针对性斯尔纳的噬菌体介导的交付构造击倒基因表达电子。大肠杆菌

该程序的总体目标是在不断增长的大肠杆菌种群中敲低目标基因。基因敲低通常用于探索基因功能的基本问题。这些方法也可能在合成生物学中得到应用。

例如，沉默不需要的基因，如毒力因子。该技术的主要优点是可以在大肠杆菌的批量培养中进行，无需事先进行基因改造，几个小时后即可观察到结果。首先，使用含有根据文本方案设计的 sRNA 表达盒的质粒，首先通过识别表达盒中的 24 个碱基对向导序列，对序列进行定点诱变。

设计和合成与现有 sRNA 盒同源的短区域正向和反向引物，位于新的 24 个碱基对向导序列的两侧。在携带模板 sRNA 表达噬菌粒的 LB 和抗生素中制备 5 毫升大肠杆菌培养物。将细胞在 37 摄氏度下摇动培养过夜。

从培养物中提取和纯化模板 sRNA 噬菌粒后，准备两个 PCR 反应，使用 10 至 50 倍于 sRNA 噬菌粒和高保真聚合酶推荐量的 DNA 模板。准备一个带有正向引物的反应和一个带有反向引物的反应。使用标准 PCR 条件进行反应后，将两个反应合并到微量离心管中。

然后在沸水浴中加热至 98 摄氏度，使产品退火。立即关闭热源，让浴槽在接下来的 1 到 2 小时内慢慢恢复到室温。为了去除未突变的模板 sRNA，向混合物中加入 1 微升 DpnI 限制性内切酶，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时，或按照制造商推荐的完全消化时间孵育。

接下来，用 1 至 5 μL 退火的 PCR 产物转化化学感受态的大肠杆菌细胞。然后通过用抗生素选择性铺板在 LB 板上分离单个菌落。验证正确的向导序列是否与菌落 PCR 结合。

使用 200 μL 移液器吸头从单个转化集落中收集少量细胞。将收集的细胞加入微量离心管中的 50 微升无核酸酶水中，并通过移液混合。然后用台式热循环仪或沸水浴加热至 95 摄氏度 2 分钟，裂解细胞。

使用一微升裂解的细胞作为 DNA 模板，根据此处显示的条件进行 PCR。验证正确的向导序列后，用正确的 sRNA 克隆接种 5 mL 培养物，并使细胞生长过夜。第二天，将 750 μL 过夜培养物与 250 μL 60% 甘油混合在螺旋盖冻存管中，制备甘油原液。

为了制备 M13 包装的噬菌粒原液，制备 5 mL 的大肠杆菌过夜培养物，携带 sRNA 表达噬菌粒。此外，准备 5 mL 的大肠杆菌过夜培养物，携带 M13KO7 辅助质粒。第二天，纯化 DNA 后，用 sRNA 表达噬菌粒和辅助质粒各 1 μL 共转化化学感受态大肠杆菌。

用抗生素在 LB 琼脂上铺板，以选择两种构建体。噬菌粒表达对细胞来说是一个很大的适应负荷，可能导致转化效率降低。可能需要在两个连续的转化步骤中引入质粒。

将转化的细胞在 37 摄氏度下孵育过夜后，从共转化菌株的单个菌落中制备 10 mL 培养物。第二天早上，将培养物以 3300 x g 离心 10 分钟。收集上清液并通过 0.2 微米过滤器过滤。

将包装好的噬菌粒滤液储存在 4 摄氏度。制备 F + 靶细胞后，根据文本方案，将单个菌落接种到含有抗生素的 5 ml LB 培养基培养物中，并在 37 摄氏度下振荡生长过夜。第二天，使用 5 mL 选择性 LB 培养基将 F + 靶细胞稀释 1 到 100 个，然后继续孵育。

将细胞培养约两小时，直到获得 OD 600 为 0.3，表明对数期生长。当菌毛 F 的表达沉默以实现有效的噬菌粒感染时，靶向沉默的细胞应处于指数期。向靶细胞中加入 1：100 比例的 M13 包装噬菌粒，以实现近 99% 的靶细胞群感染。

让感染在 37 摄氏度下进行，同时摇晃 30 到 60 分钟。然后根据需要检测 sRNA 沉默表型。按照本视频中演示的方案，质粒 pAB 的 sRNA 沉默盒。

001 被改变为 mKate2 的靶标。该图表明，用抗 mKate2 噬菌粒感染的大肠杆菌菌株在背景上没有显示出可检测的 mKate2 荧光。然而，该菌株确实表达了 GFP，表明成功摄取了噬菌粒。

在本实验中，具有染色体整合的氯霉素乙酰转移酶或 CAT 基因的大肠杆菌菌株被靶向 CAT 的噬菌粒感染，并测试了氯霉素耐药性的 sRNA 沉默。噬菌粒靶向 CAT 的细胞在低氯霉素浓度下存活率降低，在较高浓度下存活率接近 99%。另一方面，未感染的细胞或感染了沉默 mKate2 的 sRNA 的细胞，在所有测试浓度下都对氯霉素具有耐药性。

如此处所示，添加氨苄西林，用于仅选择携带噬菌粒的细菌，将氯霉素的存活率降低到无法检测的水平。改变 sRNA 靶基因和产生感染的噬菌粒可以在 5 天内完成。不要忘记，使用噬菌体对于实验室中的其他实验可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用专用实验室器皿，以避免不必要的污染。

观看此视频后，您应该对如何设计、克隆和生产感染的噬菌粒有很好的了解，这些噬菌粒携带 sRNA 以敲除活跃增长的大肠杆菌种群中的任何目标基因。