Name: 日本鹌鹑胚胎的卵黄囊膜主内胚上皮细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习日本鹌鹑卵黄囊膜内胚上皮细胞的原代培养技术，用于研究禽类胚胎发育中的脂质利用与营养转运机制。该方法为理解胚胎营养代谢提供了可靠的体外模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本方案的开发特别得到了中国台湾国立台湾大学“迈向顶尖大学计划”（项目编号：104R350144）以及中国台湾科技部（项目编号：MOST 104-2313-B-002-039-MY3）的资助。我们特别感谢国立台湾大学生物技术中心为本研究提供了动物饲养室和实验室空间。

注意：本实验步骤改编自 Bauer et al. 2013 年和 Nakazawa et al. 2011 年建立的鸡胚模型培养方案2,9。
1. 从日本鹌鹑中获取健康的孵化第5天胚胎
<ol>
	<li>将1只雄性与3只雌性性成熟的日本鹌鹑共同置于同一笼中饲养，提供饲料和饮水 随意摄取将动物房的光照调节为14小时光照和10小时黑暗。</li>
	<li>每天下午用塑料袋收集受精卵，并置于16 °C冰箱中以减缓胚胎发育速度。</li>
	<li>在两周内收集到足够数量的卵后，将受精卵置于通风良好的37 °C培养箱中孵育五天。</li>
</ol>
2. 准备基础培养基和洗涤溶液
<ol>
	<li>使用 DMEM/F-12 培养基（调节至 pH 7.2）作为生长培养基，并添加 10% 新生牛血清（NBCS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（PSA；青霉素，105 单位/L；链霉素，100 mg/L；两性霉素 B，0.25 mg/L）。</li>
	<li>配制 10 倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）用于储存；使用 1 倍 PBS 溶液（含 NaCl，137.93 mM；KCl，2.667 mM；KH2PO4，1.471 mM；Na2HPO4-7H2O，8.06 mM；调节至 pH 7.2）在分离内胚层与卵黄及卵白时洗涤并润湿卵黄囊膜。</li>
	<li>使用 DMEM 培养基（调节至 pH 7.2）重悬内胚层沉淀。</li>
</ol>
3. 从日本鹌鹑卵黄囊膜中收集原代 EECs
<ol>
	<li>将收集的鸡蛋在 5 天内进行孵育（步骤 1.3）。使用验卵灯检查鸡蛋，以确认胚胎发育正常。 
	注意：在胚胎发育第 5 天，卵黄囊中胚层的边界非常清晰，且三个胚胎层之间的连接较松散，因此易于获取内胚层。仅使用表现出正常毛细血管循环发育的鸡蛋进行卵黄囊中胚层（YSM）的收集。</li>
	<li>用新鲜水和 75% 乙醇小心清洁蛋壳。用剪刀从气室位置打开蛋壳，用镊子轻轻剥离并完整取出卵黄囊中胚层（YSM），放入盛有 37°C 1× PBS 的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>使用剪刀去除胚胎、卵黄和蛋白，并用 1× PBS 轻柔清洗卵黄囊中胚层（YSM）三次，然后将卵黄囊中胚层（YSM）置于 PBS 溶液中，放入 10 cm 培养皿内。</li>
	<li>使用镊子和剪刀从卵黄囊中胚层（YSM）上去除外胚层。使用两把镊子，一把牢固夹住内胚层细胞层，另一把夹住毛细血管中胚层。</li>
	<li>在解剖显微镜下，从靠近胚胎的一侧开始，沿中胚层边缘将内胚层轻轻撕离并分离。用移液器收集淡黄色的内胚层，放入 50 ml 离心管中，并转移至含有 15 ml 培养基的 37 °C 水浴中，直至完成全部组织收集。</li>
</ol>
4. 胶原酶消化法消化内胚层切片
<ol>
	<li>将 6.5 单位的 IV 型胶原酶新鲜溶解于 10 ml DMEM 中。</li>
	<li>在室温下以 130 × g 离心 50 ml 离心管（3.4）3 分钟。吸除上清液，并用移液器将所有内胚层组织转移至一个 6 cm 培养皿中。向该培养皿中加入 1 ml 胶原酶溶液。</li>
	<li>用一对弯头剪刀将来自 2 枚鹌鹑胚胎的内胚层组织切成碎片，使每片大小约为 2 至 3 mm。使用滴管将所有组织碎片连同 9 ml 新鲜胶原酶溶液一起收集至一个 50 ml 离心管中。</li>
	<li>在 37 °C、175 rpm 摇动水浴中用胶原酶消化组织 30 分钟。此部分消化步骤旨在促进外植体细胞的增殖。</li>
	<li>在室温下以 130 × g 离心 3 分钟，用移液器轻柔地移除上清液。用 20 ml DMEM 重悬沉淀进行洗涤，然后在 130 × g 条件下离心 3 分钟后再次移除上清液。</li>
	<li>用 12 ml 生长培养基（DMEM/F12 加 10% NBCS 和 1% PSA）重悬沉淀，并轻轻且均匀地接种至 24 孔板中（每孔加入 500 µl 细胞悬液）。</li>
	<li>将组织外植体在 37 °C、5% CO2 空气氛围中孵育 2 天，以允许细胞从组织中迁移并增殖。</li>
	<li>继续将细胞孵育 2 天，并按照细胞活力检测方案进行细胞活力表征。15 
	注意：活细胞在其胞质溶胶内维持还原性环境。刃天青（resazurin）是该检测中的活性成分，为一种无毒且可穿透细胞的蓝色化合物，几乎无荧光。当添加至细胞培养物中时，刃天青在胞质溶胶中被线粒体酶还原为试卤灵（resorufin）。试卤灵呈红色且具有强荧光。活细胞持续将刃天青转化为试卤灵，从而增加细胞周围培养基的整体荧光强度和颜色变化。</li>
	<li>按照所述方法进行内胚层上皮细胞总 RNA 提取、逆转录及标志基因 mRNA 表达的定量实时 PCR 分析。16,17
	<ol>
		<li>采用逆转录 PCR 检测 SOAT1 mRNA（正向引物：5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3'；反向引物：5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'；PCR 产物 = 168 bp），作为 EEC 细胞的特异性标志物。以 β-Actin mRNA（正向引物：5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'；反向引物：5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'；PCR 产物 = 151 bp）作为看家基因和内参对照。</li>
		<li>采用凝胶电泳检测 RT-qPCR 产物的大小。制备 1% 琼脂糖凝胶，将 10 μl qPCR 产物与 2 μl 上样染料混合。取 10 μl 混合液加入 1% 琼脂糖凝胶的每个加样孔中，在 100 V 条件下电泳运行 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

不存在竞争性经济利益或其他利益冲突。我们未从任何私营公司获得资金支持。

由于先前的培养体系成功率有限，因此需要一种更优的培养体系。日本鹌鹑卵黄囊中胚层内胚层在体外组织块培养中需要使用蛋白酶（如胶原酶）处理，以松解细胞间连接，从而获得更好的生长效果。我们的数据显示，在接种培养2天后，经部分消化处理所得的细胞数量多于未消化组织培养（图1）。因此，部分蛋白酶消化是提高YSM细胞得率的关键步骤。
当前培养方案中的关键改进步骤是部分蛋白酶消化。该处理显著提高了细胞产量以及成功获得活的子宫上皮细胞（EECs）的比率。消化时间非常关键，因为过度消化会导致细胞从组织中分离，从而使细胞无法贴附于培养板；而消化不足则会导致从组织外植体中获得的细胞数量减少。我们发现，在上述条件下消化30至40分钟最为理想。
目前的方案需要较高的技术训练才能获得卵黄囊内皮细胞（EECs）。收集EECs的时间点受到限制，例如，我们仅在胚胎发育第5天（embryonic day 5）进行收集。原因是随着鸟类胚胎的发育，卵黄囊膜各层之间的连接变得更加复杂，从而降低了成功收集EECs的几率。该方案可用于获取早期...

禽类胚胎的主要营养来源是卵黄，其成分为33%的脂质、17%的蛋白质和1%的灰分。1 在胚胎发育过程中，卵黄囊膜（YSM）从胚胎腹腔内开始生长，并逐渐覆盖卵黄表面。自胚胎发育第2天起，YSM中与脂质代谢和血管生成相关的基因表达逐渐增强，同时YSM缓慢形成绒毛样突起。8,9 这些突起可增加对卵黄营养物质的吸收，以支持胚胎发育。YSM是一种胚外组织，包含内胚层、中胚层和外胚层三个胚层。14 卵黄囊外胚层面向蛋清，并与卵黄膜相连，轻柔地覆盖在卵黄囊表面。内胚层上皮细胞则直接面向卵黄，作为营养物质利用的门户。6 随着YSM的扩展，内胚层上皮细胞（EECs）可根据形态和功能分为两个区域：卵黄区（area vitelline）和血管区（area vasculosa）。7
卵黄区由内胚层细胞组成，位于远离胚胎的位置；血管区由中胚层细胞组成，并覆盖有分化后的卵黄囊内胚层上皮细胞（EEC），其上分布有血管和结缔组织。至胚胎发育第5天，卵黄已完全被卵黄囊外胚层和内胚层覆盖，血管区域也迅速扩展。卵黄囊外胚层（YSM）吸收、重组并将脂质（以卵黄来源的极低密度脂蛋白形式）和蛋白质释放到胚胎循环系统中9, 2。因此，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系，用于研究鸟类胚胎发育过程中卵黄囊外胚层（YSM）脂质利用的机制。
甘油三酯、卵磷脂、磷脂和胆固醇酯（CE）等脂质是禽类胚胎的主要能量来源。在发育早期，卵黄脂质中仅含有1.3%的CE，至禽类胚胎发育中期则上升至10-15%3, 11。胆固醇酯由禽类胚胎卵黄囊膜中的固醇O-酰基转移酶1（SOAT1）催化胆固醇合成4。
胆固醇的储存形式是胆固醇酯（CE），CE由脂蛋白携带，并通过循环系统运输至各组织13。在孵化前一周，禽类胚胎迅速生长，此阶段约有68%的卵黄残留脂质被吸收10。通过体外胚胎绒毛尿囊膜培养（EEC）研究模型，可阐明卵黄脂质利用的机制。为此研究目标，已建立鸡胚EEC培养方案2, 9。然而，由于组织外植体的成功率较低，亟需改进EEC细胞培养方法，以研究特定酶和蛋白质在禽类胚胎发育过程中介导营养物质利用的功能。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>用于洗涤 EECs 沉淀</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>作为培养 EECs 的基础培养基</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>作为培养 EECs 时的补充血清</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>用于减轻可能发生的感染&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&amp;nbsp;胶原酶是一种蛋白酶，特异性作用于 Pro-X-Gly-Pro 序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键。用于从原代组织中解离细胞。</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>FALCON&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td><td>REF-353047</td><td>用于 EECs 的贴壁与扩展</td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯离心管</td><td>Corning&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; CentriStar&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>430829</td><td>用于膜组织和酶消化过程的转运</td></tr><tr><td>带盖 50 ml 锥底管</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>用于膜组织和酶消化过程的转运</td></tr><tr><td>往复式摇床</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>用于促进膜组织的酶消化效果</td></tr></tbody></table>

日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

我们建立了一种内胚层上皮细胞培养模型（EEC），用于研究特定酶和蛋白质在鸟类胚胎发育过程中介导营养物质利用的功能。将受精的日本鹌鹑卵在37 °C条件下孵育5天后，收集卵黄囊膜（YSM）以建立EEC培养体系。从YSM中分离出胚胎内胚层，将膜切成2–3 mm大小的组织块，经胶原酶部分消化后接种于24孔培养板中。EECs从组织块中增殖迁移而出，可用于细胞培养研究。我们发现，EECs具有YSM的典型特征 体内例如脂滴的积累、固醇O-酰基转移酶和脂蛋白脂肪酶的表达。部分消化处理显著提高了肠上皮细胞（EEC）培养的成功率。利用所获得的EECs，我们证实SOAT1的表达受cAMP依赖性蛋白激酶A相关通路的调控。该原代日本鹌鹑EEC培养体系是研究胚胎期脂质转运以及阐明在鸟类胚胎发育过程中卵黄囊膜（YSM）介导营养物质利用相关基因功能的有力工具。

为了建立一个稳定且具有实用价值的细胞模型，我们需要延长并稳定禽类EECs的增殖速率和功能表现。我们比较了将内胚层直接孵育（不进行酶消化）与使用蛋白水解酶（如胶原酶或胶原酶联合0.6 U分散酶）对内胚层进行部分消化的方法。分散酶是一种氨基内肽酶，可水解非极性氨基酸残基的N端肽键。与未消化组相比，蛋白酶消化处理显著提高了细胞增殖能力（图1）；但在孵育5天后，两种酶处理之间的细胞生长情况无明显差异（图2）。然而，胶原酶处理组获得了更理想的生长曲线，显示EECs可持续稳定增殖6–9天（图2）。因此，采用部分胶原酶消化法可有效促进来自离体组织外植块的EECs生长，推荐用于获取数量充足且功能完整的EECs。
培养4天后，经甲醛固定和油红O染色，可见子宫内膜上皮细胞（EECs）呈现出类似脂肪细胞的形态（图3），表明培养的细胞具有正确...

为了研究鸟类胚胎发育后期卵黄囊膜中脂质利用的机制，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系。

我们建立了一种内胚层上皮细胞培养模型（EEC），用于研究特定酶和蛋白质在介导营养物质吸收中的功能……

本项离体组织外植实验的主要目标是改进禽类内胚层上皮细胞的获取方法，并拓展其应用范围，以研究酶和蛋白质在介导禽类胚胎营养利用中的功能。该方法有助于解答有关禽类胚胎发生过程中脂质利用的关键问题，例如在发育后期卵黄中的脂质如何被包装并从卵黄转运至胚胎。该技术的主要优势在于，我们能够成功地从日本鹌鹑卵黄囊膜中分离出具有功能活性的内胚层上皮细胞，这些细胞可作为研究禽类胚胎发育的模型系统。首先，按照文本方案中的描述配制 10x PBS 溶液。将该储备溶液按 1:10 稀释，制备 1x PBS，用于内胚层解剖过程中卵黄囊膜的洗涤。为准备内胚层上皮细胞（即 EECs）的生长培养基，首先在 DMEM/F-12 中添加 10% 新生牛血清和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素溶液。随后，将pH计的探针插入预先配制的DMEM中，逐滴加入3 N HCl，直至培养基的pH值调整至7.2。收集约二十多枚受精的鹌鹑蛋后，将其垂直放入蛋盒中，使较宽且未变细的一端（即气室所在端）朝上。然后，将鸡蛋转移至设定为37摄氏度且通风良好的孵化箱中。孵化五天后，使用验卵灯检查鸡蛋。如果胚胎发育正常，应在气室下方观察到毛细血管形成的环形结构。选择一枚表现出正常毛细血管发育的鸡蛋，用清水和75%乙醇清洁蛋壳。接着，使用剪刀从气室位置打开蛋壳。用镊子辅助，轻柔地将蛋内容物倒入一个空的10 cm培养皿中。然后，使用剪刀将胚胎、卵黄及任何蛋白从卵黄囊膜（简称YSM）上分离下来。分离后，用1×PBS清洗YSM三次，随后将其转移至一个新的含有PBS的10 cm培养皿中。之后，将培养皿置于解剖显微镜下。然后，用剪刀去除残留的蛋清，这些蛋清紧邻卵黄囊膜（YSM）的外胚层外侧。接着，用镊子从卵黄囊膜上中胚层的边缘处轻轻提起透明的外胚层及带有红色毛细血管结构的中胚层。随后，轻柔地将外胚层和中胚层一同剥离，以分离出下方的内胚层细胞层。然后，用一把镊子牢固地夹住膜的黄色内胚层细胞层，用另一把镊子夹住毛细血管中胚层，并从中胚层与内胚层的连接边缘处将中胚层拉开。使用剪刀剪除残留的黄色内胚层组织，并将其转移至盛有生长培养基的6厘米培养皿中。使用滴管将六厘米培养皿中呈淡黄色的内胚层在卵黄囊膜收集后转移至15 mL离心管中，并加入15 mL预先配制的生长培养基。将离心管置于37摄氏度水浴中，直至完成所有组织收集。首先将6.5单位的IV型胶原酶溶解于10 mL DMEM中。接下来，在室温下以130 ×g离心含有内胚层的离心管3分钟。离心后，吸除培养基，并使用滴管将所有内胚层样品转移至一个六厘米的培养皿中。然后，向培养皿中加入1毫升胶原蛋白溶液。使用弯头剪刀将从四只鹌鹑胚胎中收集的内胚层组织剪切成约两到三毫米大小的片状。随后，将这些组织片收集到一个50 mL离心管中，并加入9 mL已预置于该离心管内的新鲜胶原酶溶液。为促进外植体阶段的细胞增殖，将离心管置于设定为37°C的摇动水浴中。 然后，将锥形管孵育30分钟，以利用胶原酶对组织进行部分消化。部分蛋白酶消化是提高卵黄囊膜内胚层细胞收集效率的最关键步骤。我们的数据显示，通过胶原酶消化处理，细胞培养的成功率和细胞增殖能力均有显著提升。胶原酶消化后，在室温下以130 × g离心组织3分钟，然后用移液器弃去上清液。通过将沉淀重悬于20 mL DMEM中进行洗涤。按前述方法再次离心，随后弃去上清液，并将沉淀重悬于12 mL培养基中。然后，将500微升悬浮液轻柔地加入24孔板的每个孔中。将内胚层外植体置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育两天。在此期间，可见细胞从组织中增殖迁移而出。接着，将细胞继续培养两天。然后进行细胞活力检测，并使用酶标仪读取结果。之后，进行RT-qPCR以检测EEC中目标标志物的表达水平，并按照文本方案中的描述，通过凝胶电泳分析RT-qPCR产物的大小。与未经处理的组织块相比，经胶原酶部分消化的组织块表现出显著增强的细胞增殖，如图中所示，并通过配对t检验确定，表明该培养体系成功建立。为评估其他酶的作用，对经胶原酶和分散酶处理以及仅用胶原酶处理的组织进行了细胞活力检测。在培养的前五天内，两种条件下的细胞生长情况相似。然而，在第6至第9天期间，仅有经胶原酶处理的EECs持续稳定增殖，表明该酶的部分消化作用可促进细胞生长，应优先采用。培养的EECs在观察时显示出类似脂肪细胞的特征，即具有较大的圆形脂滴，如图所示。此类细胞的油红O染色亦呈阳性，该染色通常用于鉴定脂肪细胞。这些形态学数据得到了实时定量 PCR 的支持，结果显示培养的 EEC 表达高水平的 SOAT1，这是一种将胆固醇合成为胆固醇酯的蛋白质。这进一步表明，培养的 EEC 具备脂肪细胞应有的正确生理特征。重要的是，当 EEC 暴露于可提高环磷酸腺苷（cAMP）水平的 IBMX 和佛司可林（Forskolin）并培养 24 小时后，这两种处理均刺激了 SOAT1 的表达，提示了 YSM 中 SOAT1 调控和脂质利用的可能机制。一旦掌握，该技术可在约四小时内完成，在此期间至少可收集三个样本。按照本方案，可进一步开展SOAT1或其他酶活性检测等方法，并进行类似的视觉验证。此类检测有助于回答更多问题，例如特定蛋白质和宏量营养素在胚胎发育后期的作用机制。该技术建立后，为研究胚胎营养利用领域的科研人员探索禽类胚胎模型中营养物质的利用与转运可能机制提供了新的途径。观看本视频后，您应能够掌握如何从禽类胚胎中收集内胚层组织，并了解如何培养禽类胚胎内胚层细胞（EECs），以利用禽类模型研究胚胎营养物质的转运与利用。

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

日本鹌鹑胚胎的卵黄囊膜主内胚上皮细胞培养

体外培养早期鸡胚的方法（新培养法）

本文将提供一种分离和培养鹌鹑或鸡HH14-期心脏瓣膜内皮细胞以及HH25期瓣膜垫间充质细胞的方法。...

禽类胚胎瓣膜前体细胞的分离与培养

本文描述了一种用于分析鹌鹑-鸡嵌合胚胎中鸟类神经嵴细胞迁移及其最终命运的研究方法。该方法是一种简单直接的技术，可用于追踪神经嵴细胞在迁移和分化过程中的动态，而在未经操作的鸡胚胎中，这些细胞通常难以被区分。...

通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

本文结合新型技术，对经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统进行了更新，以研究器官形成。 体外 和 在卵内 实验步骤...

探索鸟类模型中器官形成的早期和晚期阶段的两步法：胸腺与甲状旁腺器官发生范式

本文介绍了一种用于培养鸡胚胎器官的器官型培养方案 体外...

研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离纯胚胎组织的方法，这些组织可被组合以形成体外嵌合器官。...

以胸腺为例的胚胎组织分离及鹌鹑-鸡嵌合器官的构建

本方案描述了从人羊膜的不同解剖区域分离上皮细胞的方法，旨在确定这些细胞的异质性及其功能特性，以期应用于临床和病理生理学模型。...

人羊膜不同解剖区域上皮细胞的体外培养

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）是多种研究领域的有用且适用的工具。一种特殊的日本鹌鹑（Japanese quail）CAM ex ovo...

鹌鹑绒毛尿囊膜——光动力诊断与治疗的工具

该多功能实验方案描述了通过切除鸡胚头部神经褶来分离迁移前神经嵴细胞（NCCs）的方法。将神经褶外植体接种并培养后，迁移期的神经嵴细胞会从中迁移而出，从而可在简化的二维环境中对细胞形态和迁移行为进行评估。...

鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

学习日本鹌鹑卵黄囊膜内胚上皮细胞的原代培养技术，用于研究禽类胚胎发育中的脂质利用与营养转运机制。该方法为理解胚胎营养代谢提供了可靠的体外模型。

日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

探索更多视频