的管状凝胶基质按分子量进行分离，其孔隙度可根据样本需求和期望的分级结果进行调整。分离后的组分以液相形式洗脱，从而在保持高分辨率的同时，减少了与SDS-PAGE相关的回收率限制。随后，可对各分馏组分进行一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1-D PAGE）分析，以选择分子量范围11。目前对在天然状态分离技术中应用GELFrEE优势的需求日益增加。本文所述的方法——透明天然GELFrEE（CN-GELFrEE），是GELFrEE的一种天然状态改良版本。为兼容多种处于天然状态的大分子，该方法不仅依赖于温和的CN-PAGE化学体系，还采用了孔隙度梯度分离，从而避免了不连续凝胶系统中不同孔隙度之间的剧烈过渡，减少蛋白质沉淀的发生9。当应用于从小鼠心脏提取的蛋白质复合物进行分级分离时，洗脱组分表现出高回收率，并实现了宽分子量范围内的高分辨率分离。此外，所得各组分适用于大多数下游生化与生物物理蛋白质分析方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td>该溶液具有神经毒性。</td></tr><tr><td>6-氨基己酸（&amp;epsilon;-氨基己酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td>该化学品具有刺激性。</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td>该化学品易燃、有毒且具有腐蚀性。</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基麦芽糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td>该化学品具有刺激性。</td></tr><tr><td>乙二醇四乙酸（EGTA）</td><td>FLUKA</td><td>3777</td><td>该化学品有毒。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td>该化学品有毒。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>将液氮储存在专为低温液体设计的容器中&lt;br/&gt;中&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>小鼠心脏</td><td>Bioreclamation LLC</td><td>MSE-HEART</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>71-36-3</td><td>该化学品易燃且有毒。</td></tr><tr><td>丽春红 S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP103</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78430</td><td>该化学品有毒。</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>该化学品具有刺激性。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>JTBaker</td><td>4097</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>该化学品易燃且具有刺激性。</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-071</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>梯度混合器</td><td>Hoefer</td><td>SG15</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器&amp;nbsp;</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子&amp;nbsp;</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>尺寸需足够小以放入梯度混合器腔室中。</td></tr><tr><td>电源</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td>电压最高可达 1,500 V</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>022622552</td><td>最高可达 15,000 × g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa 分子截留量超滤离心管</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>柔性管</td><td>Saint-Gobain</td><td>B000FOV1J0</td><td>长度约 1 m</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>金属或塑料液/气阀门（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;水族箱用空气/水流控制阀）</td><td>任意供应商&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>水族箱阀门兼容。</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>天然 PAGE 3-12% T 板胶</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>低吸附蛋白管 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>IDL Tools</td><td>TE05-091C</td><td></td></tr><tr><td>再生纤维素透析管，3,500 分子截留量</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-9</td><td></td></tr><tr><td>任意 kDa 范围的 SDS-PAGE 板胶</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td></td></tr><tr><td>移液管（25&amp;nbsp;ml）</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 ml）</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

cn-gelfree - 清亮天然凝胶洗脱液相组分捕获电泳

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

蛋白质复合物执行多种关键的细胞功能。阐明其非共价相互作用和动态特性，对于理解复合物在生物系统中的作用至关重要。尽管近年来对生物大分子组装体的直接表征变得越来越重要，但仍需要能够与下游分析技术（包括质谱）兼容的天然状态分离技术，以进一步拓展这些研究。然而，目前该领域尚缺乏一种适用于天然蛋白质组装体的高通量、宽范围、高回收率的分离方法。本文介绍了清晰天然凝胶洗脱液相捕获电泳（CN-GELFrEE），这是一种针对非共价蛋白质组装体的新型分离模式。通过分离从小鼠心脏中提取的复合物，验证了CN-GELFrEE的分离性能。在2小时内收集到多个组分，显示出分子量范围约为30至500 kDa的离散条带。观察到分子量区间呈一致递增模式，每个区间跨度约为100 kDa。此外，通过SDS-PAGE对天然组分进行再次分析，结果显示分子量发生偏移，符合蛋白质复合物变性的特征。因此，CN-GELFrEE被证实能够在较宽分子量范围内对蛋白质复合物实现高分辨率、高回收率的天然状态分离，并提供适用于下游蛋白质分析的组分。

从低温研磨的小鼠心脏中提取的200 µg蛋白质，使用CN-GELFrEE方法在1-12% T凝胶管中进行天然分级，分为14个组分，每个组分150 µl。每个组分取10 µl上样于CN-PAGE平板凝胶并进行银染。CN-GELFrEE分级所获得的分离效果和分辨率清晰地展示在图2A中。组分在两小时内连续收集，凝胶分析显示分子量呈稳定递增趋势，范围约为30至500 kDa。每个组分所含蛋白物种的质量跨度约为100 kDa。各组分间分子量范围的重叠较小，且随着组分间收集次数的增加，重叠进一步减少。此处所示的CN-PAGE平板凝胶仅代表从每个150 µl组分中回收蛋白总量的6%。
将CN-GELFrEE天然洗脱的各组分分别进行还原和变性处理，然后在SDS-PAGE平板凝胶上进行电泳。在还原型SDS-PAGE平板凝胶（图2B）中，与相应的天然组分（图2A）相比，所...

本方案描述了如何制备并实施透明天然凝胶洗脱液相分离电泳（CN-GELFrEE），这是一种适用于从异质样品中分离非共价生物分子复合物和蛋白质的天然分离技术，且可与多种下游蛋白质分析技术兼容。

CN-GELFrEE - 清亮天然凝胶洗脱液相组分捕获电泳

蛋白质复合物执行多种关键的细胞功能。阐明其非共价相互作用与动态变化对于理解……至关重要

该新型分离技术的总体目标是在保持非共价大分子相互作用（如蛋白质复合物）的同时，实现对天然样品的高效回收和高分辨率分级分离。该方法有助于解答天然大分子复合物研究中的关键问题，例如复合物的组成和化学计量关系。该技术的主要优势在于其高回收率和低样品稀释度，这是其他任何天然分离方法都无法比拟的。首先组装制胶装置。第一步是使用加热的刀片切掉一支20毫升血清移液管的管尖。从加样端顶部垂直向下10厘米处进行切割。然后，将剪断的移液管尖端夹在支架上。接着，剪取一段三厘米长的管路连接至尖端。将管路的一端拉伸套在尖端上，并安装一个流量控制阀。使用另一段管路将阀门连接到梯度混合器的分配尖端。暂时保持阀门打开。接下来，将梯度混合器置于磁力搅拌器上，并将搅拌子放入混合室中。现在，使用去离子水测试系统是否存在泄漏。然后，通过向系统内吹入空气使其干燥。在移液管部分的顶部覆盖两层胶带。然后，用穿孔工具在胶带层上打一个孔，并将一根玻璃管穿过该孔。将玻璃管延伸至距离底部两毫米以内。玻璃管必须与胶带紧密贴合，且不得接触移液管管壁。现在开始灌胶。关闭分配阀，将12%T分离胶溶液加入距离分配尖端最远的混合室中。为防止气泡产生，打开腔室之间的阀门，使溶液流动。然后，关闭阀门，使用移液器将移位的凝胶溶液转移回前一个腔室。接着，在靠近分配尖端的混合腔中加入1%T凝胶，并启动磁力搅拌器。随后，打开流路阀门，同时打开梯度混合器的两个阀门，使两种凝胶溶液混合并流入玻璃管中。操作完成后，将管路连接至一个10毫升注射器，并保持其位置高于液面。然后，使用注射器将管路中剩余的凝胶溶液推入移液管和试管中。在空气进入之前，关闭阀门。接下来，用移液器轻轻将约 0.25 毫升已饱和水的正丁醇加至凝胶上方，以封闭聚合反应。在室温下静置过夜进行反应。次日，小心地从装置顶部撕下胶带，将阀门从移液管下方的管路中拆下，并将移液管从夹具上松开。在水槽上方，将装有去离子水的10毫升注射器连接到管路上，用此水缓慢将聚合后的凝胶从移液管中推出。然后修整多余的凝胶，使其与玻璃边缘齐平且表面光滑。将凝胶管保存在0.1 X缓冲液中，并用封口膜覆盖。制造完CN-GELFrEE装置的各个部件后，将其组装。首先，将不含凝胶的一端凝胶管以三明治方式依次穿过一个垫圈、一个O形圈和第二个垫圈。然后，在第二个垫圈之后安装阴极缓冲液室。将螺钉完全穿过侧面孔洞，并在两侧拧紧螺母。确保玻璃管的顶端固定在缓冲液室上端开口的正上方，不得位于其正下方或超出该位置。接着，将凝胶管的底端依次穿过一个垫圈、O型圈、收集室、第二个垫圈，然后将阳极缓冲液室像安装阴极缓冲液室一样进行连接。确保凝胶管的底端固定在缓冲液室上端开口的上方。同时，凝胶管应靠近后壁但不接触。现在，将电泳装置垂直夹紧，阳极朝上。然后，向两个室中加入4°C的阳极或阴极缓冲液。轻敲以排出任何气泡，并检查是否泄漏。铂电极

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CN-GELFrEE  - 透明天然凝胶洗脱液体馏分偷天陷阱电泳

使用 GELFREE 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离

在本视频中，我们介绍了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）对多蛋白复合物（MPCs）进行表征的方法。在第一维中，将透析后的细胞裂解液通过BN-PAGE分离，以鉴定各个MPCs。在第二维SDS-PAGE中，对感兴趣的MPCs进一步分离，以便通过免疫印迹分析其组成成分。...

用于分析细胞裂解液中多蛋白复合物的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）

本实验方案展示了如何通过重复使用Invitrogen Nupage...

使用商用凝胶盒重复制备和电泳蛋白凝胶

本文介绍了一种利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的基本实验方案。...

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

Gel-seq 使研究人员能够利用一种简单的水凝胶装置，从 100 至 1000 个细胞起始，以可忽略的额外成本同时制备 DNA-seq 和 RNA-seq...

Gel-seq：一种利用水凝胶基质同时进行DNA和RNA测序文库构建的方法

本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。...

用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

本文介绍了一种使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化（PCD）方法的实验方案。...

使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化

开发了一种盘状磷酸锆的二维模型材料。这种具有层状结构的无机晶体通过水热法、回流法和微波辅助法合成。在有机分子作用下发生剥离时，层状晶体可转化为单层，当单层浓度足够时，可形成向列相液晶相。...

盘状磷酸锆的合成与剥离以制备胶体液晶

学习CN-GELFrEE技术用于分离天然蛋白质复合物并保持非共价相互作用。该方法具有高回收率和低稀释优势，适用于质谱分析和下游蛋白质组学研究。

CN-GELFrEE - 清亮天然凝胶洗脱液相组分捕获电泳

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