Name: 在GFP-转基因斑马鱼使用Photoconvertible PSmOrange系统追踪单元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习使用PSmOrange光转换技术在GFP转基因斑马鱼中进行活体细胞追踪，揭示胚胎发育和疾病过程中细胞的起源与行为。该方法适用于发育生物学、再生医学和肿瘤研究等领域。

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我们感谢 O. Subach 提供原始的 H2B-PSmOrange 质粒，以及我们的鱼类养殖团队对斑马鱼的悉心照料。我们感谢海德堡大学尼康影像中心提供显微镜设备和图像分析软件的使用权限。我们感谢曼海姆细胞与生物治疗医学中心（CBTM）活细胞成像核心设施（DFG INST 91027/10-1 FUGG）提供的支持。本研究得到了海德堡大学卓越集群 CellNetworks 项目“信号过程的时空协调”（EcTop 2）对 C.A.B. 的资助，以及海德堡大学曼海姆医学院和德国研究基金会（DFG）（项目编号 FOR 1036/2、298/3-1 和 298/6-1）对 M.C. 的资助。

1. H2B-PSmOrange mRNA 体外 转录与mRNA纯化
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用 NotI 限制性内切酶将含有 H2B-PSmOrange 的 pCS2+ 质粒线性化。 
	注意：进行后续步骤时应采取适当的防护措施，例如佩戴手套和实验服，以防止 mRNA 污染和降解。</li>
	<li>根据制造商方案，使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿法纯化线性化 DNA。</li>
	<li>根据制造商说明，使用 1 µg 线性化模板 DNA 进行 Sp6-mRNA 转录。</li>
	<li>加入 1.0 U 无 RNase 的 DNaseI，在 37 °C 下孵育 10–20 分钟以去除 DNA。</li>
	<li>根据制造商方案，使用 RNA 纯化试剂盒对 mRNA 进行纯化。</li>
	<li>为提高 mRNA 纯度和浓度，加入 6 µl 乙酸钠（3.0 M，pH 5.2）和 150 µl 96% 乙醇沉淀 mRNA。将混合溶液在 -20 °C 下孵育至少 30 分钟，最长可达 24 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以 18.407 × g 离心 45 分钟收集 mRNA。弃去上清液，将 mRNA 重悬于 150 µl 70% 乙醇中。混匀后在 4 °C 下再离心 15 分钟。弃去液体，将沉淀在冰上干燥 5 分钟，然后将 mRNA 重悬于 20 µl 超纯无 RNase 水中。</li>
	<li>通过分光光度法测定 1:100 稀释的 mRNA 溶液（1 µl mRNA 加 99 µl 超纯无 RNase 水）来评估 mRNA 的浓度和纯度。</li>
	<li>短期储存时，将 mRNA 溶液保存在 -20 °C；长期储存时，将 mRNA 保存在 -80 °C。</li>
</ol>
2. 斑马鱼胚胎中H2B-PSmOrange mRNA的显微注射
<ol>
	<li>在注射前一晚设置交配对，使用 tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP) 双转基因鱼（或其他任何GFP转基因鱼）。通过在鱼之间放置隔离板使其保持分离，以控制交配时间。</li>
	<li>在注射当天早晨移除隔离板，让鱼交配20分钟。</li>
	<li>在交配期间，将H2B-PSmOrange mRNA用无RNase水稀释至终浓度为130 pg/nl，并用微量进样器吸头将6 µl注射液转移至显微注射毛细管中。使用校准过的玻璃载片检查注射体积。调节注射压力，使每次注射2 nl mRNA溶液（260 pg）。</li>
	<li>将受精卵收集到含有1x 胚胎（E3）培养基的无菌塑料培养皿中。</li>
	<li>用塑料巴斯德吸管将20至30个胚胎转移至注射用培养皿中。</li>
	<li>在单细胞阶段，将含有2 nl mRNA的溶液注射入细胞内或紧贴细胞下方的卵黄中11。</li>
	<li>将注射后的胚胎转移至含有1x E3培养基的培养皿中，去除未受精或发育异常的胚胎，并在28 °C下培养。 
	注意：整个实验过程中无需对胚胎进行避光保护。</li>
	<li>在1x E3培养基中培养斑马鱼胚胎，在原肠胚形成后加入0.2 mM PTU（1-苯基-2硫脲）以抑制色素形成。每天更换两次培养基，以尽量减少细菌污染的风险。</li>
</ol>
3. 胚胎包埋
<ol>
	<li>使用配备荧光灯和适当发射滤光片的双目显微镜，筛选出共表达GFP（绿色）和PSmOrange（橙色/红色）的胚胎。将阳性胚胎转移至含有1x E3培养基的无菌培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下使用镊子去除胚胎的绒毛膜12。</li>
	<li>用剪口吸头（P200）将一个胚胎转移至含有1.0 ml预热的1.0%低熔点琼脂糖（LMA）的1.5 ml离心管中，LMA使用超纯水配制。注意：将LMA加热至80 °C后，于室温冷却3–5分钟，再进行胚胎包埋。</li>
	<li>将胚胎连同150 µl LMA转移至玻璃底共聚焦培养皿中，使用细塑料吸头调整胚胎方向，例如在本实验所描述的倒置共聚焦激光扫描显微镜A1R+（或其他合适的显微镜）中，使胚胎背侧朝下。待LMA凝固后，向腔室内加入含有0.2 mM PTU和0.02%甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸（Tricaine）的养鱼水以进行麻醉。</li>
	<li>成像前需等待15分钟，以确保Tricaine发挥麻醉效果。麻醉可防止胚胎移动，可通过配备明场照明的体视显微镜监测胚胎状态。 
	注意：培养腔室可重复使用两次。</li>
</ol>
4. PSmOrange 光转换
<ol>
	<li>将样品置于共聚焦显微镜下，使用488 nm和561 nm激光分别对GFP和PSmOrange进行成像，扫描样本以确定需要光转化的区域。 
	注意：使用由显微成像软件控制的倒置共聚焦激光扫描显微镜A1R+（配备倒置载物台TiE），该系统配有用于光转化和成像的488 nm、561 nm和640 nm激光器。然而，只要具备用于转化和成像的激光谱线，本应用并不局限于该型号显微镜。
	<ol>
		<li>安装20倍空气物镜（NA：0.75；WD：1.0 mm；视场：0.64 × 0.64 mm）。</li>
		<li>在光转化前使用以下显微镜设置检测PSmOrange蛋白：561 nm激光，物镜上方焦平面测得功率为0.74 mW。 
		注意：在此系统中相当于40%输出功率（在焦平面测量是确定有效功率的唯一方法）。根据实验需求调整激光功率，因为H2B-PSmOrange注射效率可能因样本而异。</li>
		<li>增加放大倍数以突出目标区域。更高的放大倍数可缩短图像采集时间，从而降低光毒性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用488 nm和561 nm激光以逐行扫描模式（line mode 1-&#62;4）获取覆盖目标结构的z轴层扫图像。固定z轴步进在1.0至2.0 µm之间。可通过线平均和扫描频率优化图像质量。</li>
	<li>扫描样品并选择“感兴趣区域”（ROI）工具以标记待光转化区域，将ROI设定为刺激区域。选择“光激活/漂白”模块，勾选对应选项以启用488 nm激光，并将488 nm激光设为80%（在物镜处测得激光功率为1 mW）。将扫描速度设为0.5秒/帧。</li>
	<li>打开光转化工具（ND Stimulation），设定光转化参数。
	<ol>
		<li>点击&#34;添加&#34;命令以设定光转化程序。</li>
		<li>在&#34;采集/刺激&#34;菜单中将&#34;阶段&#34;1设为&#34;采集&#34;，并在&#34;循环&#34;菜单中指定光转化前需采集的图像数量。</li>
		<li>将&#34;阶段&#34;2设为&#34;刺激&#34;，并输入将执行的刺激次数。</li>
		<li>按照&#34;阶段&#34;1的设定方式调整&#34;阶段&#34;3。可选操作：在&#34;阶段&#34;2之后插入一个等待&#34;阶段&#34;，输入在最后一轮图像采集前的等待时间。</li>
		<li>所有参数设定完成后，应用刺激设置并运行光转化。 
		注意：每次光转化的激光功率、扫描频率和循环次数可能因胚胎不同而有所变化。一个可作为起始参考的设置见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用488 nm、561 nm和640 nm激光，按照上述设置获取最终的z轴层扫图像。将640 nm激光设为高功率（最高达4.5 mW）以观察转化后的PSmOrange。</li>
</ol>
5. 从LMA上卸下胚胎
<ol>
	<li>从显微镜上取下含有胚胎的培养室。用镊子小心地将胚胎从琼脂糖中取出。</li>
	<li>将胚胎转移至新的灭菌塑料培养皿中，或转移至含有1x E3和0.2 mM PTU的灭菌6孔板中。在28 °C下孵育胚胎，直至达到所需发育阶段。</li>
</ol>
6. 分析光转化PSmOrange蛋白表达细胞的命运
<ol>
	<li>按照第 3.3 和 3.4 步所述重新包埋胚胎。</li>
	<li>将样品置于共聚焦显微镜下，扫描样本以在目标 GFP 转基因结构（488 nm）中识别光转化细胞（640 nm）。</li>
	<li>使用 488 nm、561 nm 和 640 nm 激光以顺序模式（线扫描模式 1-&#62;4）采集覆盖目标结构的 z 轴层扫图像。z 轴步长固定在 1.0 至 2.0 µm 之间。可通过设置线平均和扫描频率来优化图像质量。</li>
	<li>采用以下方法之一识别共表达 GFP 与光转化蛋白的细胞。
	<ol>
		<li>自定义的 Fiji ImageJ 宏程序3
		<ol>
			<li>使用 &#34;GaussianBlur&#34; 插件对原始图像栈进行卷积（→ Process → Filters → GaussianBlur），然后使用 &#34;Image Calculator&#34; 插件（→ Process → Image Calculator）将平滑后的图像栈从原始图像中减去。此步骤可用于突出显示目标结构并减少后续分析的计算时间。</li>
			<li>对绿色和远红通道应用特定阈值，以突出光转化细胞（→ Image → Adjust → Threshold）。使用 &#34;Analyze Particles&#34; 工具在合适参数下检测阈值区域（→ Analyze → Analyze Particles）。</li>
			<li>打开 &#34;Image Calculator&#34; 插件，显示绿色与远红通道中重叠的感兴趣区域（ROI），重叠区域以黄色呈现（→ Process → Image Calculator）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>显微镜成像软件用于三维数据评估
		<ol>
			<li>使用“显示体积视图”选项以三维方式显示图像栈（→ 3D Visualization Menu → Show Volume View）。通过图形界面选择绿色、红色和远红通道，调节亮度与对比度，并对三维图像栈进行裁剪以突出光转化区域（图 1）。 
			注意：大多数常用的图像分析软件均提供类似的数据分析方法。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein%2C+PSmOrange%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li>
<li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19(2013).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
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<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
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<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

携带荧光报告基因的转基因胚胎已从根本上帮助人们理解胚胎发育过程。然而，目前仍迫切需要特异性启动子，以实现对特定结构的可视化观察。在缺乏此类启动子的情况下，研究人员依赖于荧光蛋白光转化等技术，以探究其目标结构的起源与发育过程。而这一点反过来又是识别其发育过程中所涉及的分子机制的关键前提。斑马鱼领域的技术进步现已允许通过CRISPR-Cas9介导的基因敲入方法，将转基因品系中的荧光蛋白（FP）替换为例如可光转化蛋白14,15。然而，该技术相对耗时，且并非总能成功。相比之下，在GFP背景（以及可能的其他转基因背景）中普遍表达H2B-PSmOrange是一种直接有效的方法，可用于追踪胚胎发育过程中的细胞动态。
例如，斑马鱼腹侧缰核是脊椎动物间脑背侧保守神经传导系统的一部分，其起源直到最近才被揭示，因此此前一直未能发现调控其发育的基因级联机制。通过使用PSmOrange系统和长期延时成像分析来追踪迁移的细胞，我们发现，与位于松果体两侧的背侧缰核不同，腹侧缰核神经元在丘脑中起源于该区域后方3。这一发现使我们得以鉴定出经典Wnt信号通路下游基因Tcf7...

不断指数级改进的成像技术使得能够对发育过程进行长达连续约四天的时间序列追踪3。在斑马鱼及许多其他动物模型系统中，通常利用转基因表达的绿色荧光蛋白，有时也使用红色或黄色荧光蛋白，来标记特定的细胞、组织、轴突或血管结构，以方便观察。然而，在大多数转基因品系中，转基因并非仅在目标细胞中特异性表达，还会在其他额外结构中表达，这会阻碍对单个细胞或细胞群体的精确追踪。
荧光光转化蛋白非常适合在胚胎发育过程中进行细胞示踪。此类蛋白的应用需满足若干前提条件：具有较长的寿命、光转化后发射波长范围区分明显，以及荧光信号明亮。目前已有的光转化蛋白包括在光转化后发射波长发生变化的蛋白，如 Kaede4、KiGR5、mEos26、PS-CFP2 或 Dendra27，以及仅在光激活后产生荧光的蛋白（如 PAmCherry8、PAGFP9 或 PATagRFP10）。然而，这些蛋白在现有的荧光蛋白转基因动物中用于细胞追踪时应用受限，因为它们通常具有绿色荧光状态，或未能完全满足上述所有条件。直到最近，Subach 及其同事才报道了 PSmOrange 蛋白，该蛋白在光转化后发射波长由橙红色转变为远红光，并已在培养细胞以及注射至小鼠体内的培养细胞中成功应用2。
为了研究该蛋白在活体胚胎中进行细胞示踪的适用性，我们构建了用于显微注射的核定位标记H2B-PSmOrange表达载体，并将其注入斑马鱼胚胎中。我们发现，该蛋白在斑马鱼胚胎发育的前4天（甚至更长时间）内，在GFP转基因背景下完全满足成功细胞示踪的所有先决条件。在此期间，鱼类中的大多数细胞迁移事件已经完成，因此PSmOrange系统成为斑马鱼研究工具箱中的极佳补充。

<table><tbody><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>原始 H2B-PSmOrange 质粒</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>文中描述的质粒可在 Carl 实验室获得</td></tr><tr><td>FemtoJet 微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>镊子（5 Inox）</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II 带 #1.5 德国盖玻片的腔室系统&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>No Number</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &amp;lambda; 20X 干镜物镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>No Number</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 软件（v. 4.30.02）</td><td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td><td>No Number</td><td></td></tr></tbody></table>

利用光转换psmorange系统追踪gfp转基因斑马鱼中的细胞

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

透明的斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育迅速，结合细胞和组织的荧光标记，可直接在活体动物中观察发育过程。通过使用组织特异性启动子驱动荧光蛋白（FP）的表达，可对特定细胞进行标记，从而建立转基因品系。若采用荧光光转化蛋白，则可进一步精确追踪表达区域内的特定结构。通过照射目标区域的蛋白，可改变其发射光谱，使特定细胞或细胞簇呈现不同颜色，而其他转基因细胞仍保持原有颜色。目前的主要局限在于，斑马鱼中大量组织尚缺乏已知的特异性启动子。相比之下，基因捕获和增强子捕获筛选已产生了大量转基因资源，能够离散地标记几乎所有胚胎结构，其中大多数使用GFP，较少使用红色或黄色荧光蛋白。在上述转基因背景下追踪特定结构的一种策略是引入一种广泛表达的光转化蛋白，并在目标细胞中进行光转化。然而，现有的光转化蛋白通常具有绿色发射态，或较少情况下具有红色发射态1，因此常常无法用于在已有转基因品系的荧光蛋白背景下追踪细胞。为解决这一问题，我们建立了适用于斑马鱼的PSmOrange系统2,3。通过简单地显微注射编码该蛋白核定位形式的合成mRNA，可使所有细胞核呈现橙红色荧光。对目标区域的蛋白进行定向光转化后，其发射光谱可转变为远红光。由于该蛋白具有高量子效率和良好的稳定性，PSmOrange成为斑马鱼乃至其他真骨鱼类细胞示踪的优异工具。

图1展示了一个PSmOrange光转化系统的示例。脑上腺复合体是脊椎动物间脑背侧保守的结构。与许多其他脊椎动物类似，该复合体由位于间脑中央的脑上腺器官和位于左侧的副脑上腺细胞组成。此前优雅但耗时的光解笼锁实验表明，副脑上腺细胞起源于脑上腺器官的前部13。在tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP)转基因胚胎中，脑上腺和副脑上腺细胞在发育过程中均被标记。为了评估PSmOrange系统是否适用，我们利用这些胚胎重现了已报道的脑上腺复合体发育过程。将编码PSmOrange核定位形式（H2B-PSmOrange）的260 pg mRNA注射到单细胞阶段的双转基因胚胎中，使该蛋白在所有细胞核中表达。注射后的胚胎在28 °C下孵育至受精后24小时（hpf），筛选出具有GFP和强H2B-PSmOrange表达的胚胎，并将其包埋于带腔室的盖玻片系统中的LMA内，使背侧朝下。将样本置于倒置共聚焦激光扫描显微镜下，显微镜由成像软件控制，配备488 nm、561 nm和640 nm激光器以及20X空气物镜，用于光转化和细胞追踪。...

我们建立了光转换PSmOrange系统，作为一种强大、直接且成本低廉的工具，用于 体内 在GFP转基因背景下进行细胞示踪。本方案描述了其在斑马鱼模型系统中的应用。

利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

斑马鱼（Danio rerio）胚胎透明且发育迅速，结合细胞和组织的荧光标记，可实现……的可视化

PSmOrange光转换技术的总体目标是在胚胎发育和疾病过程中追踪活体动物中的细胞。该方法可以回答发育生物学中的关键问题，例如揭示发育形成组织和器官的细胞来源。该技术的主要优势在于其可应用于GFP转基因背景中。该方法还可应用于再生、肿瘤进展与侵袭等不同研究领域。根据文本方案制备并包埋表达PSmOrange和GFP的胚胎后，将胚胎置于共聚焦显微镜下，使用20倍空气物镜以及488和561纳米激光扫描样品，以确定待光转化的区域。在光转化前检测PSmOrange蛋白时，使用561纳米激光，其在物镜上方焦平面处的功率为0.74毫瓦，并根据需要调整激光功率。调整缩放倍数以突出显示目标区域，并减少图像采集时间和光毒性。使用488纳米和561纳米激光的顺序扫描模式，以及1.0至2.0微米的Z步进，采集覆盖目标结构的Z轴层扫图像。调节线平均和扫描频率以优化图像质量。然后扫描样品，并选择感兴趣区域（ROI）工具，以高亮标记待光转化的区域，随后将该区域固定为刺激区域。选择光激活漂白模块，勾选以激活488纳米激光，将488纳米激光强度设置为80%，扫描速度设置为每帧0.5秒。接下来，打开光转化工具，点击“添加”以设定光转化程序。在采集刺激菜单中，将第一阶段设置为采集，并在循环菜单中注明光转化前需采集的图像数量。将第二阶段设置为刺激，并输入将要执行的刺激次数。按照第一阶段的描述调整第三阶段。可选择在第二阶段后插入一个等待阶段，输入在最后一轮图像采集前的等待时间。参数设置完成后，应用刺激设置并运行光转化。显微镜设置对于 PSmOrange 光转化至关重要。为了确保光转化成功，实验结束后应立即对胚胎进行成像，以检测光转化后的 PSmOrange 蛋白。如果转化未成功，则需重复该操作。使用 488、561 和 640 纳米激光器，并将 640 纳米激光器设置为高功率（最高 4.5 毫瓦），按照上述设置采集最终的 z 层扫描图像。为取下胚胎，先将培养室从显微镜上移除，然后用镊子将胚胎从琼脂糖中取出。将胚胎转移至新的无菌塑料培养皿或无菌的6孔板中，其中含有含0.2毫摩尔PTU的E3培养基。在28摄氏度下孵育胚胎，直至达到所需的发育阶段。如需分析光转换PSmOrange蛋白表达细胞的命运，请根据正文中的实验方案重新包埋胚胎。在共聚焦显微镜下扫描样品，识别目标GFP转基因结构中发生光转换的细胞。使用488、561和640纳米激光，以顺序模式采集z轴层扫图像，层扫间距固定为1至2微米，覆盖相关结构。利用Image J Fiji软件，鉴定同时表达GFP和光转换蛋白的细胞。复制原始图像栈，使用高斯模糊插件和图像计算器将平滑后的图像栈从原始图像中减去。对绿色和远红通道应用特定的阈值，以突出显示光转化细胞。然后使用“分析颗粒”工具，通过合适的设置检测绿色通道中阈值区域。对远红通道重复此步骤。打开图像计算器插件以检测共定位的细胞。使用“分析颗粒”工具将绿色或远红通道中重叠的 ROI 以黄色显示。使用 NIS-Elements 软件进行三维数据评估，并通过“显示体积视图”（Show Volume View）选项以三维形式展示图像堆栈。随后使用图形界面选择绿色、红色和远红通道，调节亮度与对比度，并对三维堆栈进行裁剪，以突出显示光转化区域。此处展示的是在斑马鱼转基因 FOXD3 floating head GFP 胚胎中 PSmOrange 光转化系统的示例。受精后26小时，对松果体前部的两个细胞簇进行光转化并立即成像。该蛋白可使用640纳米远红激光检测到，但无法用561纳米激光检测到。在这些细胞中，由于光漂白作用，GFP的表达最初有所降低。在52小时后受精（HPF）时，在表达光转化H2B PSmOrange蛋白的细胞中检测到GFP和H2B PSmOrange信号。其中少数细胞在脑部左侧形成了副松果体。该结果与先前关于副松果体细胞起源于前松果体的报道一致，表明PSmOrange技术可适用于活体GFP转基因脊椎动物胚胎中的研究。通过该实验步骤，可在经过遗传操作的胚胎中进行细胞示踪分析，以进一步探究细胞发育过程中相关的分子调控层级。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在GFP-转基因斑马鱼使用Photoconvertible PSmOrange系统追踪单元

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。...

活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

本方案描述了在共聚焦激光扫描显微镜上进行荧光蛋白光转化的一般方法。我们介绍了纯化蛋白样品的光转化步骤，以及在活细胞中利用mOrange2和Dronpa进行双探针光学标记的实验流程。...

纯化荧光蛋白的光转化及活细胞中双探针光学标记

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中对光转化荧光蛋白（PCFPs）进行光激活转换，并在发育过程中的特定时间点追踪已光转化蛋白的方法。该方法可用于监测活体脊椎动物个体发育过程中不同发育事件所涉及的细胞生物学过程。...

利用光转化蛋白在斑马鱼发育过程中进行细胞示踪

本视频展示了利用表达光可转换绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼鱼追踪白细胞募集的过程。通过将红色荧光染料标记的细菌预先注射到内耳囊中并诱导光转换，可观察白细胞在体内的迁移、吞噬及扩散过程，从而深入了解免疫反应动态。...

基于光转化的细菌感染转基因斑马鱼中白细胞追踪

体节发生是一种节律性的发育过程，可在脊椎动物胚胎中对体轴进行空间模式化。此前，我们构建了转基因斑马鱼品系，利用荧光报告基因来观察驱动该过程的周期性基因。在此，我们将这些品系的分散细胞进行体外培养，并随时间成像其振荡行为in...

单细胞成像斑马鱼体节时钟的分散型前体节中胚层细胞培养物的制备

本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。...

活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

本方案描述了一种在活体斑马鱼胚胎的心内膜细胞中对Kaede荧光蛋白进行光转化的方法，该方法可用于追踪心内膜细胞在房室管及房室心脏瓣膜发育过程中的动态变化。...

通过细胞光转化追踪斑马鱼胚胎中的心内膜组织运动

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。...

斑马鱼原代细胞的培养与转染

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。...

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

学习使用PSmOrange光转换技术在GFP转基因斑马鱼中进行活体细胞追踪，揭示胚胎发育和疾病过程中细胞的起源与行为。该方法适用于发育生物学、再生医学和肿瘤研究等领域。

利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

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