基于核仁染色质组织分离鼠标窦卵母细胞与表征

该程序的总体目标是根据小鼠完全维持预期胚胎发育的能力，根据小鼠的染色质组织详细说明表征小鼠胃窦卵母细胞所需的所有步骤。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如如何区分和分离两种不同类型的胃窦卵，SN（被包围的核仁）和 NSN（非被包围的核仁），居住在哺乳动物卵巢的胃窦隔室。要收获卵巢，首先向 3 至 6 周龄的雌性小鼠 IP 注射 2.5 国际单位的怀孕母马血清促性腺激素。

两天后，在收获前大约一小时，用 M2 培养基填充一个无菌培养皿，并将几滴 20 微升的 M2 培养基滴添加到第二个培养皿中，每滴用 1.5 毫升矿物油覆盖。然后将所有培养皿转移到 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中，以使培养基平衡。接下来，使用无菌解剖剪刀在覆盖腹壁的皮肤上切开一个切口，然后在第一只注射激素的小鼠的腹膜上切开。

使用无菌镊子将肠道移到一边，以定位子宫管，子宫管从膀胱开始形成 V 形。找到肾脏下方的卵巢后，抓住一根子宫管，在组织底部开一个小切口释放相应的卵巢。重复该过程以收获另一个卵巢，然后将两个卵巢放入装有预平衡 M 2 培养基的培养皿中。

在分离胃窦卵母细胞之前，抓住玻璃巴斯德吸管的两端并将移液管水平放在本生灯火焰上，制作玻璃口移液器。当玻璃开始熔化时，将移液器从火焰中取出并迅速将仪器拉开。用指甲在靠近移液器窄点的地方用力剪掉多余的玻璃，以缩短尖端，并实现约 100 微米的内部毛细管直径。

拥有正确的移液器直径非常重要。如果太窄，ooyctes 会被卡住、碎裂并死亡。然后将移液器的未修饰端连接到吸液管。

接下来，将卵巢转移到含有 1 毫升预平衡 M2 培养基的培养皿中，并使用无菌胰岛素注射器针头轻轻刺穿卵巢的窦卵泡。当卵母细胞释放时，用口腔移液管轻轻收集它们，注意不要吸出任何卵泡细胞或其他组织碎片。然后通过多个预平衡的 M2 培养基滴快速移液每个卵母细胞，以去除附着在卵母细胞透明带上的所有卵丘细胞。

母细胞剥落后，小心地将卵母细胞沉淀在单滴新鲜平衡 M2 培养基的底部。为了对卵母细胞进行染色，使用口腔移液器将细胞转移到 20 微升滴 Hoechst 33342 中，在 M2 培养基中稀释。然后将卵母细胞转移到一个新的培养皿中，该培养皿中含有 5 微升 M2 培养基，上面覆盖有矿物油，注意将卵母细胞单独沉淀在每滴的底部。

转移完所有卵母细胞后，将培养皿置于荧光显微镜下，激发细胞足够长的时间，以观察核仁周围是否存在环。注意不要过度暴露卵母细胞，因为染色质会受损，如果暴露时间过长，卵母细胞可能会死亡。鉴定出 SN 和 NSN 卵母细胞后，根据细胞的染色质组织，将细胞分选到相关试剂中相应的培养皿中，以进行所需的下游分析。

用于染色质组织的 Hoechst 33342 染色可能是该程序中最关键的步骤。5 到 10 秒的激发时间应足够长，以便根据每个卵母细胞核仁周围是否存在染色质对卵母细胞进行分类。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。

尝试此程序时，重要的是在室温下工作，并记住温和地处理卵巢和卵母细胞。按照此程序，卵母细胞可用于体外成熟和体外受精。发展之后，这项技术为发育生物学领域的研究人员铺平了道路，以回答一个仍然悬而未决的问题，即如何识别和区分驻留在哺乳动物卵巢中的两种胃窦卵母细胞。

观看此视频后，您将对如何制作和使用自己的口腔移液器，如何通过 Hoechst 33342 染色分离和分选胃窦卵母细胞有一个很好的了解。不要忘记，与动物和细胞一起工作需要采取特殊的预防措施，例如佩戴个人防护装备和使用消毒器械。