利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

PSmOrange光转换技术的总体目标是在胚胎发育和疾病过程中追踪活体动物中的细胞。该方法可以回答发育生物学中的关键问题，例如揭示发育形成组织和器官的细胞来源。该技术的主要优势在于其可应用于GFP转基因背景中。

该方法还可应用于再生、肿瘤进展与侵袭等不同研究领域。根据文本方案生成并包埋表达PSmOrange和GFP的胚胎后，将胚胎置于共聚焦显微镜下，使用20倍空气物镜以及488和561纳米激光扫描样品，以确定待光转化的区域。在光转化前检测PSmOrange蛋白时，使用561纳米激光，其在物镜上方焦平面处的功率为0.74毫瓦，并根据需要调整激光功率。

调整缩放倍数以突出显示目标区域，并减少图像采集时间和光毒性。使用488纳米和561纳米激光的顺序扫描模式，以及1.0至2.0微米的Z步进，采集覆盖目标结构的Z轴层扫图像。调节线平均和扫描频率以优化图像质量。

然后扫描样品，并选择感兴趣区域（ROI）工具，以高亮标记待光转化的区域，随后将该区域固定为刺激区域。选择光激活漂白模块，勾选以激活488纳米激光，将488纳米激光强度设置为80%，扫描速度设置为每帧0.5秒。接下来，打开光转化工具，点击“添加”以设定光转化程序。

在采集刺激菜单中，将第一阶段设置为采集，并在循环菜单中注明光转化前需采集的图像数量。将第二阶段设置为刺激，并输入将要执行的刺激事件次数。按照第一阶段的描述调整第三阶段。

可选择在第二阶段后插入一个等待阶段，输入在最后一轮图像采集前的等待时间。参数设置完成后，应用刺激设置并运行光转化。显微镜设置对于 PSmOrange 光转化至关重要。

为了确保光转化成功，实验结束后应立即对胚胎进行成像，以检测已光转化的 PSmOrange 蛋白。如果转化未成功，则需重复该操作。使用 488、561 和 640 纳米激光器，并将 640 纳米激光器设置为高功率（最高 4.5 毫瓦），按照上述设置采集最终的 z 层扫描图像。

为取下胚胎，先将培养室从显微镜上移除，然后用镊子将胚胎从琼脂糖中取出。将胚胎转移至新的已灭菌塑料培养皿或已灭菌的6孔板中，其中含有含0.2毫摩尔PTU的E3培养基。在28摄氏度下孵育胚胎，直至达到所需的发育阶段。如需分析光转化PSmOrange蛋白表达细胞的命运，请根据正文中的实验方案重新包埋胚胎。

在共聚焦显微镜下扫描样品，识别目标GFP转基因结构中发生光转换的细胞。使用488、561和640纳米激光，以顺序模式采集z轴堆栈图像，步长固定为1至2微米，覆盖相关结构。利用Image J Fiji软件，鉴定同时表达GFP和光转换蛋白的细胞。

复制原始图像栈，使用高斯模糊插件和图像计算器将平滑处理后的图像栈从原始图像中减去。对绿色和远红通道应用特定的阈值，以突出显示光转化的细胞。然后使用“分析颗粒”工具，通过合适的设置检测绿色通道中达到阈值的区域。

对远红通道重复此步骤。打开图像计算器插件以检测共定位的细胞。使用“分析颗粒”工具将绿色或远红通道中重叠的 ROI 以黄色显示。

使用 NIS-Elements 软件进行三维数据评估，并通过“显示体积视图”（Show Volume View）选项以三维形式显示图像堆栈。然后使用图形界面选择绿色、红色和远红通道，调节亮度和对比度，并对三维堆栈进行裁剪，以突出显示光转化区域。此处展示的是在斑马鱼转基因 FOXD3 floating head GFP 胚胎中 PSmOrange 光转化系统的示例。

受精后26小时，对松果体前部的两个细胞簇进行光转化并立即成像。该蛋白可被640纳米远红激光检测到，但无法被561纳米激光检测到。在这些细胞中，由于光漂白作用，GFP的表达最初有所降低。

在52小时后受精（HPF）时，在表达光转化H2B PSmOrange蛋白的细胞中检测到GFP和H2B PSmOrange信号。其中少数细胞在脑的左侧形成了副松果体。该结果与先前关于副松果体细胞起源于前松果体的报道一致，表明PSmOrange技术可应用于活体GFP转基因脊椎动物胚胎中。

通过该实验流程，可在经过遗传操作的胚胎中进行细胞示踪分析，以进一步探究细胞发育过程中相关分子层级机制的问题。