A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

该双重数字 PCR 检测试剂盒的总体目标是同时定量水中的一般和人类相关粪便污染。该检测可以帮助回答娱乐水质监测中的关键问题，例如，水中有多少一般粪便指标，即肠球菌，更重要的是与人类粪便相关的 HF183 标志物。

该检测试剂盒的主要优点是它可以在一次反应中定量两个靶标，并且与 qPCR 相比，它无需运行标准曲线，因此也无需相关的偏差和可变性。演示该程序的是我们的高级研究技术员 Meredith Raith。要开始此程序，首先在分子级水中为所有引物和 TEPH 8 缓冲液中的探针制备 100 μmol/L 的储备浓度，如方案文本中所述。

接下来，通过混合适量的数字 PCR 混合物、正向和反向引物、荧光探针和无核酸酶水来制备预混液。上下移液至少 10 次以混合，同时注意不要在溶液中引入气泡。由于 dPCR 预混液比传统的 qPCR 预混液更粘稠，因此有必要通过移液技术混合以获得均匀的溶液。

这允许在下游进行准确的 dPCR 定量。要制备用于液滴生成的检测混合物以重复运行样品，请将 36 μL 预混液移液到常规 PCR 板中。对于每个 36 μL 预混液，混入 12 μL DNA 模板，使相应的复制孔在板上为空。

包括阳性对照，以确保检测正常运行。包括无模板对照或 NTC，以确保板内没有污染，并在以后设置荧光基线以进行数据分析。在设置微滴发生器之前，使用多通道移液器将混合物上下移液约 15 次，混合分析混合物。

确保移液器吸头保持在液体内，以避免在混合物中产生接触气泡。接下来，将包含 8 个孔的卡套 1 插入白色卡套卡套中，然后卡入卡套卡套。小柱 1 现在已牢固地固定到位，在产生液滴时无法从支架上脱落。

使用多通道移液器，将 20 μL 检测混合物轻轻转移到小柱标记样品的中间位置，不要引入气泡。将 70 微升液滴生成油移液到墨盒标有油的左侧。用垫圈盖住墨盒，确保垫圈平整，并被朝向墨盒边缘的四个刻度均匀固定。

按下 Droplet Generator 上的绿色亮起按钮，打开门并放置墨盒。再次按下按钮可关闭发生器。门关闭后，绿色按钮会变暗，并且无法重新打开门。

液滴生成将立即开始并持续大约一分钟。在液滴生成过程中，将小柱 2 放入第二个白色小柱支架中，并按照与小柱 1 相同的方式进行制备。当 Droplet Generation （快捷批处理生成） 完成后，昏暗的按钮将变为绿色。

打开微滴发生器门，取下包含微滴发生器 1 的白色墨盒支架，并将其放在一边。将墨盒 2 放入 Droplet Generator（微滴发生器）中。从墨盒 1 中取出垫圈并丢弃。

请勿取消单击白色墨盒支架，因为该作可能会破坏新生成的液滴。使用设置为 40 μL 的多通道移液器，将吸头以 45 度角插入标有液滴的小柱的第三列中，然后缓慢吸取所有液滴。通过将移液器吸头靠在孔壁上大约一半并缓慢排出液滴，将它们转移到最终的 PCR 板中。

同样，当小柱 2 的液滴生成完成后，从小柱 2 中取出垫圈，并将生成的液滴转移到最终的 PCR 板中。在板顶部放置一个可刺穿的铝箔盖，并将其放在板密封机上。将封口机设置为 180 摄氏度，在封口机上按播放键，然后密封 10 秒。

要开始此过程，请将密封的最终 PCR 板放入热循环仪中。使用与最终 PCR 板兼容的热循环仪，升温速度为每秒 2 摄氏度。运行以下热程序：在 95 摄氏度下运行 10 分钟，然后运行 40 个周期，在 94 摄氏度下运行 30 秒，在 60 摄氏度下运行 60 秒，然后在 98 摄氏度下保持 10 分钟。

循环完成后，将板转移到 Droplet Reader 上，以自动测量每个孔中每个液滴中的荧光。在继续进行 Droplet Reading（液滴读取）之前，请确保液滴处于室温下。首先打开随附的软件以设置液滴读数。

在包含空 96 孔板示意图的默认设置菜单中，双击孔 A1 以打开包含三个部分的菜单，即样品、分析 1 和分析 2。在 Sample （样本） 部分中，在标有 Name （名称） 的框中键入 Sample ID（样本 ID），然后选中右侧标有 Apply 的框。接下来，单击标记为 experiment 的下拉菜单，为 Rare Event Detection 选择 RED，然后单击 Enter。

移至表示 Assay 1 的部分。在 Name （名称） 部分中，填写 Assay 并单击 Enter。在下面标有 Type 的框中，单击下拉菜单，选择 Channel 1 Unknown ，然后单击 Enter。

移至表示分析 2 的部分。在 Name （名称） 部分中，填写 Assay 并单击 Enter。在下面标有 类型 的框中，单击下拉菜单，选择 通道 2 未知 ，然后单击 Enter。

前面步骤的所有信息现在都存在于所有含有液滴的后续 A1.Name 孔中。要节省总设置时间，请单击 Shift 或 Control 以同时选择多个孔。当印版的数字描述与物理印版相同时，按菜单右下角的 OK（确定）。

在板原理图顶部显示的新菜单中，在 Template 下选择 Save As and name and save 板。在屏幕左侧，单击 Run 并在弹出的 Run Options 窗口中选择相应的 Dye Set。数据收集将启动并在软件中实时显示。

当阅读器完成并出现一个框，说明运行完成时，单击 OK（确定）。检查阳性和阴性液滴之间的分离情况。确保 NTC 孔中所有液滴中的荧光灯接近基线。单击标有 Events 的按钮。

在底部，单击名为 Single 的框，然后在显示的直方图右侧，单击名为 Total 的框以显示每个孔可接受的液滴总数。通过按住 Ctrl 键并单击要排除的孔，排除任何含有少于 10， 000 个液滴的孔。单击标有 1D 振幅的按钮，将荧光阈值设置为两个靶标的 NTC 孔中负液滴的大约一个标准差。

在屏幕最左侧的 Auto Analyze（自动分析）下显示两个阈值按钮，选择右侧的图标，该图标有一条粉红色的水平实线贯穿其中。单击每个 Amplitude Graphs 下 Set Threshold 左侧的框，然后输入适当的荧光阈值。然后自动计算每微升反应的拷贝数目标浓度。

通过单击 1D Amplitude 屏幕上左上角的 Export 按钮，将结果导出为 CSV 文件。在 CSV 文件中，将导出的靶标浓度乘以 4，以将其从每微升反应的靶标拷贝数转换为每微升 DNA 模板的靶标拷贝数。该图比较了数字 PCR 检测试剂盒的双重和单重形式。

左面板和右面板分别显示肠球菌和 HF183 定量以及双链和单纯结果之间的相应相关系数。实线表示回归线，灰色阴影表示相应的标准误差。不同类型的样本由符号表示。

结果高度一致，并且通常无法区分肠球菌和 HF183 是在一个反应中同时测量还是在两个反应中单独测量。数字 PCR 检测试剂盒还可以耐受浓度比 qPCR 检测试剂盒高 1 到 2 个数量级的抑制剂。该图显示了清洁污水 DNA 中 HF183 标记物的 qPCR 和数字 PCR 定量，该 DNA 随着抑制 PCR 的腐殖酸浓度的增加而加标。

在没有抑制剂的情况下，预期的 HF183 定量定义为两条水平虚线之间的 95% 置信度交叉。以三角形表示的数字 PCR 继续提供准确的定量，最高可达 15 ng/μL 反应的腐殖酸浓度，而以十字表示的 qPCR 在 1 ng/μL 时开始低估，并在每 μL 5 ng时完全抑制。观看此视频后，您应该对如何使用不同引物和探针进行肠内 HF183 双链滴式数字 PCR 检测或其他类似检测有很好的了解。

自 2015 年在《水研究》杂志上发表这种双重检测试剂盒以来，我们已经开发并验证了一系列针对一般粪便指示菌、微生物示踪标志物和水传播病原体的其他数字 PCR 检测试剂盒。这些检测试剂盒可对其靶标进行直接和无偏倚的定量分析，它们正在成为水质检测领域 qPCR 检测试剂盒的有用替代品。