DamID-seq：通过高通量测序腺嘌呤甲基化DNA片段实现全基因组蛋白质-DNA相互作用作图
2016年1月27日
本文介绍了一种将DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DamID）与高通量测序相结合的检测方法（DamID-seq）。该改进方法具有更高的分辨率和更宽的动态范围，可实现DamID-seq数据与其他高通量测序数据（如ChIP-seq、RNA-seq）的联合分析。 等等。
本实验方案的总体目标是通过高通量测序技术检测动物细胞中与目标蛋白相关的基因组DNA序列。该技术有助于解答哺乳动物细胞核结构、转录及调控研究中的关键问题，例如鉴定与核内淀粉样蛋白或特定转录因子相关的基因组区域。该技术的主要优势在于，相较于最初使用DNA微阵列的DamID方法，高通量测序可提供更高的分辨率，并且能够与我们已有的高通量测序数据进行交叉分析。
本实验操作将由本实验室的技术员 Brennan Olson 演示。首先，按照文字版实验方案，将目的基因克隆至 DamID 载体中。接着，利用慢病毒表达系统，制备表达 DamV5 POY 和 V5-Dam 的慢病毒原液。
根据制造商提供的说明书，按照正向转染步骤将 DamID 载体与慢病毒包装质粒共转染。务必包含使用 0.45 µm PVDF 滤膜的过滤步骤。现在，准备用慢病毒感染细胞。
提前一天将贴壁细胞接种于六孔板中。继续使用抗生素。目的是使细胞在次日达到50%的汇合度，以便进行感染实验。
次日，从冰箱中取出冷冻的 DamV5 POY 和 V5-Dam 慢病毒上清液，放入 37 摄氏度水浴中解冻。在培养板中，移除生长培养基，并替换为 0.5 毫升不含抗生素的新鲜生长培养基。随后，向各孔中加入 1 毫升解冻后的慢病毒液。
在两个孔中加入V5-Dam，两个孔中加入DamV5 POY，另设两个孔不加慢病毒作为阴性对照。轻轻摇晃培养板使溶液覆盖细胞，然后将培养板放回培养箱。24小时后，用两毫升不含抗生素的生长培养基替换细胞上的病毒悬液。
随后，继续孵育48小时。两天后，按照文字方案进行操作，分离基因组DNA，该过程约需1小时。然后，从基因组DNA中扩增腺嘌呤甲基化的DNA片段。
该过程需要大约两到三天，具体细节在文本方案中有详细说明。进行此操作时，首先将扩增的腺嘌呤甲基化DNA进行片段化。在使用DNA片段化酶之前，重要的是先测定其强度，以确定适当的消化时间。
使用任何可获得的纯化甲基化PCR产物进行本诊断检测。首先配制主混合液，包含六微克DNA、12微升10X Fragmentase缓冲液，并加水至总体积为114微升。然后，将Fragmentase储存液涡旋震荡三秒钟，取六微升加入主混合液中，最终总体积为120微升。
然后，将主混合液涡旋振荡3秒。接着，取5个反应管，每管加入20 µL主混合液，并将全部6个反应管在37 °C下孵育。5分钟后取出其中一个反应管，加入5 µL EDTA以终止反应。
每10分钟操作一次，直至收集完所有反应管。现在，从每个管中取12.5微升进行分析，相当于约0.5微克DNA，同时取等量未消化的DNA在琼脂糖凝胶上电泳。根据凝胶结果，确定将大部分弥散条带消化至约0.2千碱基所需的最短时间。
以此作为最长消化时间。接下来，按照预实验的方法进行实际的片段化操作，在包括5分钟在内的六个均匀间隔的时间点终止消化反应，并计算最长消化时间。消化完成后，收集这六个消化产物，并使用PCR纯化试剂盒或固相可逆固定化磁珠进行纯化。
将纯化的DNA溶解于约15微升EB缓冲液中。接下来的步骤包括修复片段化DNA的末端、添加腺苷酸突出端、连接测序接头，并将Y形接头转化为双链DNA。这些步骤在文本方案中均有详细说明，完成全部过程不应超过两天。
将测序接头连接至片段化的 DNA 并将 Y 形接头转化为双链 DNA 后，选择所需大小的片段。首先配制含有 TAE 缓冲液的 2% 琼脂糖凝胶，并小心加入溴化乙锭，使其终浓度为每毫升 500 纳克。制备足够数量的加样孔，用于所有样品以及两份 DNA 标准品，并在标准品两侧预留空置加样孔。
现在，向每份10微升的DNA洗脱液中加入8微升上样染料，并按1:1:4的比例将1 Kb Plus DNA标记物与6X上样染料和水混合。然后按以下顺序上样：DNA标记物、DNA洗脱液、另一个DNA标记物。上样完成后，在120伏电压下电泳60分钟。
随后，戴上安全眼镜和面部防护罩，短暂使用紫外光观察凝胶。检查DNA标准品，确认凝胶电泳是否已运行至足够距离，以便可在300至400碱基对之间切下三段凝胶。接下来，从每条泳道中切出300至400碱基对之间的条带，每次切割每条泳道时均需使用新的刀片。
尽可能少地切除凝胶，使每个凝胶切片体积理想情况下小于 100 微升，并将每个切片转移至独立的微量离心管中。接下来，根据文字方案从凝胶切片中提取 DNA。继续按照文字方案操作，从提取的 DNA 中富集测序接头修饰的片段。
然后，使用Bioanalyzer对纯化的DNA进行高质量分析，如果结果符合预期，则将其提交测序。慢病毒经改造可表达Dam-V5-lamin B1融合蛋白，并通过氨基酸荧光染色验证该融合蛋白与内源性lamin B1蛋白共定位。该慢病毒以及表达Dam-V5融合蛋白的对照慢病毒均用于感染小鼠C2C12成肌细胞。
按照所述方法收集并扩增腺嘌呤甲基化片段，随后进行测序。然后构建染色体1的基因组NL相互作用图谱。其中一条轨迹显示log2 RPKM比值。
另一条轨迹以黑色显示与核纤层蛋白相关的结构域。这些区域与对照组的Dam相比，与Dam-Lamin B1的关联显著更强。一旦掌握，该技术若操作得当，可在两周内完成。
观看本视频后，您应充分了解如何通过高通量测序结合DamID技术检测与目标蛋白相关的DNA序列。请注意，使用溴化乙锭和紫外灯时可能存在极高危险性，因此在操作过程中务必采取预防措施，例如在凝胶冷却后再加入溴化乙锭，并始终佩戴护目镜和面罩进行防护。
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概述
本文介绍了一种将DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DamID）与高通量测序相结合的新型检测方法（DamID-seq）。该改进方法在分析动物细胞中与蛋白质相关的基因组DNA序列时，具有更高的分辨率和更宽的动态范围。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 分子生物学
- 细胞生物学
背景
- DamID-seq 可用于鉴定与特定蛋白质相关的基因组区域。
- 该技术优于使用DNA微阵列的原始DamID方法。
- 高通量测序有助于与其他类型的测序数据进行交叉分析。
- 在哺乳动物细胞中，理解细胞核结构和转录调控至关重要。
研究目的
- 检测与目标蛋白相关的基因组DNA序列。
- 提高动物细胞基因组分析的分辨率。
- 实现DamID-seq数据与其他高通量测序数据集的整合。
使用的方法
- 将目的基因克隆至 DamID 载体中。
- 制备表达 DamV5 POY 和 V5-Dam 的慢病毒储备液。
- 利用慢病毒表达系统进行基因递送。
- 进行高通量测序以分析数据。
主要结果
- 该方法相较于以往技术具有更高的分辨率。
- 它能够识别与核蛋白相关的基因组区域。
- 与其他测序数据的交叉分析有助于深入理解转录因子。
- 由实验技术人员演示该操作流程，展示了其实际应用。
结论
- 这种改进的 DamID-seq 方法是基因组分析的有力工具。
- 它有助于深入理解细胞核的结构组织和基因调控机制。
- 该技术与其他数据集的整合为科学研究开辟了新的途径。
常见问题
行业重要性概述
DamID-seq 提供了一种高分辨率、全基因组范围的蛋白质-DNA 相互作用图谱绘制方法，能够精确表征哺乳动物细胞中的核结构组织和转录调控。该技术通过将腺嘌呤甲基化标记与高通量测序相结合，克服了依赖微阵列的 DamID 技术的局限性，并支持与其他功能基因组学数据集（如 ChIP-seq 和 RNA-seq）进行交叉分析。这一能力通过提供定量、可重复的相互作用图谱，推动基于假设的药物靶点筛选，从而在早期发现阶段增强靶点验证和机制层面的风险降低。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过高精度和高灵敏度地绘制全基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用图谱，能够验证治疗假设。
- 操作价值：提供一种可重复的、基于扩增的检测方法，无需依赖抗体，适用于多种哺乳动物细胞系统。
- 预测价值：生成定量的相互作用谱，支持靶点置信度评估和信号通路解析。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成适用于在不同实验条件下进行标准化和比较的全基因组腺嘌呤甲基化片段数据。
- 操作价值：输出与标准生物信息学流程兼容的短读长测序数据，可用于峰识别和差异分析。
- 可扩展性：支持多重样本处理，并可与其他基于测序的检测方法整合，实现协调的工作流程。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将蛋白质-DNA 相互作用图谱与表观遗传学和转录组数据集进行比较，评估其功能相关性。
- 操作价值：支持对核纤层相关结构域（LADs）及其在疾病模型中的动态变化进行纵向研究。
- 转化连续性：通过将结合事件与基因表达和染色质状态关联，促进基于生物标志物的靶点验证。
流程与工作流整合
DamID-seq 位于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的发现连续体之中，可提供机制性见解，为化合物筛选和临床前验证提供依据。该方法生成全基因组范围的结合数据，可与表型筛选结果整合，从而优先选择具有强有力机制依据的靶点。
- 发现生物学：通过鉴定细胞核蛋白、转录因子或染色质调控因子的直接基因组靶点，支持假设验证。
- 筛选：提供定量且标准化的读数（例如，log2 RPKM 比值），可用于比较不同实验条件并验证筛选结果中的阳性信号。
- 分析：生成高分辨率的相互作用图谱，适用于峰区检测、基序富集分析，并可与 RNA-seq 或 ATAC-seq 数据进行关联分析。
- 转化研究：在有辅助数据支持的情况下，可将蛋白质结合位点与疾病相关基因组变异或表达数量性状位点（eQTLs）进行比对分析。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在多个靶点和细胞系中绘制核蛋白相互作用图谱，减少重复的实验开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供蛋白质-DNA相互作用的直接、全基因组证据，提高对靶点机制预测的可信度。
- 操作价值：通过基于扩增的检测方法标准化相互作用图谱绘制，减少与基于抗体方法相关的变异性。
- 战略价值：通过降低靶点验证和通路分析中的生物学不确定性，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于可重复、定量的相互作用谱型，实现对靶点的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆技术，以构建 DamID 融合表达载体和慢病毒载体。
- 依赖于慢病毒生产平台、高通量测序技术以及用于片段分析和峰识别的生物信息学工具。
- 需要对感染条件、DNA片段化参数和片段大小选择进行标准化，以确保结果的可重复性。
- 需优化酶切时间及片段大小选择（例如 300–400 bp），以保证文库构建的效率。
- 受限于基因组中 GATC 位点的分布密度，可能影响在 AT 富集或 GC 极端区域的分辨率。
