Name: 针对性斯尔纳的噬菌体介导的交付构造击倒基因表达电子。大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解利用M13噬菌体载体递送靶向sRNA表达盒在E. coli中进行基因敲低的方法。该技术无需预先遗传修饰即可在批量培养中实现基因沉默，数小时内即可获得结果。

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本工作由Fondation Bettencourt Schueller资助，以支持巴黎Bettencourt iGEM团队。我们感谢INSERM U1001研究组和Chantal Lotton提供的技术协助与建议。噬粒质粒Litmus28i_J23115-B0032-GFP由斯坦福大学的Monica Ortiz和Drew Endy提供。

1. 携带sRNA沉默盒的噬菌粒载体的设计与构建
<ol>
	<li>从头设计sRNA沉默盒8
	<ol>
		<li>利用DNA序列数据库确定待沉默mRNA的完整序列。为生成靶序列（TARGET），记录从起始密码子（例如 ATG）开始的第+1至+24位的前24个碱基对编码序列。 
		注意：当靶向mRNA的其他位点或区段时，沉默效率较低8。</li>
		<li>取靶序列（TARGET）的反向互补序列，以生成sRNA盒的引导序列（GUIDE）。参见表1中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的靶序列与引导序列示例。</li>
		<li>为设计全长292 bp的sRNA表达盒，依次排列pR启动子、引导序列（GUIDE）、Hfq蛋白结合域以及T1/TE转录终止序列（表2）。</li>
		<li>添加额外的克隆位点以便于将sRNA盒克隆至目标载体中。</li>
		<li>通过商业基因合成或其他类似方法获得完整的sRNA表达盒，并将其克隆至含有功能性f1复制起点的任意噬粒载体中11。最终噬粒载体的完整序列详见支持信息部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用基于PCR的定点突变技术改变现有sRNA表达盒所靶向的序列12
	<ol>
		<li>确定现有sRNA表达盒中的24 bp引导序列（GUIDE）。注意：本研究所用的注释质粒pAB.001可作为补充序列文件获取。</li>
		<li>设计正向和反向引物，使其两端具有与现有sRNA盒中围绕新24 bp引导序列（GUIDE）区域的短同源区。通过商业寡核苷酸合成获得引物。 
		注意：定点突变引物设计如图2所示。具体引物模板序列见表3。</li>
		<li>培养5 ml携带模板sRNA表达噬粒的E. coli菌液。在含适当抗生素的LB培养基中，于37 °C振荡过夜培养。</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒或类似方法，从5 ml细菌培养物中提取并纯化模板sRNA表达噬粒12。</li>
		<li>以模板sRNA表达噬粒和高保真DNA聚合酶进行两组PCR反应，分别加入正向引物和反向引物（表4）。采用聚合酶供应商推荐的PCR条件（表5）。由于单引物反应无法实现指数扩增，需将模板浓度提高至标准反应的10–50倍。</li>
		<li>将上述两组PCR产物混合于微量离心管中。通过沸水浴加热至98 °C使产物退火。将微量离心管放入水浴后立即移除热源，使水浴在1–2小时内缓慢冷却至室温。</li>
		<li>为消除未突变的模板sRNA表达噬粒，向混合物中加入1 µl DpnI限制性内切酶，在37 °C孵育1小时，或按照制造商推荐时间进行完全消化。 
		注意：DpnI仅切割甲基化的靶位点，这些位点存在于宿主复制的噬粒上，而不存在于PCR产物中。</li>
		<li>将1–5 µl退火后的PCR产物转化至购买或自行制备13的感受态E. coli细胞中。通过在含适当抗生素的LB琼脂平板上选择性涂布，分离转化菌株的单菌落。</li>
		<li>为验证正确引导序列（GUIDE）的插入，对获得的菌落进行菌落PCR筛选。使用200 µl移液枪头从单个转化菌落中取少量细胞。在验证完成后，标记并保存原始菌落以供后续使用。</li>
		<li>将收集的细胞加入含50 µl无核酸酶水中的一次性微量离心管中，通过反复吹打混匀。</li>
		<li>使用台式热循环仪或沸水浴，于95 °C加热2分钟以裂解细胞。</li>
		<li>以1 µl热裂解后的细胞液作为DNA模板，PCR扩增噬粒区域。PCR反应条件及热循环程序见表6和表7。验证引物序列详见补充文件pAB.001序列文件。</li>
		<li>对PCR产物进行测序，以确认正确引导序列（GUIDE）的插入。</li>
		<li>接种携带经序列验证的sRNA表达噬粒的E. coli克隆，制备5 ml培养液。在选择性LB培养基中，于37 °C振荡过夜培养。</li>
		<li>制备经序列验证克隆的甘油保存液。将750 µl过夜培养物加入含250 µl 60%甘油的螺口冻存管中。</li>
		<li>将甘油保存液长期储存在-80 °C。剩余的过夜培养物可用于步骤2中的sRNA表达噬粒来源。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. M13 包装的噬粒文库的制备与收获
<ol>
	<li>准备5 ml培养液 大肠杆菌 携带sRNA表达噬菌粒。在含有适当抗生素的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜。注意：sRNA表达噬菌粒可通过 从头合成 克隆步骤如1.1.5所述，或从现有噬菌粒修饰并按步骤1.2.16收获。</li>
	<li>同样地，制备5 ml的培养物 E. coli 携带 M13KO7 辅助质粒。在选择性 LB 培养基中，37 °C 摇床过夜培养细胞。</li>
	<li>使用DNA提取试剂盒或类似方法提取并纯化sRNA表达噬菌粒和辅助质粒12.</li>
	<li>共转化购买或制备的13 化学感受态 E. 大肠杆菌中分别加入1 µl sRNA表达噬菌粒和辅助质粒。通过在含有两种构建体选择性抗生素的LB琼脂平板上涂布，筛选共转化子。</li>
	<li>从共转化菌株的单个菌落制备10 ml LB液体培养基培养物，并加入选择性抗生素。在37 °C下振荡培养8–12小时或过夜。</li>
	<li>在 3,300 x g 条件下离心培养物 10 分钟。收集上清液，并通过 0.2 µm 滤膜过滤。注意：若培养基溢出，需用稀释漂白剂（0.5%）清洁污染区域，以灭活感染性噬菌体颗粒。</li>
	<li>将包装好的噬菌粒滤液于 4 °C 保存。注意：样品可在此条件下保持数天至数周而不损失活性。</li>
</ol>
3. 沉默实验用F+靶细胞的制备
<ol>
	<li>确定待沉默的靶细胞是否表达F菌毛14。若F菌毛已存在，则直接进入步骤4。 
	注意：E. coli 的常见实验室菌株通常被标注为F+或F'，以表明其基因组或质粒上携带F菌毛。</li>
	<li>获取一种F+型的 E. coli 菌株，例如TOP10F'。 
	注意：确保靶菌株携带一种独特的抗性标记，以便在接合后将其与F质粒供体菌株区分开。</li>
	<li>若需通过与F+菌株接合引入F菌毛，请准备5 ml的靶菌株和F质粒供体菌株培养物14。在含有适当抗生素的LB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>次日，将两种菌株分别以1:100的比例稀释至5 ml选择性LB培养基中，并继续在37 °C振荡培养。</li>
	<li>使用台式分光光度计在600 nm处测定培养物的光密度（OD600），以确定细胞的生长阶段。继续培养约2小时，直至OD600达到0.3，表明细胞处于对数生长期15。</li>
	<li>在微量离心管中准备3组接合反应：0.5 ml F质粒供体 + 0.5 ml 靶菌株、0.5 ml F质粒供体 + 0.5 ml LB培养基（阴性对照）以及0.5 ml 靶菌株 + 0.5 ml LB培养基（阴性对照）。在37 °C振荡条件下孵育2小时，使接合反应进行。</li>
	<li>将每种接合反应液各取100 µl涂布于含特异性抗生素的选择性LB琼脂平板上（通常为四环素，用于筛选F质粒；同时加入靶菌株对应的抗生素）。涂布阴性对照反应液，以确认供体菌和受体菌均不同时表达两种抗生素抗性。</li>
</ol>
4.&#160;利用包装好的噬菌粒进行感染以实现沉默
<ol>
	<li>挑取单个F+靶细胞菌落接种于5 ml含有适当抗生素的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>次日，将F+靶细胞按1:100比例稀释至5 ml选择性LB培养基中，继续在37 °C振荡培养。</li>
	<li>使用台式分光光度计在600 nm处测定培养液的光密度（OD600），以确定细胞的生长阶段。继续培养约2小时，直至OD600达到0.3，表明细胞处于对数生长期15。注意：F菌毛的表达及感染效率在对数生长期最高。</li>
	<li>将M13包装的噬粒（来自步骤2.6）以1:100的体积比加入靶细胞中，以实现接近99%的感染率。在37 °C振荡条件下孵育30–60分钟，使感染进行。</li>
	<li>根据所选方法检测sRNA介导的基因沉默表型。 
	注意：对于荧光蛋白靶标，可通过荧光测定法直接定量沉默效果10；也可采用表型分析方法观察基因敲低后的表型变化8。</li>
	<li>按照步骤1.2.14–1.2.16制备表达sRNA的噬粒宿主菌的甘油保存菌种。注意：噬粒可在宿主菌株中无限传代，且可通过抗生素维持，类似于常规质粒。</li>
</ol>

<ol><li>Ohkumo, T., Masutani, C., Eki, T., Hanaoka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22RNAi%22%5BJournal%5D)">Use of RNAi in C. elegans.</a> RNAi. , 129-137 (2008).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (50), e2477(2011).</li>
<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2245-2264 (2007).</li>
<li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cell membranes.</a> Biophys J. 60 (2), 297-306 (1991).</li>
<li>Kim, W. J., Chang, C. -W., Lee, M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+using+water+soluble+lipopolymer+for+anti-angiogenic+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy.</a> J Control Release. 118 (3), 357-363 (2007).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19 (1), 9-12 (2003).</li>
<li>Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H., Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+using+synthetic+small+regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs.</a> Nat Biotechnol. 31 (2), 170-174 (2013).</li>
<li>Ceroni, F., Algar, R., Stan, G. -B., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cellular+capacity+identifies+gene+expression+designs+with+reduced+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden.</a> Nat Methods. 12 (5), 415-418 (2015).</li>
<li>Libis, V. K., Bernheim, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Antibiotic+Resistance+in+E.+coli+with+Engineered+Phage+Bearing+Small+Regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of Antibiotic Resistance in E. coli with Engineered Phage Bearing Small Regulatory RNAs.</a> ACS Synth Biol. 3 (12), 1003-1006 (2014).</li>
<li>Ortiz, M. E., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell-cell+communication+via+DNA+messaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered cell-cell communication via DNA messaging.</a> J Biol Eng. 6 (1), 16(2012).</li>
<li>Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+site-directed+mutagenesis+using+two+single-primer+reactions+in+parallel+to+generate+mutants+for+protein+structure-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies.</a> BMC Biotechnol. 9 (1), 61(2009).</li>
<li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recombinant+DNA+Part+I%22%5BJournal%5D)">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Recombinant DNA Part I. , 621-627 (1993).</li>
<li>Phornphisutthimas, S., Thamchaipenet, A., Panijpan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Conjugation in Escherichia coli.</a> Biochem Mol Biol Educ. 35 (6), 440-445 (2007).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Physiology+in+Luria-Bertani+Broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficiency+of+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Improving the efficiency of RNA interference in mammals.</a> Nat Rev Genet. 5 (5), 355-365 (2004).</li>
<li>Qi, L. S., Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersing+biofilms+with+engineered+enzymatic+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (27), 11197-11202 (2007).</li>
<li>Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperate+and+lytic+bacteriophages+programmed+to+sensitize+and+kill+antibiotic-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (23), 7267-7272 (2015).</li>
<li>Karlsson, F., Malmborg-Hager, A. -C., Albrekt, A. -S., Borrebaeck, C. A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+comparison+of+phage+M13-infected+vs.+uninfected+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide comparison of phage M13-infected vs. uninfected Escherichia coli.</a> Can J Microbiol. 51 (1), 29-35 (2005).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveat+of+RNAi+in+plants%3A+the+off-target+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Caveat of RNAi in plants: the off-target effect.</a> Methods in molecular biology. 744, Clifton, N.J. 13-25 (2011).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+siRNA+off-target+effects+for+target+identification+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 57-67 (2010).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Hagens, S., Blasi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+filamentous+phage+as+bactericidal+agents%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study.</a> Lett Appl Microbiol. 37 (4), 318-323 (2003).</li>
<li>Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., Norris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+phage+replication+threshold%3A+a+mathematical+model+with+implications+for+phage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy.</a> J Virol. 76 (11), 5557-5564 (2002).</li>
<li>Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+helper+phage+from+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Eliminating helper phage from phage display.</a> Nucleic Acids Res. 34 (21), e145(2006).</li>
<li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophage+targeting+gene+networks+as+adjuvants+for+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4629-4634 (2009).</li>
<li>Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+repression+and+activation+of+bacterial+gene+expression+using+an+engineered+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), 7429-7437 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

&#160;与非靶向对照相比，本方法使 mKate 荧光水平降低了 80%。这与其他 RNA 沉默方法一致，这些方法通常不会实现完全沉默，50–90% 的效率较为常见16,17。在表型水平上，靶向 CAT 的敲低能够显著减弱氯霉素抗性，并在某些条件下完全消除该抗性。
在感染后仅数小时，即可在群体水平上检测到基因敲低表型（图3B）。这说明了基于噬菌体递送系统的一个重要特性：无需事先进行遗传改造，即可在批量培养中直接实现高频率的基因敲低。与使用质粒转化或基因组整合的传统遗传改造方法不同，噬菌体感染无需从单个分离的菌落重新扩增整个群体。因此，可以在具有复杂空间动态特征的群体中、在已有空间结构（如生物膜18）的群体中，或在遗传组成混合的天然群体中19，研究噬菌体感染的作用效果11。
该方法中的一个关键步骤是以高滴度生产包装好的噬菌粒。噬菌粒生产菌株在产生噬菌体颗粒过程中可能承受较大的代谢负担，从而导致较高的突变率或质粒丢失。建议直接从单个共转化菌落培养噬菌粒生产菌株，在收获噬菌体之前不得进行冷藏、冷冻或传代培养。当同时将噬菌粒和辅助质粒导入大肠杆菌（E. coli）时，也可能观察到共转化效率较低。在此情况下，可先转化辅助质粒，然后制备携带辅助质粒的感受态细胞，再用于后续噬菌粒的转化，以获得更高的转化效率。
噬菌粒感染或sRNA表达也会给靶细胞带来可检测到的代谢负担，并可能导致某些表型扰动。例如，即使细胞被靶向CAT的噬菌粒感染时，也观察到mKate2荧光减弱的现象。图3）。通常认为，M13 感染不会在宿主中引发系统性应激反应 大肠杆菌20，但可能间接改变转录模式。或者，噬菌粒上携带的GFP或氨苄青霉素抗性标记可能与mKate2表达和细胞生长竞争细胞资源，从而导致其表达水平和生长下降9最后，sRNA表达盒本身可能通过滴定Hfq蛋白或通过非靶标mRNA的沉默，全局性改变基因表达谱。非靶标效应在 体内 RNAi 靶向21-23但该系统尚未得到系统的探究。
该方法的一个局限性在于感染效率低于100%，导致部分未感染的细菌在群体中持续存在。本研究及先前的研究10结果表明，未感染细胞约占最终群体的1%至10%，并导致了大多数观察到的非沉默表型。目前已知多种产生M13抗性的途径，其中最常见的是菌毛表达的突变性缺失24。鉴于这些局限性，应使用对照实验来确认较高的感染率和基因敲低效率。
对于某些应用而言，另一个潜在的局限性是偶尔会转移污染性的辅助噬菌体。尽管M13K07含有突变的包装信号，仍可能以较低频率被包装进噬菌体衣壳，并转移至被感染的细胞群体中，导致部分细胞具备产生噬菌体的能力，从而使噬菌体在初始感染事件之后持续扩散25。对辅助噬菌体进行改造已被证明可有效减少非特异性包装，但有时会以降低噬菌体产量为代价26。
工程化噬菌体已成为不可或缺的工具 E. coli 合成生物学，可实现向不断增长的细胞群体快速递送新基因。近期研究已开发出细胞间通讯回路11 或表达转录因子以抑制抗生素耐药通路27该方案进一步丰富了通过编程RNA调控细菌生理特性的工具集。CRISPR-Cas核酸酶在发生突变以消除其核酸酶活性后，已被证实可在RNA引导的基因靶点处抑制转录17,28相比之下，小RNA（sRNA）沉默作用在翻译水平上进行，且不需要外源蛋白的表达。下一代生物技术可能会将转录和翻译调控与噬菌体介导的递送相结合，以实时编程复杂的表型。

RNA介导的基因敲低过程分为两个阶段。首先，将RNA分子导入待研究的细胞系或生物体中。其次，内源性RNA结合蛋白促进RNA与靶标的识别，并产生沉默效应。所有RNA敲低技术都受益于合成小RNA（sRNA）的高度可定制性，可轻松制备出与特定目标序列匹配的sRNA。然而，RNA摄取和沉默的分子机制在不同模式系统间存在显著差异，这限制了RNA敲低技术的应用范围和使用方式。
在线虫中，双链RNA（dsRNA）分子可直接加入培养基中，或通过喂食表达dsRNA的大肠杆菌（E. coli）细胞来引入1,2。 在果蝇（Drosophila）中，可通过向胚胎显微注射dsRNA实现RNA干扰3，或在细胞系中直接将dsRNA加入培养基中实现4。在哺乳动物细胞系中，合成的小干扰RNA（siRNA）可通过电穿孔递送至活细胞1,2,5，包裹于脂质体中递送3,6，或由DNA质粒载体表达4,7。一旦RNA分子进入细胞质，RNA干扰通路依赖RISC复合物对dsRNA进行加工，促进对靶标序列的反义识别，并催化翻译抑制、mRNA降解或异染色质形成，具体效应取决于宿主生物。
由于这些限制，经典的RNAi只能在能够高效吸收外源RNA并表达RISC或类似RISC活性的生物体中进行。值得注意的是，模式细菌E. coli缺乏RNAi通路，因此无法应用该技术。然而，合成生物学的最新进展为解决RNA递送和基因沉默这两个问题提供了有效工具。
在本实验方案中，利用M13噬菌粒/辅助质粒系统将DNA载体递送至活细胞，使sRNA构建体在大肠杆菌（E. coli）中表达。噬菌粒是指含有噬菌体来源的f1复制起点的任何质粒。辅助质粒（本实验中为M13KO）携带产生病毒颗粒所需的所有分子机制，但其自身不具备复制和包装能力。当噬菌粒与辅助质粒共转化时，仅噬菌粒在f1复制起点处进行复制，并被包装和分泌。随后，携带目标序列的噬菌粒可通过F菌毛感染活的大肠杆菌（E. coli）。
在此系统中，基因沉默效应由定制的小RNA（sRNA）表达盒产生，该表达盒结合了支架序列与靶标结合序列。靶标结合序列长度为24个碱基，与mRNA靶标序列反向互补，通常位于核糖体结合位点（RBS）。支架序列由Na及其同事开发8，其中包含一个从MicC中提取的Hfq蛋白结合基序；MicC是一种内源于大肠杆菌（E. coli）的小调控RNA。Hfq蛋白可促进RNA-RNA结合及mRNA降解，在本系统中的作用类似于RNA干扰（RNAi）中的RISC复合物。图1展示了通过噬菌体介导的sRNA敲低的完整方案，包括sRNA表达盒结构、噬菌粒载体化过程以及基因沉默机制。
作为一种调控基因表达的方法 E. colisRNA 沉默技术简单、快速且具有高度通用性。所靶向的 E. coli 不会因传播噬菌粒和表达小RNA之外的任务而增加负担。这在合成生物学或基础研究背景下可能具有重要意义，因为表达较大的异源构建体会消耗细胞资源9噬菌粒可通过一次PCR制备，并在噬菌粒转化后一天内收获。最后，几乎任何mRNA均可作为靶标。该sRNA调控盒（位于标准质粒上）已在代谢相关多种靶标中验证有效，通常可实现典型的抑制水平 &#62;90%8.
本方案在先前利用噬粒载体携带的小RNA表达盒研究的基础上进行了重现和拓展10。首先，将包装好的噬粒导入大肠杆菌（E. coli）批量培养物中，用于沉默荧光蛋白mKate2的表达，并实时监测其荧光变化。其次，通过敲低CAT基因可降低细菌在琼脂平板上的氯霉素抗性表型。在这两种情况下，噬粒本身携带一个GFP标记，使得感染率可独立于基因敲低效率进行测定。

<table><tbody><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 酶</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x 预混液</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 辅助噬菌体</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F' 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

噬菌体介导的靶向srna构建体递送以敲低基因表达 e. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA介导的基因敲低技术被广泛用于调控基因表达。这一多功能技术家族利用可人工合成且序列任意的短链RNA（sRNA），通过设计使其序列与靶向沉默的基因互补。由于sRNA构建体可直接导入多种细胞类型，或借助多种载体递送，因此可在无需繁琐遗传修饰的情况下，在活细胞中实现基因表达的抑制。目前最常用的RNA敲低技术是RNA干扰（RNAi），其利用细胞内源性的RNA诱导沉默复合体（RISC）识别特定序列并切割靶标mRNA。因此，该技术的应用仅限于表达RISC的生物体，主要是真核生物。近年来，新一代RNA生物技术研究人员开发出通过RNA调控基因表达的替代机制，从而实现了在细菌中进行RNA介导的基因敲低。本文描述了一种在 E. coli 在功能上类似于RNAi。在该系统中，设计了一种合成的噬菌粒以表达小RNA（sRNA），该sRNA可被设计为靶向任意序列。表达载体被递送至一群 E. coli 经非裂解型M13噬菌体转导后，细胞能够以质粒形式稳定复制。靶标mRNA的反义识别与沉默由内源性Hfq蛋白介导。 E. coli本方案包括设计反义小RNA、构建噬菌粒载体、将噬菌粒包装入M13噬菌体、制备用于感染的活细胞群体以及实施感染操作。以荧光蛋白mKate2和抗生素抗性基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）为靶标，以获得代表性数据并量化基因表达下调效果。

在液体培养基中抑制 mKate2 荧光
图1展示了本研究中描述的sRNA介导的基因敲低方案，包括sRNA表达盒设计、噬菌粒载体化及沉默机制。根据方案1.2，将质粒pAB.001中的sRNA沉默表达盒改造为靶向mKate。合成sRNA表达盒并将其克隆至噬菌粒Litmus28i_J23115-B0032-GFP中，该噬菌粒由Monica Ortiz和Drew Endy惠赠11。该噬菌粒携带GFP表达和卡那霉素抗性标记，可用于追踪成功感染的细胞。按照方案2制备包装后的噬菌粒储备液。
通过接合F质粒供体菌株（参照方案3），制备了携带组成型表达的染色体整合mKate2标记的E. coli K12 MG1655衍生菌株，用于噬菌体感染。将细胞培养至对数中期后，按照方案4引入噬粒。噬粒感染后，将200 μl培养物转移至荧光酶标仪，并连续监测荧光24小时。
图3展示了sRNA介导的沉默对mKate2表达的影响。感染了抗mKate2噬菌粒的菌株未检测到明显的mKate2荧光信号，超出背景水平。相比之下，该菌株表达了GFP标记，表明噬菌粒成功进入细胞。未感染的对照细胞产生mKate2荧光，但不表达GFP。另一个对照实验中，将抗mKate2的靶向结构域替换为靶向CAT的序列，结果对mKate2荧光无影响。
在琼脂平板上沉默氯霉素抗性
按照方案1.1，构建了靶向CAT的小RNA（sRNA）沉默表达盒。通过与F质粒供体菌株接合（按照方案3），制备了一株携带组成型表达、染色体整合的CAT标记的E. coli K12 MG1655衍生菌株，用于噬菌体感染。将细胞培养至对数中期后，按照方案4引入噬菌粒。在37 °C孵育1小时后，对感染的细胞进行连续稀释，并在一系列不同浓度的氯霉素条件下涂布平板。平板过夜培养后，于次日通过计数菌落形成单位（CFUs）确定各氯霉素浓度下抗性细胞的比例。
图4展示了sRNA介导的沉默作用对氯霉素抗性表型的影响。未感染的细胞或感染了靶向mKate2的噬菌粒的细胞在所有测试浓度的氯霉素中均表现出抗性。相比之下，感染了靶向CAT的噬菌粒的细胞在低浓度氯霉素下存活率降低，在高浓度下几乎被完全杀灭（杀灭率接近99%）。加入氨苄青霉素以筛选仅携带噬菌粒的细菌后，氯霉素抗性菌的存活率降至无法检测的水平。这一结果与早期研究一致，表明逃避噬菌体感染是逃避沉默效应的常见途径10。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> 
图1：利用M13噬菌体递送sRNA表达盒在E. coli中实现基因沉默。&#160;sRNA表达盒由四个模块组成：pR启动子（源自λ噬菌体的组成型启动子）、一段24 bp的靶向序列、从MicC中提取的Hfq结合域以及一个转录终止子8。该表达盒被插入含有M13 f1复制起点的噬粒中，并利用辅助噬菌体M13KO7将其包装进M13衣壳内。包装后的噬粒可感染表达F菌毛的E. coli，并在其中启动sRNA的表达。sRNA随后招募Hfq蛋白（图中以红色表示），并与核糖体结合位点附近的mRNA靶标通过反义互补配对结合，从而导致翻译抑制和mRNA降解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> 
图2：sRNA靶位点的引物设计与定点突变。设计两条引物，其部分序列与现有的sRNA表达盒具有同源性。正向引物在5'端包含20 bp与pR启动子同源的序列，随后是代表新GUIDE序列的24 bp，最后是3'端18 bp与Hfq结合结构域同源的序列。反向引物是正向引物的完全反向互补序列，其两端为与现有sRNA表达盒同源的区域，中间夹着新GUIDE序列的反向互补序列。具体引物序列见表3。分别使用正向和反向引物进行单引物PCR反应，可获得含有目标修饰序列的线性单链DNA。按照方案中所述进行纯化后，将正向与反向PCR产物退火，即可得到含有目标修饰sRNA表达盒的双链质粒DNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> 
图3：染色体整合的mKate2荧光报告基因的敲低效果。E. coli MG1655 K12表达mKate2，分别进行以下处理：未处理（红线和红柱）、感染抗mKate2噬菌粒（绿线和绿柱）或感染靶向CAT的对照噬菌粒（蓝线和蓝柱）。(A) 未处理的E. coli生长至更高的饱和密度，表明噬菌体感染带来代谢负担。虚线表示3次重复实验的标准偏差。(B) 经抗mKate2噬菌粒处理的菌株中，mKate2信号降低至接近背景水平，而对照菌株中未见此现象。(C) 由噬菌粒携带的GFP荧光仅在噬菌粒处理的对照组中可检测到。(D、E) 培养24小时后的最终荧光读数经OD归一化。GFP信号（指示噬菌粒感染）在未处理对照组中缺失，但在抗CAT噬菌粒处理组中也显著降低，这可能提示噬菌粒存在脱靶效应。与未处理对照组相比，抗mKate2噬菌粒处理显著降低了mKate2信号。靶向CAT的对照噬菌粒对mKate2荧光无影响。误差线表示3次重复实验的标准偏差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> 
图4：CAT基因的敲低使遗传性耐药的大肠杆菌群体恢复对氯霉素的敏感性。携带染色体整合的CAT基因的E. coli MG1655 K12菌株未经处理（红色柱）、用靶向mKate2的对照噬菌粒处理（绿色柱），或用表达抗CAT sRNA的噬菌粒处理（蓝色柱）。感染1小时后，通过连续稀释和涂板评估在指定抗生素条件下的存活率。在较高浓度氯霉素下，经抗CAT噬菌粒处理的菌株被显著杀灭（&#62;90%），而对照处理组则不受影响。在培养平板中添加氨苄青霉素可正向筛选出被噬菌粒感染的细胞，并清除未感染的细胞。在此条件下，抗CAT处理后未观察到氯霉素耐药菌落。这表明大多数存活菌落源于感染失败，而非基因沉默失败。误差线表示三次重复实验的标准偏差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CAT 目标序列</td>
			<td>5' - ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT 引导序列</td>
			<td>5' - ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：CAT基因的TARGET序列和GUIDE序列示例。 注意两者之间的反向互补关系。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pR 启动子</td>
			<td colspan="5">TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>向导序列</td>
			<td colspan="5">ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hfq 结合结构域</td>
			<td colspan="5">TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT 
			TCTCGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T1/TE 终止子</td>
			<td colspan="5">CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA 
			CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：sRNA表达盒的序列组分。 每个序列均按5'-3'方向书写。完整的表达盒由这4个元件按顺序连接而成，共包含292 bp。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>正向引物</td>
			<td>5' - CTGGCGGTGATAATGGTTGC[GUIDE]TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物</td>
			<td>5' - GCAATGGCCCAACAGAAA[TARGET]GCAACCATTATCACCGCCAG - 3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：用于修饰现有 GUIDE 元件的引物设计。 正向引物包含 pR 启动子的最后 20 个碱基、新的 GUIDE 序列以及 Hfq 结合结构域的前 18 个碱基。TARGET 序列是 GUIDE 序列的完全反向互补序列。反向引物是正向引物的完全反向互补序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板质粒</td>
			<td>500 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 引物</td>
			<td>2.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>0.4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高保真聚合酶 (2 U/μl)</td>
			<td>0.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x PCR 缓冲液</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：单引物诱变PCR的建议条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">30 个循环</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>120 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>300 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存</td>
			<td>10 °C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：单引物诱变PCR的建议热循环仪程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 正向引物</td>
			<td>0.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 反向引物</td>
			<td>0.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X 主混合液</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>23 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：序列验证PCR的建议条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">30 个循环</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>300 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存</td>
			<td>10 °C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表7：序列验证PCR建议的热循环仪程序。

我们描述了一种利用M13噬菌粒载体递送的序列靶向sRNA表达盒，在生长中的大肠杆菌（E. coli）细胞群体中敲低基因表达的方法。

噬菌体介导的靶向sRNA构建体递送以敲低基因表达 E. coli

RNA介导的基因敲低技术被广泛用于调控基因表达。这一系列多功能技术利用短链RNA（sRNA），其可被用于……

本实验的总体目标是在大肠杆菌（E.coli）的生长群体中敲低目的基因。基因敲低常被用于探究基因功能的基本问题，这些方法在合成生物学中也可能具有应用价值。例如，在沉默毒力因子等不需要的基因时。该技术的主要优势在于，无需事先进行遗传修饰，即可在大肠杆菌的批量培养中实施，并在数小时后即可观察到结果。首先，根据文本方案设计的含有sRNA表达盒的质粒，通过定点突变对该表达盒中的序列进行修饰，第一步是确定表达盒中的24个碱基对的引导序列。设计并合成上下游引物，引物两端含有与现有sRNA表达盒同源的短序列，用于侧接新的24个碱基的引导序列。在含有抗生素的LB培养基中培养5毫升携带模板sRNA表达噬粒的大肠杆菌（E.coli）培养物。在37°C条件下振荡培养过夜。从培养物中提取并纯化模板sRNA噬菌粒后，准备两组PCR反应，每组使用推荐量10至50倍的sRNA噬菌粒DNA模板以及高保真聚合酶。一组反应加入正向引物，另一组加入反向引物。在采用标准PCR条件运行反应后，将两组反应液合并至同一微量离心管中。然后将产物在沸水浴中加热至98摄氏度进行退火。立即关闭热源，使水浴在接下来的1至2小时内缓慢冷却至室温。为消除未突变的模板sRNA，向混合物中加入1 µL DpnI限制性内切酶，在37摄氏度孵育1小时，或按照制造商推荐的时间进行完全消化。接下来，用1至5微升退火后的PCR产物转化化学感受态的大肠杆菌（E.coli）细胞。然后通过在含抗生素的LB平板上进行选择性涂布，分离单菌落。通过菌落PCR验证正确引导序列的插入情况。使用200微升移液枪头从单个转化菌落中吸取少量细胞。将收集的细胞加入含有50微升无核酸酶水的微量离心管中，并通过移液混匀。然后使用台式热循环仪或沸水浴，于95摄氏度加热2分钟以裂解细胞。以1 µL裂解细胞作为DNA模板，根据此处所示条件进行PCR反应。在验证向导序列正确后，用正确的sRNA克隆接种5 mL培养液，并过夜培养细胞。次日，取750 µL过夜培养物与250 µL 60%甘油混合于螺口冻存管中，制备甘油菌种保存液。为制备M13包装的噬菌粒储备液，需准备5毫升携带sRNA表达噬菌粒的大肠杆菌（E.coli）过夜培养物，同时准备5毫升携带M13KO7辅助质粒的大肠杆菌（E.coli）过夜培养物。次日，在纯化DNA后，将1微升sRNA表达噬菌粒和1微升辅助质粒共同转化至化学感受态大肠杆菌（E.coli）中。在含有抗生素的LB-琼脂平板上进行涂布，以筛选两种构建体。噬菌粒表达对细胞具有较大的适应性负担，可能导致转化效率降低。可能需要通过两步连续转化的方式引入质粒。在37摄氏度下将转化后的细胞过夜培养后，从共转化菌株的单个菌落制备10毫升培养液。次日早晨，以3300 × g离心培养液10分钟。收集上清液，并通过0.2微米滤膜过滤。将包装好的噬菌粒滤液在4摄氏度保存。根据文本方案，制备F+靶细胞时，挑取单克隆接种于5毫升含抗生素的LB培养基中，于37摄氏度振荡过夜培养。次日，取5毫升选择性LB培养基将F+靶细胞按1:100比例稀释，继续孵育。将细胞培养约两小时，直至 OD600 达到 0.3，表明细胞处于对数生长期。用于沉默的细胞应在指数生长期时表达 F 性菌毛，以实现高效的噬菌粒感染。以 1:100 的比例将 M13 包装的噬菌粒加入目标细胞中，以达到接近 99% 的目标细胞群感染率。在37摄氏度下振荡培养30至60分钟，使感染继续进行。然后根据需要检测sRNA沉默表型。按照本视频中演示的方案，使用质粒pAB的sRNA沉默表达盒。001 被改造为靶向 mKate2。该图显示，感染了抗 mKate2 噬菌粒的大肠杆菌（E.coli）菌株在背景水平以上未检测到可察觉的 mKate2 荧光。然而，该菌株表达了 GFP，表明噬菌粒成功被摄入。在本实验中，使用携带染色体整合的氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，简称CAT基因）的大肠杆菌（E.coli）菌株，感染靶向CAT的噬菌粒，并检测了小RNA（sRNA）对氯霉素抗性的沉默效应。当噬菌粒靶向CAT时，细菌在低浓度氯霉素条件下的存活率降低，在高浓度下几乎达到99%的杀灭率。相比之下，未感染的细菌或感染了靶向mKate2的sRNA的细菌在所有测试浓度的氯霉素中均表现出抗性。如图所示，添加氨苄青霉素（用于筛选仅携带噬菌粒的细菌）后，氯霉素存活率降至无法检测的水平。更换sRNA靶基因并制备感染性噬菌粒可在五天内完成。请注意，噬菌体操作可能对实验室中的其他实验造成严重危害，因此在进行本实验时，应始终采取预防措施（例如使用专用实验器材），以避免意外污染。观看本视频后，您应能充分理解如何设计、克隆并制备携带sRNA的感染性质粒，以在大肠杆菌（E.coli）的活跃生长群体中敲低任何目标基因。

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Research

科研

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Biology

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