噬菌体介导的靶向sRNA构建体递送以敲低基因表达 E. coli
2016年3月20日
我们描述了一种利用M13噬菌粒载体递送的序列靶向sRNA表达盒，在生长中的大肠杆菌（E. coli）细胞群体中敲低基因表达的方法。
本实验的总体目标是在大肠杆菌（E.coli）的生长群体中敲低目的基因。基因敲低常被用于探究基因功能的基本问题，这些方法在合成生物学中也可能具有应用价值。
例如，在沉默毒力因子等不需要的基因时。该技术的主要优势在于，无需事先进行遗传修饰，即可在大肠杆菌的批量培养中实施，并在数小时后即可观察到结果。首先，根据文本方案设计的含有sRNA表达盒的质粒，通过定点突变对该表达盒中的序列进行修饰，第一步是确定表达盒中的24个碱基对的引导序列。
设计并合成上下游引物，引物两端含有与现有sRNA表达盒同源的短序列，用于侧接新的24个碱基的引导序列。在含有抗生素的LB培养基中培养5毫升携带模板sRNA表达噬粒的大肠杆菌（E.coli）培养物。在37°C条件下振荡培养过夜。
从培养物中提取并纯化模板sRNA噬菌粒后，准备两组PCR反应，每组使用推荐量10至50倍的sRNA噬菌粒DNA模板以及高保真聚合酶。一组反应加入正向引物，另一组加入反向引物。在采用标准PCR条件运行反应后，将两组反应液合并至同一微量离心管中。
然后将产物在沸水浴中加热至98摄氏度进行退火。立即关闭热源，使水浴在接下来的1至2小时内缓慢冷却至室温。为消除未突变的模板sRNA，向混合物中加入1 µL DpnI限制性内切酶，在37摄氏度孵育1小时，或按照制造商推荐的时间进行完全消化。
接下来，用1至5微升退火后的PCR产物转化化学感受态的大肠杆菌（E.coli）细胞。然后通过在含抗生素的LB平板上进行选择性涂布，分离单菌落。通过菌落PCR验证正确引导序列的插入情况。
使用200微升移液枪头从单个转化菌落中吸取少量细胞。将收集的细胞加入含有50微升无核酸酶水的微量离心管中，并通过移液混匀。然后使用台式热循环仪或沸水浴，于95摄氏度加热2分钟以裂解细胞。
以1 µL裂解细胞作为DNA模板，根据此处所示条件进行PCR反应。在验证向导序列正确后，用正确的sRNA克隆接种5 mL培养液，并过夜培养细胞。次日，取750 µL过夜培养物与250 µL 60%甘油混合于螺口冻存管中，制备甘油菌种保存液。
为制备M13包装的噬菌粒储备液，需准备5毫升携带sRNA表达噬菌粒的大肠杆菌（E.coli）过夜培养物，同时准备5毫升携带M13KO7辅助质粒的大肠杆菌（E.coli）过夜培养物。次日，在纯化DNA后，将1微升sRNA表达噬菌粒和1微升辅助质粒共同转化至化学感受态大肠杆菌（E.coli）中。
在含有抗生素的LB-琼脂平板上进行涂布，以筛选两种构建体。噬菌粒表达对细胞具有较大的适应性负担，可能导致转化效率降低。可能需要通过两步连续转化的方式引入质粒。
在37摄氏度下将转化后的细胞过夜培养后，从共转化菌株的单个菌落制备10毫升培养液。次日早晨，以3300 × g离心培养液10分钟。收集上清液，并通过0.2微米滤膜过滤。
将包装好的噬菌粒滤液在4摄氏度保存。根据文本方案，制备F+靶细胞时，挑取单克隆接种于5毫升含抗生素的LB培养基中，于37摄氏度振荡过夜培养。次日，取5毫升选择性LB培养基将F+靶细胞按1:100比例稀释，继续孵育。
将细胞培养约两小时，直至 OD600 达到 0.3，表明细胞处于对数生长期。用于沉默的细胞应在指数生长期时表达 F 性菌毛，以实现高效的噬菌粒感染。以 1:100 的比例将 M13 包装的噬菌粒加入目标细胞中，以达到接近 99% 的目标细胞群感染率。
在37摄氏度下振荡培养30至60分钟，使感染继续进行。然后根据需要检测sRNA沉默表型。按照本视频中演示的方案，使用质粒pAB的sRNA沉默表达盒。
001 被改造为靶向 mKate2。该图显示，感染了抗 mKate2 噬菌粒的大肠杆菌（E.coli）菌株在背景水平以上未检测到可察觉的 mKate2 荧光。然而，该菌株表达了 GFP，表明噬菌粒成功被摄入。
在本实验中，使用携带染色体整合的氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，简称CAT基因）的大肠杆菌（E.coli）菌株，感染靶向CAT的噬菌粒，并检测了小RNA（sRNA）对氯霉素抗性的沉默效应。当噬菌粒靶向CAT时，细菌在低浓度氯霉素条件下的存活率降低，在高浓度下几乎达到99%的杀灭率。相比之下，未感染的细菌或感染了靶向mKate2的sRNA的细菌在所有测试浓度的氯霉素中均表现出抗性。
如图所示，添加氨苄青霉素（用于筛选仅携带噬菌粒的细菌）后，氯霉素存活率降至无法检测的水平。更换sRNA靶基因并制备感染性噬菌粒可在五天内完成。请注意，噬菌体操作可能对实验室中的其他实验造成严重危害，因此在进行本实验时，应始终采取预防措施（例如使用专用实验器材），以避免意外污染。
观看本视频后，您应能充分理解如何设计、克隆并制备携带sRNA的感染性质粒，以在大肠杆菌（E.coli）的活跃生长群体中敲低任何目标基因。
概述
本文介绍了一种利用M13噬菌粒载体递送序列靶向sRNA表达盒，在大肠杆菌（E. coli）中敲低基因表达的方法。该技术可在无需预先进行遗传修饰的情况下，在批量培养体系中实现基因沉默，并在数小时内获得结果。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因表达
- 微生物学
- 合成生物学
背景
- 基因敲低可用于研究基因功能。
- 该方法可沉默不需要的基因，例如毒力因子。
- 适用于合成生物学领域。
- 处理后可迅速观察到结果。
研究目的
- 建立一种在大肠杆菌中进行基因敲低的方法。
- 探究特定基因的功能。
- 提供一种快速高效的基因沉默技术。
使用的方法
- 对sRNA表达盒进行定点突变。
- 将修饰后的噬菌粒转化至大肠杆菌（E. coli）中。
- 通过菌落PCR验证正确引导序列的插入。
- 用M13包装的噬菌粒感染靶细胞。
主要结果
- 成功实现了靶基因的沉默。
- 在选择性条件下，感染的大肠杆菌表现出存活率降低。
- 结果表明噬菌粒被有效摄取。
- 基因靶向以高效率实现。
结论
- 该方法可实现大肠杆菌（E. coli）中基因的快速敲低。
- 该方法可应用于多种目的基因。
- 由于噬菌体可能存在潜在危害，操作时需谨慎。
常见问题
行业高管相关性
噬菌体介导的小RNA递送可在无需预先基因改造的情况下，实现大肠杆菌（E. coli）中快速、序列特异性的基因敲低，支持功能基因组学和合成生物学研究。该方法可在早期发现的关键节点加速靶点验证和机制层面的风险评估，为项目组合筛选提供可操作的数据。其与批量培养的兼容性及定量输出特性，有助于在细菌系统中规模化、可重复地探究基因功能。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在活体细菌群体中直接探究基因功能。
- 通过沉默毒力因子等候选基因，支持作用机制的去风险化研究。
- 无需繁琐的基因工程操作，即可实现快速靶点验证。
- 为假设驱动型研究提供定量的表型读出结果。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的细菌系统。
- 提供可重复的、定量的基因敲低表型，用于检测标准化。
- 实现对多个靶标的基因功能进行高通量评估。
- 通过快速重新设计sRNA构建体，支持平台的重复使用。
转化与临床前研究
- 与合成生物学致力于改造微生物菌株用于治疗或工业应用的目标相一致。
- 在细菌模型中实现从发现到临床前验证的连贯流程。
- 通过在放大生产前对基因靶点进行功能评估，降低生物风险。
流程与工作流整合
该方法在早期发现和靶点验证阶段进行整合，将功能基因组学与细菌系统中的检测方法开发及转化研究相结合。
- 发现生物学：通过实现靶向基因沉默，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复的定量表型，用于检测就绪性评估和化合物评价。
- 分析：提供可量化的输出结果，如荧光降低和抗生素敏感性，用于比较分析。
- 转化研究：通过在与疾病相关的细菌模型中开展基因功能研究，促进临床前研究的连续性。
- 企业级复用：提供模块化且可灵活调整的平台，适用于多种基因靶点和项目的重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高细菌基因功能研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化、可扩展性和快速周转，简化工作流程。
- 战略价值：通过实现早期风险排除，提升“推进/终止”决策能力与资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对细菌靶标进行风险校正后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆、噬菌体操作和细菌培养方面的专业知识。
- 需要具备PCR、菌落筛选以及荧光或抗生素筛选分析的实验条件。
- 要求严格分离实验器具，以防止噬菌体污染。
- 若应用于其他细菌种类，可能需要优化递送系统和基因沉默组分。
- 由于存在污染风险，基于噬菌体的递送方式可能不适用于所有实验室环境。
