Name: 双工数字PCR方法的同时定量肠球菌。和人的粪便相关HF183标记的水域 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学习双工数字PCR技术同时定量检测肠球菌属和HF183标记，用于评估水体中一般性及人类粪便污染水平。该方法无需标准曲线，可减少偏差并提高水质监测准确性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者没有致谢。

1. 检测体系配制
<ol>
	<li>使用分子级水配制所有引物的100 µmol/L储存液，使用TE pH 8缓冲液配制探针的100 µmol/L储存液 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12；HF183-1, BthetR1, BthetP13]。 
	注意：两种靶标的探针使用不同的荧光染料进行荧光标记7，具体见材料/设备清单。</li>
	<li>按每反应体系配制主混合液：12 µl数字PCR预混液（2×储存液，参见材料/设备清单）、正向和反向引物各0.216 µl、荧光探针各0.06 µl，以及5.016 µl无核酸酶水（终浓度：每种引物900 nM，每种探针250 nM）。轻轻吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。</li>
	<li>将18 µl主混合液（来自步骤1.2）移入普通PCR管或PCR板中，并加入6 µl DNA模板（按先前所述方法提取13），形成用于液滴生成的反应体系。若样品需设重复，每孔加入36 µl主混合液和12 µl DNA模板。在PCR板上相应位置保留对应的重复孔为空。应包括阳性对照（见材料/设备清单）和无模板对照（NTC）（即以分子级水作为模板）。 
	注意：阳性对照用于确保实验正常运行，NTC用于确认板内无污染，并在后续数据分析中设定荧光基线。首次使用者建议同时使用未稀释和稀释的DNA样品。</li>
</ol>
2. 微滴生成与PCR板设置
<ol>
	<li>使用多通道移液器将反应混合物上下吹打约15次以充分混匀。确保移液器吸头始终浸没在液体中，避免在混合物中产生过多气泡。</li>
	<li>将1号芯片（含8个孔）插入白色芯片架中，并扣紧芯片架。此时1号芯片已牢固固定，无法在生成液滴过程中从架中脱落。使用多通道移液器，轻柔地将20 µl反应混合物转移至芯片上标记为“Sample”的中间位置，避免引入气泡。</li>
	<li>将70 µl液滴生成油通过移液器加入芯片左侧标记为“Oil”的区域。</li>
	<li>将垫圈盖在芯片上，确保垫圈平整，并被芯片边缘的4个卡扣均匀固定。按下液滴生成仪上的绿色指示灯按钮以打开仪器，放入芯片，然后再次按下绿色指示灯按钮关闭仪器。 
	注意：门关闭后，按钮指示灯变暗，此时门无法重新打开，液滴生成立即开始，持续约1分钟。</li>
	<li>若需进行超过8个反应，可在液滴生成过程中，将2号芯片放入第二个白色芯片架中，并以与1号芯片相同的方式进行准备，以节省总设置时间。</li>
	<li>当指示灯由暗变绿，表示液滴生成完成，此时打开液滴生成仪门。取出含有1号芯片的白色芯片架，暂放一旁，并将2号芯片放置到液滴生成仪中。</li>
	<li>取下1号芯片上的垫圈并丢弃。轻柔地将芯片第三列（标记为“Droplets”）中生成的全部液滴（约40 µl）转移至最终的PCR板（保持室温）中，用于后续热循环。 
	注意：请勿松开白色芯片架的卡扣，以免破坏新生成的液滴；仅在液滴完全转移至最终PCR板后，方可打开芯片架。</li>
	<li>对其他样品重复步骤2.1–2.7。</li>
	<li>当所有液滴均转移至最终PCR板后，在板上覆盖可穿刺的铝箔膜，并将板放入板封仪。将封膜仪温度设为180 °C，按下“Play”键，封膜10秒。</li>
</ol>
3. 热循环与液滴读取
<ol>
	<li>将密封的PCR板放置于热循环仪上，所用热循环仪需兼容步骤2.7中最终使用的PCR板，并具备2.0 °C/sec的温度升降温速率。</li>
	<li>运行以下热循环程序：95 °C下10分钟，随后进行40个循环（每个循环包括94 °C下30秒和60 °C下60秒），最后在98 °C下保持10分钟（可选：最终在4或15 °C下保持）。</li>
	<li>循环程序完成后，将PCR板转移至液滴读取仪，以自动检测每个孔中每个液滴的荧光信号。或者，在读取液滴前可将PCR板在4 °C下保存最多3天。开始读取前，确保液滴已恢复至室温。
	<ol>
		<li>打开配套软件以设置液滴读取。在默认的“设置”菜单中，其包含一个空的96孔板示意图，双击A1孔以打开包含三个部分的菜单：“样本”（Sample）、“检测1”（Assay 1）和“检测2”（Assay 2）。</li>
		<li>在“样本”部分，将样本编号输入标有“名称”（Name）的输入框中，然后按回车键或勾选右侧标有“应用”（Apply）的复选框。接着，点击标有“实验”（Experiment）的下拉菜单，选择“RED”（稀有事件检测），然后点击回车键。</li>
		<li>进入标为“检测1”（Assay 1）的部分。在“名称”（Name）栏中填写检测名称（例如 Enterococcus），然后点击回车键。在下方标有“类型”（Type）的输入框中，点击下拉菜单并选择“通道1未知”（Channel 1 Unknown），然后点击回车键。</li>
		<li>进入标为“检测2”（Assay 2）的部分。在“名称”（Name）栏中填写检测名称（例如 HF183），然后点击回车键。在下方标有“类型”（Type）的输入框中，点击下拉菜单并选择“通道2未知”（Channel 2 Unknown），然后点击回车键。此时，步骤3.3.2至3.3.4中的所有信息均已填入A1孔。</li>
		<li>为所有后续含有液滴的孔命名。为节省总设置时间，可按住“Shift”或“Ctrl”键，以同时选择多个孔。</li>
		<li>当软件中显示的板图与实际PCR板一致时，点击菜单右下角的“确定”（OK）。在新出现的位于板图上方的菜单中，在“模板”（Template）部分选择“另存为”（Save As），为该板命名并保存。</li>
		<li>在屏幕左侧点击“运行”（Run），并在弹出的“运行选项”（Run Options）窗口中选择合适的染料组（Dye Set）。数据采集将随即启动，并在软件中实时显示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析与报告
<ol>
	<li>当读取仪完成读取并弹出显示“运行完成”的对话框时，点击“确定”。 
	注意：软件在软件界面的“分析”部分显示最终数据文件。在此视图中，软件默认选中了板上的所有孔，并以“二维振幅”数据图作为默认显示。</li>
	<li>检查阳性与阴性液滴之间的分离情况。确保阴性对照孔中所有液滴的荧光信号接近基线水平。</li>
	<li>单击标有“Events”的按钮。在右侧显示的直方图下方，勾选名为“Total”和名为“single”的复选框，以显示每孔中被接受的液滴总数。排除任何含有 &#60;10,000 个液滴7 通过按住 Ctrl 键并点击需要排除的孔。</li>
	<li>单击标记为“1D Amplitude”的按钮，为两个目标在NTC孔中阴性液滴之上约一个标准差（500–700荧光单位）处设定荧光阈值。在屏幕左侧“Auto Analyze”下方显示的两个阈值按钮中，选择右侧带有实心粉红色水平线穿过的图标。</li>
	<li>单击每个振幅图下方“设置阈值”左侧的框，并输入适当的荧光阈值。目标浓度单位为拷贝数每 &#181;反应的浓度将被自动计算。 
	注：不同目标物的阈值无需完全相同。</li>
	<li>在1D振幅界面左上角点击“导出”按钮，将结果导出为.csv文件。在.csv文件中，将导出的目标浓度乘以4，以将其从目标拷贝数（Enterococcus属23S基因的拷贝数）转换为每微升数字PCR反应体系中的目标拷贝数。 肠球菌属 或每份HF183标记 &#181;每微升反应体系中目标拷贝数 &#181;l DNA模板。</li>
</ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案中有几个关键步骤。首先，由于该反应体系的预混液比常规qPCR预混液更黏稠，混合操作可能较为困难。仅通过简单的涡旋振荡可能导致混合不充分，进而造成DNA模板在反应体系中分布不均，最终影响液滴中的模板分布，导致定量结果不准确。因此，必须严格按照方案中描述的移液吹打混匀技术操作，以确保数字PCR（dPCR）定量的准确性。其次，必须确保生成的液滴具有均匀的形态和大小。需注意观察液滴生成仪完成单个芯片液滴生成所需时间是否短于正常情况，这可能提示液滴生成效果不佳。如有需要，可记录每个芯片的液滴生成时间，以便后续排查问题。第三，必须将生成的全部40 µl液滴从芯片完整转移至最终的PCR板中，转移过程中应避免液滴剪切破坏，并防止因液滴量不足而影响定量分析。可采用以下技术进行转移操作：1）将多通道移液器设定至40 µl，将吸头以45°角插入芯片右侧标有“Droplets”（液滴）的区域；2）缓慢吸取液滴，并确保所有液滴均被完全吸出（注意观察是否有残留液滴，必要时需进行第二轮吸液）；3）液滴完全吸出后，将移液器吸头轻触PCR板孔壁约一半深度处，缓慢排出液滴。
EntHF183 双重数字PCR（d...

定量PCR（qPCR）方法因其相比传统培养法具有更快的速度、更高的灵活性和特异性，已被广泛应用于娱乐用水水质监测和微生物来源追踪。因此，在美国环保局（USEPA）修订的娱乐用水水质标准中，推荐使用qPCR对肠球菌属（Enterococcus spp.）等通用粪便指示菌实现快速水质监测结果1。此外，已有多种qPCR检测方法被开发并验证，用于识别环境水体中粪便污染的来源2。其中，HF183标记物检测是用于识别与人类相关的粪便污染最常用的检测方法之一3。
然而，qPCR 结果常常存在偏差，因为其定量依赖于标准曲线。qPCR 通过将样本中目标物的定量循环数（Cq）与标准曲线进行插值来量化未知浓度，该标准曲线描述了 Cq 与一系列连续稀释标准品的对数数量之间的线性关系。因此，缺乏可靠且一致的标准参考物质会显著影响 qPCR 结果的准确性。研究显示，使用不同供应商提供的标准品时，qPCR 结果差异约为半个数量级4，而使用同一供应商不同批次的标准品时，结果差异可达 2 倍5。
数字PCR（dPCR）技术通过将一个常规qPCR反应分割成数千至数百万个均一的纳升或皮升级微小反应，生成大量微型PCR，再统计其中阳性反应出现的频率，从而对未知样本进行定量。6被称为液滴数字PCR（即，本文）或芯片式数字PCR，前提是分区为油包水液滴即，本文）或芯片上的微小腔室。样本浓度越高，目标DNA（从而产生阳性PCR结果）出现在更多比例的分区中，这一关系可用泊松分布近似描述。因此，记录二元结果（阳性或阴性PCR），并通过泊松近似利用阳性液滴的频率直接计算未知样本浓度，无需像qPCR那样依赖标准曲线。
数字PCR定量的这种二元特性相较于qPCR具有额外优势7。由于延迟扩增仍可产生阳性PCR结果，因此数字PCR定量对降低扩增效率的抑制作用具有更强的耐受性。类似地，与qPCR不同，数字PCR定量不受Cq值变异的影响，因而相比qPCR具有更高的精密度8-10。
此外，分液过程可确保每个液滴中含有极少量的目标 DNA，从而有效减少底物竞争（即不同 DNA 目标物在扩增过程中相互竞争），这是实现 qPCR 双重检测（即 一个检测同时测量两个 DNA 目标物）的常见障碍。因此，无论以双重还是单重（即 一个检测仅测量一个目标物）模式运行，dPCR 对两个目标物的定量结果几乎无法区分7,11。
本文所述数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR）的目标是同时直接定量通用粪便指示菌Enterococcus spp.以及与人粪便相关的HF183标记物，相较于qPCR方法，其具有更高的精确度、重复性以及更强的抗抑制能力。该检测方法已成功用于环境淡水、海水及多种粪便样品中粪便污染的定量分析7，也可应用于其他各类水体和废水样品。由于该方法对抑制物具有高度耐受性，在沉积物或土壤分析中具有广阔应用前景，但因这类样品中抑制物成分复杂，尚需进一步测试验证。

<table><tbody><tr><td>低吸附微量管</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>用于试剂、样品的储存或主混合液的配制</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8 缓冲液</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>硬壳96孔板</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>用于初始主混合液配制及样品接种</td></tr><tr><td>铝密封膜</td><td>BioRad</td><td>359-0133</td><td>用于密封样品板</td></tr><tr><td>液滴生成仪</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>液滴生成油</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>微流控卡盒</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8卡盒支架</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>密封垫圈</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;l 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>用于将样品/主混合液转移至卡盒</td></tr><tr><td>200 &amp;#956;l 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>用于将液滴转移至最终的Twin.Tec板</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96孔板</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>用于最终液滴的热循环及检测</td></tr><tr><td>可穿刺热封膜</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>用于热循环前密封Twin.Tec板</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜仪</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96热循环仪</td><td>BioRad</td><td>CFX96 and C1000</td><td>仅需热循环功能，无需光学检测模块</td></tr><tr><td>QX100液滴读取仪</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>液滴读取油</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Droplet PCR Supermix&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;文中所述的数字PCR混合液</td></tr><tr><td>QuantaSoft软件（v1.3.2）</td><td>Quantasoft&amp;nbsp;</td><td>QX100&amp;nbsp;</td><td>用于查看、分析和导出ddPCR数据</td></tr><tr><td>肠道菌正向引物（Ent F1A）</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>肠道菌反向引物（Ent R1）</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>肠道菌探针（GPL813TQ）</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>可使用其他供应商，但荧光基团必须为FAM</td></tr><tr><td>HF183正向引物（HF183-1）</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>HF183反向引物（BthetR1）</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>HF183探针（BthetP1）</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC&lt;br/&gt; ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>可使用其他供应商，但荧光基团必须为HEX（若使用VIC，则需选择适当的矩阵补偿）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>阳性对照</td><td></td><td></td><td>由&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;基因组DNA与HF183标准质粒（从IDT订购）混合而成。有关&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;的培养方法及所订购HF183质粒的序列信息，请参见Cao &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2015（doi:10.1016/j.watres.2014.12.008）。商业化的&lt;em&gt;Enterococcus&lt;/em&gt; DNA标准品（ATCC 29212Q-FZ）也可用于阳性对照，替代实验室自备的&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;基因组DNA。</td></tr></tbody></table>

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物hf183的双重数字pcr检测方法

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

本文描述了一种用于同时定量Enterococcus spp.和人类粪便相关标志物HF183的双重数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR）。该EntHF183双重dPCR检测（以下简称EntHF183 dPCR）所使用的引物和探针序列与其已发表的单重定量PCR（qPCR）方法相同。同样，在进行dPCR之前，也采用与qPCR前一致的水样过滤和DNA提取步骤。然而，该双重dPCR检测相较于qPCR检测具有多项优势。最重要的是，dPCR通过直接定量目标分子，无需构建标准曲线，从而消除了由此带来的系统偏差和变异性。此外，尽管在qPCR中进行双重检测（即同时定量）Enterococcus和HF183时常会导致样本中丰度较低的目标被严重低估，而dPCR则能够在单独或同一反应中同时定量时，对两个目标均实现一致且可靠的定量结果。dPCR检测还能耐受比qPCR高一到两个数量级的PCR抑制物浓度。这些优势使得EntHF183 dPCR检测尤为具有吸引力，因为它无需分别运行两个独立的qPCR检测，即可同时提供关于环境水体中总体及人类来源粪便污染的准确且可重复的信息。尽管dPCR相较于qPCR具有诸多优势，但在当前可用仪器条件下，其定量上限比qPCR低约四个数量级。因此，在检测目标生物浓度较高（例如污水泄漏后通常观察到的情况）时，需对样本进行稀释后再行测定。

一次成功的EntHF183双重dPCR运行应获得相对较高数量的已接受液滴（约 10,000–17,000）以及相对较大的差异（约 阴性液滴与阳性液滴荧光值之间的差值（约5,000）7. 异常低的液滴数量可能表明液滴生成过程中存在问题，根据本文所用液滴dPCR系统的实证数据，建议以10,000个液滴作为阈值。较弱的分离（即 阳性与阴性液滴之间较小的荧光差异可能表明存在抑制或探针降解7.
总体而言，当对qPCR进行校正以消除标准品相关偏差且无抑制物存在时，EntHF183双重数字PCR（dPCR）检测结果与qPCR结果高度一致7。EntHF183双重dPCR检测与其相应的单重dPCR检测结果高度一致，两种检测格式之间的结果通常无法区分7（图1）。此外，dPCR检测所能耐受的抑制物浓度...

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法，可用于同时定量Enterococcus spp.和HF183遗传标记，以指示娱乐用水中普遍性及与人类相关的粪便污染。

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR），用于同时定量肠球菌属（Enterococcus spp.）和人粪便相关...

本双重数字PCR检测方法的总体目标是同时定量水体中的一般性粪便污染和与人类相关的粪便污染。该检测方法有助于回答娱乐用水水质监测中的关键问题，例如水体中一般粪便指示菌（即肠球菌）以及更为重要的人类粪便相关HF183标记物的含量水平。该检测方法的主要优势在于可在同一反应中定量两个靶标，并且与qPCR相比，无需进行标准曲线的制备，从而消除了相关的偏差和变异性。本实验操作将由我们的高级研究技术员Meredith Raith进行演示。开始此操作前，首先根据方案文本中的描述，用分子级水配制所有引物的100 微摩尔/升储备液，并用TEPH 8缓冲液配制探针的100 微摩尔/升储备液。接下来，通过混合适量的数字PCR预混液、正向和反向引物、荧光探针以及无核酸酶水来配制主混合液。轻轻吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。由于数字PCR主混合液比常规qPCR主混合液更粘稠，因此必须采用移液吹打混匀的方法，以确保形成均一的溶液。这有助于后续进行准确的数字PCR定量。为制备用于液滴生成的检测混合液以对样品进行双重复运行，将36 µL主混合液移入常规PCR板中。向每份36 µL主混合液中加入12 µL DNA模板，同时在板上相应的位置留出对应的重复孔为空。设置阳性对照以确保检测正常进行。设置无模板对照（NTC）以确保板内无污染，并为后续数据分析设定荧光基线。在使用液滴生成仪前，使用多通道移液器将检测混合物上下吹吸约15次，充分混匀。确保移液枪吸头始终浸没在液体中，以避免在混合物中产生气泡。接下来，将含有八个孔的1号卡盒插入白色卡盒支架中，并扣紧支架。此时1号卡盒已牢固固定，生成液滴过程中不会从支架中脱落。使用多通道移液器，轻柔地将 20 微升检测混合液转移至芯片上标记为“sample”的中间位置，注意避免引入气泡。将 70 微升液滴生成油移取至芯片上标记为“oil”的左侧位置。盖上垫圈，确保垫圈平整，并被芯片边缘的四个凸起均匀固定。按下液滴生成仪上亮起绿色的按钮以打开门并放置 cartridge。再次按下该按钮以关闭生成仪。门关闭后，绿色按钮将变暗，此时无法重新打开门。液滴生成将立即开始，并持续约一分钟。在液滴生成进行期间，将第二个 cartridge 置于第二个白色 cartridge 持架中，并以与第一个 cartridge 相同的方式进行准备。当液滴生成完成后，原本昏暗的按钮将变为绿色。打开液滴生成仪舱门，取出装有1号芯片的白色芯片架并将其放置一旁。将2号芯片放入液滴生成仪中。取下1号芯片上的垫圈并丢弃。不要松开白色的 cartridge holder，因为该操作可能会破坏新生成的液滴。使用设置为 40 µL 的多通道移液器，将吸头以 45 度角插入标记为液滴的 cartridge 第三列中，缓慢吸取所有液滴。将液滴转移至最终的 PCR 板时，将移液器吸头抵住孔壁约一半深度的位置，然后缓慢排出液滴。同样地，当第二个 cartridge 的液滴生成完成后，取下第二个 cartridge 的垫圈，并将生成的液滴转移至最终的 PCR 板中。在板上覆盖一层可穿刺的铝箔盖，然后将其放置在板封仪上。将封板仪温度设置为 180 摄氏度，按下封板仪的运行按钮，封板 10 秒钟。开始此实验步骤时，将密封的最终PCR板放入热循环仪中。使用与最终PCR板兼容且升降温速率为每秒2摄氏度的热循环仪。运行以下热循环程序：95摄氏度预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括94摄氏度变性30秒和60摄氏度退火延伸60秒，最后在98摄氏度保持10分钟。完成扩增循环后，将反应板转移至液滴读取仪，以自动测量每个孔中各液滴的荧光信号。在进行液滴读取前，确保液滴处于室温状态。首先打开配套软件，设置液滴读取程序。在包含空白 96 孔板示意图的默认设置菜单中，双击 A1 孔，打开包含三个部分（样品、检测 1 和检测 2）的菜单。在“样品”部分中，将样品编号输入标有“名称”的文本框中，并勾选右侧标记为“应用”的复选框。接着，点击标有“实验”的下拉菜单，选择用于稀有事件检测的 RED，然后点击“回车”。转至标记为“Assay 1”的部分。在“Name”区域中填写检测名称，然后点击 Enter。在下方标有“Type”的框内，单击下拉菜单，选择“Channel 1 Unknown”，然后点击 Enter。转至标记为“实验2”的部分。在“名称”部分中填写实验名称，然后点击“Enter”。在下方标记为“类型”的框中，点击下拉菜单，选择“通道2未知样本”，然后点击“Enter”。现在，A1 孔中已包含之前所有步骤的信息。为后续含有液滴的各孔命名。为节省总体设置时间，可按住 Shift 或 Control 键以同时选择多个孔。当平板的数字示意图与实际平板一致时，点击菜单右下角的“确定”按钮。在平板示意图顶部出现的新菜单中，于“模板”下方选择“另存为”，并为该平板命名并保存。在屏幕左侧，单击“运行”，并在弹出的“运行选项”窗口中选择合适的染料组。数据采集将随即开始，并在软件中实时显示。当读者完成操作后，会出现一个显示“Run Complete”的对话框，点击“OK”。检查阳性与阴性液滴之间的分离情况。确保所有NTC孔中液滴的荧光信号接近基线水平。点击标有“Events”的按钮。在底部，点击名为 Single 的复选框，然后在右侧显示的直方图中，点击名为 Total 的复选框，以显示每个孔中接受的液滴总数。按住控制键并点击需排除的孔，排除任何液滴数少于 10,000 的孔。点击标记为 1D Amplitude 的按钮，针对两个目标，将荧光阈值设定为 NTC 孔中阴性液滴标准差的约一倍水平。在屏幕最左侧的“自动分析”下方显示两个阈值按钮，选择右侧带有实心粉红色水平线穿过的图标。单击每个“振幅图”下方“设置阈值”左侧的复选框，并输入适当的荧光阈值。随后，系统将自动计算每微升反应体系中的目标拷贝数浓度。单击 1D 振幅界面左上角的“导出”按钮，将结果导出为 CSV 文件。在 CSV 文件中，需将导出的目标浓度乘以 4，以将其从“每微升反应中目标拷贝数”转换为“每微升 DNA 模板中目标拷贝数”。该图比较了数字 PCR 检测试剂盒的双通道与单通道格式。左侧和右侧图分别显示了肠球菌和HF183的定量结果，以及双重检测与单重检测结果之间的相应相关系数。实线表示回归线，灰色阴影区域表示相应的标准误差。不同类型的样品由不同的符号表示。无论是在一个反应中同时检测肠球菌和HF183，还是在两个独立反应中分别检测，结果均高度一致且通常无法区分。数字PCR检测法对抑制物的耐受浓度比qPCR高出一到两个数量级。该图显示了在洁净污水DNA中添加浓度逐渐增加的腐殖酸（一种PCR抑制剂）后，HF183标记物的qPCR与数字PCR定量结果。在无抑制剂存在的情况下，HF183 定量的预期结果定义为两条水平虚线之间的 95% 置信区间。以三角形表示的数字 PCR 在腐殖酸浓度达到每微升反应 15 纳克时仍能提供准确的定量结果，而以叉号表示的 qPCR 在每微升 1 纳克时即开始低估目标量，并在每微升 5 纳克时完全受到抑制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展本项肠道 HF183 双重液滴数字 PCR 检测，或其他使用不同引物和探针的类似检测方法。自2015年在《水研究》（Water Research）上发表该双重检测方法以来，我们已开发并验证了一系列其他数字PCR检测方法，这些方法针对通用粪便指示菌、微生物追踪标记物以及水源性病原体。这些检测方法可对目标物进行直接且无偏倚的定量，在水质检测领域正逐渐成为qPCR检测方法的有用替代方案。

a-duplex-digital-pcr-assay-for-simultaneous-quantification

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

双工数字PCR方法的同时定量<em&gt;肠球菌。</em&gt;和人的粪便相关HF183标记的水域

我们描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球对样本中微生物进行多重检测的方法。将样本中所有生物体的扩增子与一组探针偶联的微球进行杂交，然后使用Luminex或Bio-Plex仪器对每种微球进行检测，以识别微球类型及杂交信号。...

使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

本方案描述了使用切向流中空纤维超滤样品浓缩系统和热解离步骤，作为采用美国环保署方法1623检测水中隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）物种的替代方法。...

一种改良的美国环保署方法1623，采用切向流中空纤维超滤与热解离步骤检测水源性Cryptosporidium和Giardia spp.

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

通过PMA-qPCR检测活体Escherichia coli O157:H7细胞

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs,...

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

环境DNA检测在开始野外数据采集之前，必须经过严格的设计、测试、优化和验证。本文提供了一套实验方案，指导用户完成针对目标物种DNA的特异性探针法qPCR检测与定量分析的每一步设计流程。...

环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。...

扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

学习双工数字PCR技术同时定量检测肠球菌属和HF183标记，用于评估水体中一般性及人类粪便污染水平。该方法无需标准曲线，可减少偏差并提高水质监测准确性。

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

探索更多视频