Name: 斑马鱼作为一种模型来评估亚硝酸盐的潜在致畸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解利用斑马鱼胚胎评估亚硝酸盐致畸效应的实验方法。该研究通过不同浓度和暴露时间的处理，揭示了亚硝酸盐对胚胎发育的毒性作用，为发育毒理学研究提供了重要的模型参考。

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VK 获得了印第安纳宾夕法尼亚大学生物学系以及研究生学习与研究学院（研究生专业发展项目）资助金的支持。CQD 和 TWS 获得了印第安纳宾夕法尼亚大学研究生学习与研究学院（教师出版费用/零星研究支出）的支持。我们还感谢 Diep 实验室成员对斑马鱼养殖设施的维护工作。

本方案中描述的操作程序已获得宾夕法尼亚印第安纳大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 收集胚胎
<ol>
	<li>将斑马鱼饲养在28.5 °C、pH 7、电导率介于500–1,500 µS、光照/黑暗周期为14小时光照和10小时黑暗的条件下24。使用野生型品系，如Tü、AB或Tü/AB杂交品系。不同品系对化学处理的反应可能不同25。</li>
	<li>在收集卵子的前一晚，通过向交配罐中加入斑马鱼系统用水来准备交配。将一条雄鱼和一条雌鱼放入罐中，并用隔板将两者分开。每对鱼可产卵50–300枚。为确保获得足够数量的卵子，设置30对鱼进行交配。通常，在最佳交配年龄（6–9个月大）的鱼对中约有50%会产卵，每对最多可产约200枚卵，本实验最多可获得约3,000枚卵。</li>
	<li>次日早晨光照开启后，移除隔板以启动交配。每隔15分钟检查一次交配罐中是否有卵子。</li>
	<li>一旦鱼产卵，使用茶筛收集所有胚胎，并将其转移至一个盛有E3缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）的大容器中。在1.5 hpf时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精的卵子。&#160;未受精的卵呈不透明状，而受精的卵则呈透明状34。</li>
	<li>将50个胚胎转移至一个含有50 ml E3缓冲液的100 × 15 mm玻璃培养皿中，用于每种处理条件。本实验共需33个培养皿，以满足11种处理条件、每个条件设3个重复的需求。</li>
</ol>
2. 胚胎处理
<ol>
	<li>在受精后2小时（hpf）进行处理35。将胚胎/幼鱼在28.5 °C条件下孵育，并在120 hpf时观察幼鱼。每种处理条件至少进行三次重复，以用于统计分析。</li>
	<li>在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml用E3缓冲液稀释的300 mM乙醇。用Parafilm封住培养皿以减少乙醇挥发。
	<ol>
		<li>继续使胚胎暴露于乙醇中22小时。然后用移液管吸除乙醇，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去乙醇。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml新鲜E3缓冲液。</li>
	<li>在2 hpf时，取9个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml溶解于E3缓冲液中的1,000 mg/L亚硝酸钠。使用重氮化法的改良版（USEPA方法354.1）分光光度法预先确认储备亚硝酸盐溶液的浓度28。
	<ol>
		<li>继续将3个培养皿暴露46小时，3个培养皿暴露70小时，另3个培养皿暴露94小时。每天更换为新配制的亚硝酸盐溶液。</li>
		<li>在每种暴露时间结束后，用移液管吸除亚硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去亚硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml 200 mg/L亚硝酸钠。同样方法依次使用400、600、800和1,000 mg/L的亚硝酸钠进行处理。
	<ol>
		<li>继续使胚胎暴露于亚硝酸盐中70小时。每天更换为新配制的亚硝酸盐溶液。</li>
		<li>暴露结束后，用移液管吸除亚硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去亚硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml溶解于E3缓冲液中的1,000 mg/L硝酸钠。使用镉还原法的改良版（USEPA方法353.3）分光光度法预先确认储备硝酸盐溶液的浓度28。
	<ol>
		<li>继续使胚胎暴露于硝酸盐中70小时。每天更换为新配制的硝酸盐溶液。</li>
		<li>暴露结束后，用移液管吸除硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每次暴露期间的每一天，使用体视显微镜计数死亡胚胎/幼鱼的数量。死亡的迹象包括无心跳和血液循环，或在观察1分钟后无运动反应。用移液管移除死亡的胚胎/幼鱼，以减少E3缓冲液的污染。</li>
	<li>当实验在120 hpf结束时，对幼鱼实施安乐死。
	<ol>
		<li>用移液管吸除E3缓冲液，然后加入50 ml 0.2% MS-222（用缓冲液调节至pH 7），静置10分钟。</li>
		<li>用移液管吸除MS-222，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转以洗去MS-222。</li>
		<li>用移液管吸除E3缓冲液，加入20 ml 4%多聚甲醛（PFA）以固定幼鱼。轻轻旋转培养皿数次。用移液管将幼鱼连同足量PFA转移至玻璃小瓶中，确保液体充满小瓶。将小瓶置于冰箱中过夜（O/N）保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用配备数字相机的体视显微镜拍摄固定后的幼鱼图像。放大倍数设为30X，ISO 200，曝光时间为200 msec&#160;。调整幼鱼方向，使头部朝左，背侧朝上。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法展示了斑马鱼在评估亚硝酸盐和硝酸盐致畸潜力方面的应用价值。与其他脊椎动物相比，斑马鱼具有多项优势，包括繁殖力高、体外受精、胚胎透明以及发育迅速。目前已有的无色素突变体（如casper斑马鱼）36还能增强内脏器官的可见度。此外，构建携带报告基因的转基因斑马鱼也较为简便，有助于对活体斑马鱼进行分析。37由于斑马鱼基因组与人类基因组具有保守性，通过研究斑马鱼所获得的信息可转化为人类医学应用成果9该方法可应用于基因表达分析，例如 原位 杂交，以获取有关致畸剂引起的基因失调的额外信息。
乙醇暴露对存活率无显著影响，但确实导致了与既往报道相似的明显缺陷5,23,26。这表明我们的方法在重复已发表结果方面具有可靠性。硝酸盐对存活率无影响，而亚硝酸盐则根据浓度和暴露时间表现出显著影响。较长的暴露时间和较高浓度的亚硝酸盐对存活率产生负面影响，与先前的研究结果一致5。最近有研究显示，过量的亚硝酸盐暴露会导致斑马鱼心脏瓣膜发育异常27，验证了利...

致畸作用是一种干扰胚胎或胎儿正常发育的过程，可导致永久性的结构和功能异常、生长迟缓，严重情况下甚至引发流产1。该过程可由某些天然存在的致畸因子引起，这些因子会通过多种机制干扰胚胎发育2。在人类胎儿发育过程中，已有报道称常见的致畸因子（如辐射、感染性病原体、有毒金属和有机化学品）可通过形态发生错误，导致内眦赘皮（上眼睑的皮肤皱褶）和指（趾）屈曲畸形（手指或脚趾弯曲）等缺陷1。
了解致畸作用的分子机制是开发治疗和预防方法的第一步。已使用多种脊椎动物模型，如非洲爪蟾（Xenopus laevis）和斑马鱼（Danio rerio），来确定致畸物所影响的分子通路。以往的研究已将斑马鱼用作流行病学、毒理学和致畸作用的模型3-7。Scholz 等认为斑马鱼是环境毒性评估的&#34;金标准&#34;。这在一定程度上归因于斑马鱼胚胎的透明性，使研究人员能够直接观察发育缺陷的发生过程8。大约70%的人类基因在斑马鱼中具有直系同源基因，使得斑马鱼成为研究人类发育缺陷的理想脊椎动物模型9。
一些流行病学研究提示，常见于农场食品和水中的硝酸盐和亚硝酸盐可能与出生缺陷或自然流产相关10,11，但其他研究并未支持这种关联12。硝酸盐（NO3-）和亚硝酸盐（NO2-）天然存在于土壤和水中，是植物的氮源之一，也是氮循环的一部分13。使用高硝酸盐肥料的农场生产的食品，如青豆、胡萝卜、南瓜、菠菜和甜菜，其硝酸盐和亚硝酸盐含量显著升高7。食用高硝酸盐饲料的奶牛所产的牛奶，以及生活在高硝酸盐水体（主要来自土壤径流30）中的鱼类，均可导致人类摄入大量硝酸盐和亚硝酸盐14。此外，硝酸盐和亚硝酸盐也常用于食品防腐，这显著增加了人类的摄入量12。
适量的硝酸盐和亚硝酸盐在血管稳态与功能、神经传导以及免疫防御机制等生理过程中发挥着基础性作用13-15。然而，暴露于高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐可能产生不良影响，尤其是在婴儿和儿童中16。摄入的硝酸盐可在口腔中通过微生物群转化为亚硝酸盐，也可在胃肠道中由肠道微生物群进一步转化17。
硝酸盐通过将血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，损害血红蛋白的携氧能力，使婴儿面临患蓝婴综合征的高风险18。在较严重的情况下，这会导致皮肤呈现蓝色，并蔓延至外周组织。组织缺氧会引发其他症状，最严重时可导致昏迷和死亡19,20。在硝酸盐浓度较高时，婴儿和成人均可出现类似症状21。成人因亚硝酸盐中毒导致高铁血红蛋白水平升高，可引起发绀、头痛、呼吸障碍31，若未及时治疗，可能因重要组织缺氧相关并发症而死亡32,33。
摄入较高水平的硝酸盐也可能导致多种健康问题。儿童糖尿病、反复腹泻以及儿童反复呼吸道感染均与高硝酸盐摄入有关11,17,22。长期暴露于高水平硝酸盐与排尿异常和脾脏出血相关。急性高剂量接触硝酸盐可引发一系列医学病症，如腹痛、肌肉无力、粪便和尿液中带血、晕厥甚至死亡11。孕期高水平接触硝酸盐与神经管缺陷和肌肉骨骼缺陷有关11。
最近的一份报告表明，用亚硝酸盐处理斑马鱼胚胎会导致卵黄囊水肿、颅面及体轴畸形以及 swim bladder 无法充气5。在本研究中，我们展示了一种用硝酸盐和亚硝酸盐处理斑马鱼胚胎的方法，以评估其致畸潜力。胚胎被暴露于不同浓度的亚硝酸盐中，并在不同持续时间下进行处理。乙醇被用作阳性对照，因为它是一种已知的致畸物23。我们的方法显示，高浓度和长时间暴露于亚硝酸盐均对胚胎存活有害，并导致多种表型，从轻微（水肿）到严重（明显的发育缺陷）不等。因此，斑马鱼是一种有价值的模型，可用于直接探究硝酸盐和亚硝酸盐对胚胎潜在致畸效应，从而补充流行病学研究。

<table><tbody><tr><td>DREL/2010 仪器</td><td>Hach</td><td>26700-03</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX 玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td>89001-244</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>NitraVer 5 硝酸盐试剂</td><td>Hach</td><td>14034-46</td><td></td></tr><tr><td>NitriVer 3 亚硝酸盐试剂</td><td>Hach</td><td>14065-99</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>3-374-10</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>S6E 体视显微镜</td><td>Leica</td><td>10446294</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S343</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S347</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>L320072</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼作为评估亚硝酸盐致畸潜力的模型

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

环境中过高的硝酸盐水平可能&#160;导致人类先天性缺陷或流产。这可能是由于肠道和唾液中的细菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐所致。然而，在其他哺乳动物研究中，尽管高浓度亚硝酸盐可导致不良生殖结局，但并未引起出生缺陷。因此，亚硝酸盐的致畸潜力尚不明确。若能拥有一个易于评估亚硝酸盐或其他任何感兴趣化学物质致畸效应的脊椎动物模型系统，将具有重要意义。本文中，我们展示了斑马鱼（zebrafish）Danio rerio) 筛选化合物的毒性和胚胎发育缺陷。斑马鱼胚胎体外受精且发育迅速，是致畸研究的良好模型。我们发现，延长亚硝酸盐暴露时间会对胚胎存活产生负面影响；提高亚硝酸盐浓度也会对存活率产生不利影响，而硝酸盐则无此效应。对于能够存活的亚硝酸盐暴露胚胎，可能出现多种缺陷，包括心包腔和卵黄囊异常&#160;水肿、 swim bladder 不充气以及颅面畸形。我们的结果表明，斑马鱼是研究亚硝酸盐致畸潜力的便捷体系。该方法可轻松适用于检测其他化学物质对早期脊椎动物发育的影响。

暴露于300 mM乙醇22小时对存活率无影响（数据未显示），与先前报道一致5,23,26。这是预期结果，因为乙醇是一种已知的致畸剂，被用作阳性对照。观察到的表型包括心包水肿、 swim bladder 未充气（图1）、颅面缺陷以及发育迟缓（数据未显示）。
亚硝酸盐处理对存活率的影响程度从轻度到重度不等，具体取决于暴露时间。例如，暴露于1,000 mg/L浓度下94小时对存活率的影响显著，相较于较短时间的暴露更为严重（图2）。
我们还评估了不同亚硝酸盐浓度对存活率的影响。胚胎暴露于 200、400、600、800 和 1,000 mg/L 的亚硝酸盐中持续 70 小时。在高浓度亚硝酸盐暴露下，存活率降低，而硝酸盐对存活率无影响（图...

接触致畸物可能导致出生缺陷。斑马鱼可用于评估化学物质的致畸潜力。我们通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的亚硝酸盐以及在不同暴露时间条件下，展示了斑马鱼在此研究中的应用价值。结果表明，亚硝酸盐具有毒性，并可导致严重的发育缺陷。

环境中过高的硝酸盐水平可能导致人类先天性缺陷或流产。这可能是由于……

本实验的总体目标是用亚硝酸盐处理斑马鱼胚胎，并确定其致畸效应。该方法有助于回答发育毒理学领域中的一些关键问题，例如评估化学物质对胚胎发育的致畸影响。本实验的主要优势在于使用斑马游戏副本，其胚胎在体外发育，可直接在显微镜下观察。进行此处演示的实验时，将野生型斑马鱼品系（如 Tuebingen 品系）饲养在 28.5 摄氏度环境下，光照与黑暗周期分别为 14 小时和 10 小时。在收集卵子的前一晚，向交配缸中加入养鱼用水和隔离板，将雄鱼和雌鱼分别置于隔离板两侧。为确保获得足够数量的卵子，应设置 30 对鱼进行交配。次日早晨，在开启光照后，移除隔离板以开始交配。每15分钟检查一次交配缸中是否有卵。一旦鱼类产卵，使用茶筛收集胚胎，并将所有胚胎合并至一个较大的容器中，加入E3缓冲液。将受精卵在 28.5 摄氏度条件下孵育。受精后 1.5 小时（HPF），在解剖显微镜下使用塑料移液管去除未受精的卵，未受精卵呈不透明状。每种处理条件下，将 50 个胚胎分别转移至含有 50 毫升 E3 缓冲液的 100 × 15 毫米玻璃培养皿中，每组设三个重复。例如，对于11种处理条件，准备33个培养皿，每个培养皿中放入50个胚胎。在2小时受精后（HPF）的三个培养皿胚胎中，移除E3缓冲液，并加入50毫升用E3缓冲液稀释的300毫摩尔乙醇。用封口膜覆盖培养皿，以尽量减少乙醇挥发。将胚胎在乙醇缓冲液中于28.5摄氏度孵育22小时，然后移除溶液，并用E3缓冲液洗涤以去除乙醇，轻轻旋转培养皿数次。重复洗涤两次。向3个盛有2小时受精后（HPF）胚胎的培养皿中，移除E3缓冲液，并替换为50毫升新鲜E3缓冲液。向9个盛有2小时受精后（HPF）胚胎的培养皿中，移除E3缓冲液，并加入50毫升含有1,000毫克/毫升亚硝酸钠溶解于E3缓冲液中的溶液，在28.5摄氏度下孵育，并每天更换亚硝酸钠溶液。46 小时后，取出九个亚硝酸钠培养板中的三个，移除溶液，并用 E3 缓冲液洗涤培养板三次。24 小时后，从培养箱中取出另外三个不同的亚硝酸钠培养板，移除溶液，并用新鲜的 E3 缓冲液洗涤胚胎三次。再过 24 小时后，对最后三个培养板进行类似的洗涤步骤。接下来，另取三套培养皿，将E3缓冲液替换为200毫克/毫升的亚硝酸钠，然后分别设置三组培养皿，每组50个胚胎，分别加入400、600、800和1,000毫克/毫升的亚硝酸钠。将胚胎在70小时内孵育，并每天更换亚硝酸钠溶液。孵育结束后，从培养皿中移除溶液，并用E3缓冲液清洗培养皿三次。对于另外三个培养皿中的胚胎，将 E3 缓冲液替换为含有 50 毫升、1,000 毫克/毫升硝酸钠的 E3 缓冲液。胚胎暴露 70 小时后，用 E3 缓冲液按照之前所示的方法清洗胚胎。在每次暴露期间的每一天，在体视显微镜下统计死亡胚胎的数量，观察指标包括无心跳和血液循环，或在观察一分钟内无

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

斑马鱼作为一种模型来评估亚硝酸盐的潜在致畸

为了理解乙醇诱导的发育损伤的分子机制，我们建立了一种乙醇暴露的斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理、细胞和遗传改变1。随后，我们试图在此动物模型中寻找潜在的干预措施并快速对其进行测试。...

评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

本文介绍了一种利用自动化追踪软件检测幼年斑马鱼和黑头软口鲦鱼运动活动及光运动反应（PMR）的实验方案。将这些行为分析整合到常规毒理学生物测定中，可作为检测化学物质生物活性的诊断工具。本方案以咖啡因为例进行说明，咖啡因是一种模型神经兴奋剂。...

检测幼鱼行为反应谱的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例

本实验方案的目的是以高通量方式测量荧光标记食物通过斑马鱼幼体肠道的转运时间。...

利用幼年斑马鱼进行肠道通过时间的高通量测量

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。...

利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

本文提供了一种利用斑马鱼幼鱼模型评估环境污染物神经行为毒性的详细实验方案，包括暴露过程及神经行为指标的检测方法。...

研究环境污染物对斑马鱼幼鱼神经行为学的影响

本方案描述了使用顺铂作为肾毒性试剂在成年斑马鱼中诱导急性肾损伤（AKI）的操作步骤。我们详细介绍了评估该技术可重复性的方法，以及两种分别用于分析肾组织中炎症和细胞死亡的技术：流式细胞术和TUNEL检测。...

顺铂诱导的成年斑马鱼急性肾损伤模型

斑马鱼中金属及金属化合物的药物毒物动力学分析速率提高，有利于环境与临床转化研究。通过采用电感耦合等离子体质谱法对消化后的斑马鱼组织进行痕量金属分析，克服了水生暴露吸收量未知的局限性。...

斑马鱼暴露于铂基和钌基化合物后通过电感耦合等离子体质谱法检测剂量摄取及其更广泛的应用

斑马鱼最近被用作模型来验证潜在的辐射修饰因子。本实验方案详细描述了利用斑马鱼胚胎进行基于辐射的筛选实验的步骤，以及一些用于评估不同处理和辐射效应的观察方法。...

斑马鱼幼鱼作为评估潜在放射增敏剂或保护剂的模型

本文介绍了一套全面的行为测试组合，包括新奇水箱、群集和社会偏好测试，可用于通过单个水箱有效评估化学品（如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性效应。该方法与神经毒性和环境研究密切相关。...

使用单一水箱中的一系列行为学测试评估成年斑马鱼（Danio rerio）的神经毒性

我们描述了一种基于斑马鱼胚胎振动惊吓反应的化学化合物毒性评估筛选系统的工作流程和数据分析方法。该系统记录斑马鱼胚胎在受到振动刺激时的运动反应，可对总体毒性/致死性以及神经肌肉毒性进行综合评估。...

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

本方案描述了一种在受精后3至7天的斑马鱼幼鱼中进行药物筛选并随后进行形态学评估的实验流程。...

早期斑马鱼幼鱼中的小分子筛选与毒性检测

了解利用斑马鱼胚胎评估亚硝酸盐致畸效应的实验方法。该研究通过不同浓度和暴露时间的处理，揭示了亚硝酸盐对胚胎发育的毒性作用，为发育毒理学研究提供了重要的模型参考。

斑马鱼作为评估亚硝酸盐致畸潜力的模型

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