日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

本项离体组织外植实验的主要目标是改进禽类内胚层上皮细胞的获取方法，并拓展其应用范围，以研究酶和蛋白质在介导禽类胚胎营养利用中的功能。该方法有助于解答有关禽类胚胎发生过程中脂质利用的关键问题，例如在发育后期卵黄中的脂质如何被包装并从卵黄转运至胚胎。该技术的主要优势在于，我们能够成功地从日本鹌鹑卵黄囊膜中分离出具有功能活性的内胚层上皮细胞，这些细胞可作为研究禽类胚胎发育的模型系统。

首先，按照文本方案中的描述配制 10x PBS 溶液。将该储备溶液按 1:10 稀释，制备 1x PBS，用于内胚层解剖过程中卵黄囊膜的洗涤。为准备内胚层上皮细胞（即 EECs）的生长培养基，首先在 DMEM/F-12 中添加 10% 新生牛血清和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素溶液。

随后，将pH计的探针插入预先配制的DMEM中，逐滴加入3 N HCl，直至培养基的pH值调整至7.2。收集约二十多枚受精的鹌鹑蛋后，将其垂直放入蛋盒中，使较宽且未变细的一端（即气室所在端）朝上。

然后，将鸡蛋转移至设定为37摄氏度且通风良好的孵化箱中。孵化五天后，使用验卵灯检查鸡蛋。如果胚胎发育正常，应在气室下方观察到毛细血管形成的环形结构。

选择一枚表现出正常毛细血管发育的鸡蛋，用清水和75%乙醇清洁蛋壳。接着，使用剪刀从气室位置打开蛋壳。用镊子辅助，轻柔地将蛋内容物倒入一个空的10 cm培养皿中。

然后，使用剪刀将胚胎、卵黄及任何蛋白从卵黄囊膜（简称YSM）上分离下来。分离后，用1×PBS清洗YSM三次，随后将其转移至一个新的含有PBS的10 cm培养皿中。之后，将培养皿置于解剖显微镜下。

然后，用剪刀去除残留的蛋清，这些蛋清紧邻卵黄囊膜（YSM）的外胚层外侧。接着，用镊子从卵黄囊膜上中胚层的边缘处轻轻提起透明的外胚层及带有红色毛细血管结构的中胚层。随后，轻柔地将外胚层和中胚层一同剥离，以分离出下方的内胚层细胞层。

然后，用一把镊子牢固地夹住膜的黄色内胚层细胞层，用另一把镊子夹住毛细血管中胚层，并从中胚层与内胚层的连接边缘处将中胚层拉开。使用剪刀剪除残留的黄色内胚层组织，并将其转移至盛有生长培养基的6厘米培养皿中。

使用滴管将六厘米培养皿中呈淡黄色的内胚层在卵黄囊膜收集后转移至15 mL离心管中，并加入15 mL预先配制的生长培养基。将离心管置于37摄氏度水浴中，直至完成所有组织收集。首先将6.5单位的IV型胶原酶溶解于10 mL DMEM中。

接下来，在室温下以130 ×g离心含有内胚层的离心管3分钟。离心后，吸除培养基，并使用滴管将所有内胚层样品转移至一个六厘米的培养皿中。然后，向培养皿中加入1毫升胶原蛋白溶液。

使用弯头剪刀将从四只鹌鹑胚胎中收集的内胚层组织剪切成约两到三毫米大小的片状。随后，将这些组织片收集到一个50 mL离心管中，并加入9 mL已预置于该离心管内的新鲜胶原酶溶液。为促进外植体阶段的细胞增殖，将离心管置于设定为37°C的摇动水浴中。

然后，将锥形管孵育30分钟，以利用胶原酶对组织进行部分消化。部分蛋白酶消化是提高卵黄囊膜内胚层细胞收集效率的最关键步骤。我们的数据显示，通过胶原酶消化处理，细胞培养的成功率和细胞增殖能力均有显著提升。

胶原酶消化后，在室温下以130 × g离心组织3分钟，然后用移液器弃去上清液。通过将沉淀重悬于20 mL DMEM中进行洗涤。按前述方法再次离心，随后弃去上清液，并将沉淀重悬于12 mL培养基中。

然后，将500微升悬浮液轻柔地加入24孔板的每个孔中。将内胚层外植体置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育两天。在此期间，可见细胞从组织中增殖迁移而出。

接着，将细胞继续培养两天。然后进行细胞活力检测，并使用酶标仪读取结果。之后，进行RT-qPCR以检测EEC中目标标志物的表达水平，并按照文本方案中的描述，通过凝胶电泳分析RT-qPCR产物的大小。

与未经处理的组织块相比，经胶原酶部分消化的组织块表现出显著增强的细胞增殖，如图中所示，并通过配对t检验确定，表明该培养体系成功建立。为评估其他酶的作用，对经胶原酶和分散酶处理以及仅用胶原酶处理的组织进行了细胞活力检测。在培养的前五天内，两种条件下的细胞生长情况相似。

然而，在第6至第9天期间，仅有经胶原酶处理的EECs持续稳定增殖，表明该酶的部分消化作用可促进细胞生长，应优先采用。培养的EECs在观察时显示出类似脂肪细胞的特征，即具有较大的圆形脂滴，如图所示。此类细胞的油红O染色亦呈阳性，该染色通常用于鉴定脂肪细胞。

这些形态学数据得到了实时定量 PCR 的支持，结果显示培养的 EEC 表达高水平的 SOAT1，这是一种将胆固醇合成为胆固醇酯的蛋白质。这进一步表明，培养的 EEC 具备脂肪细胞应有的正确生理特征。重要的是，当 EEC 暴露于可提高环磷酸腺苷（cAMP）水平的 IBMX 和佛司可林（Forskolin）并培养 24 小时后，这两种处理均刺激了 SOAT1 的表达，提示了 YSM 中 SOAT1 调控和脂质利用的可能机制。

一旦掌握，该技术可在约四小时内完成，在此期间至少可收集三个样本。按照本方案，可进一步开展SOAT1或其他酶活性检测等方法，并进行类似的视觉验证。此类检测有助于回答更多问题，例如特定蛋白质和宏量营养素在胚胎发育后期的作用机制。

该技术建立后，为研究胚胎营养利用领域的科研人员探索禽类胚胎模型中营养物质的利用与转运可能机制提供了新的途径。观看本视频后，您应能够掌握如何从禽类胚胎中收集内胚层组织，并了解如何培养禽类胚胎内胚层细胞（EECs），以利用禽类模型研究胚胎营养物质的转运与利用。