利用酶解法和梯度分离法从小鼠皮肤中分离浸润性白细胞
2016年1月25日
本方案描述了在营养丰富的培养基中对小鼠皮肤进行酶消化，随后通过梯度分离来纯化白细胞。由此获得的细胞可用于多种下游应用。该方法是一种高效、经济且改进的替代方案，可取代组织解离仪以及更剧烈的胰蛋白酶和中性蛋白酶介导的组织消化方案。
本实验的总体目标是通过酶消化和密度梯度分离方法分离皮肤浸润性白细胞。该方法可应用于多种小鼠皮肤疾病模型（包括特应性皮炎）中细胞和分子机制的研究。尽管该方法主要用于研究皮肤浸润性白细胞的生物学特性，也可用于其他组织常驻细胞群体的分析。
通常，初次接触该方法的研究人员在皮肤采集过程中会遇到困难，其中包括完全去除多余的脂肪和结缔组织。该方法的可视化演示至关重要，因为皮肤采集和密度梯度操作较难掌握，需要精确性和反复练习。在处理后的适当时间点，使用10厘米的手术剪，小心地从一只8至12周龄的成年雌性ND4 Swiss-Webster小鼠的剃毛侧腹皮肤上切除一块25 mm × 25 mm的区域。
使用洁净锋利的手术刀刮除皮肤上多余的脂肪和结缔组织，然后将皮肤转移至含有10毫升室温HBSS（添加EDTA、HEPES和FBS）的50毫升锥形管中，在干燥、无气体环境的37°C培养箱中于旋转平台上预消化30分钟。孵育结束后，剧烈涡旋震荡管子10秒，并通过70微米细胞筛过滤组织悬液。接着，用镊子将筛网上的 flank 皮肤组织块转移至另一含有10毫升新鲜室温HBSS培养基（添加EDTA、HEPES和FBS）的50毫升离心管中，再使用12.5厘米长的手术解剖剪将每块 flank 皮肤组织剪碎，使组织碎片的平均尺寸约为2.2 × 2.2毫米。
当所有组织块均被剪碎后，将离心管放回旋转板，继续孵育 30 分钟。孵育结束时，剧烈涡旋振荡离心管 10 秒，然后将内容物通过 70 微米细胞筛过滤。将剩余的 flank 皮肤组织块收集到一个新的 50 毫升离心管中，管内含有 10 毫升添加了 0.7 毫克/毫升 Collagenase D 的 HBSS，然后将离心管再次放回旋转板，继续孵育 30 分钟。
再次涡旋震荡10秒后，将离心管中的内容物再次过滤，此次弃去滤网上的残渣，然后向离心管中加入最多50毫升的HBSS、EDTA、HEPES、FBS，离心收集细胞并倾去上清液。取3毫升室温、密度为67%的PBS密度梯度离心液加入新的15毫升锥形管中，再将细胞沉淀重悬于5毫升室温、含酚红的44% HBSS密度梯度离心液中。将移液器调至最低速度，将移液枪头置于管壁一侧，轻轻将细胞液层加至67%密度梯度离心液的上方。
进行密度梯度操作时，应注意避免产生气泡，并尽量减少对梯度界面的扰动。离心结束后，使用5 mL移液管轻柔吸取位于界面处的细胞，从而分离细胞。由于梯度的轻柔铺层以及界面的小心吸取是关键步骤，因此在使用目标实验细胞进行操作前，建议先用小鼠脾细胞悬液练习密度梯度离心介质的铺层及界面去除操作。
最后，在含有 FBS 的预冷 PBS 中，于 15 毫升锥形管中洗涤收集的细胞，并通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量。胶原酶 D 消化不影响 CD4 和 CD8-α 的表面表达，因为无论是否进行酶消化，检测到的 CD4 阳性细胞和 CD8-α 阳性细胞数量相同。此外，胶原酶 D 消化对 CD4 阳性 T 细胞表面 T 细胞活化标志物 CD44 和 CD62L 的表达密度无影响。
经过梯度分离后，每平方毫米 flank 组织可从氧化唑酮（Oxazolone）或 Ox 激发的小鼠中分离出约 250 个有活力的免疫细胞，而此前经 Ox 致敏的对照溶剂激发小鼠中，每平方毫米组织仅能分离出 4 个有活力的免疫细胞。在 Ox 激发小鼠中，95% 的低前向散射和低侧向散射的单细胞为活的 CD45 阳性细胞；在对照溶剂激发小鼠中，此类细胞占 71%。这相当于在连续三天每日给予 Ox 激发后，flank 皮肤中浸润的 CD45 阳性免疫细胞群体增加了约 67 倍。事实上，Ox 激发导致 T 细胞和中性粒细胞显著浸润至 flank 皮肤。在 Ox 处理动物中，单个活 CD45 阳性细胞中有 42% 为明显的 Gr-1 阳性中性粒细胞，约 84% 为 CD3 阳性 T 细胞，且表达 CD8-alpha 或 CD4，与对照的乙醇处理动物相比存在明显差异。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约三小时内完成。
进行此操作时，重要的是要小心处理密度梯度。切记在执行此操作时始终使用室温的密度梯度离心介质。完成此操作后，可进一步采用流式细胞术分析、细胞分选、细胞转移或体外细胞培养等其他方法，以评估皮肤浸润性白细胞的表型和功能。
观看本视频后，您应充分了解如何通过酶消化和密度梯度离心法分离皮肤浸润性白细胞。
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概述
本方案描述了通过酶消化和密度梯度分离法来分离皮肤浸润性白细胞的方法。该方法适用于研究特应性皮炎等皮肤病理小鼠模型中的细胞和分子机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 皮肤浸润性白细胞在皮肤病理过程中发挥着关键作用。
- 传统的组织解离方法可能过于剧烈且效率较低。
- 酶消化法提供了一种更具经济性的替代方案。
- 皮肤取材和梯度处理过程需要精确操作。
研究目的
- 从鼠皮肤中分离白细胞以进行后续分析。
- 深入了解皮肤浸润性白细胞的生物学特性。
- 促进对其他常驻细胞群体的研究。
使用的方法
- 在营养丰富的培养基中对小鼠皮肤进行酶消化。
- 通过梯度分离法纯化白细胞。
- 使用手术剪仔细切除皮肤。
- 通过可视化演示辅助学习该技术。
主要结果
- 成功分离小鼠皮肤中的白细胞。
- 加深对皮肤浸润性白细胞生物学特性的理解。
- 在研究多种皮肤病理过程中的潜在应用价值。
- 与传统技术相比，该方法已显示出更高的有效性。
结论
- 酶消化和梯度分离方法有效且经济。
- 本方案可促进皮肤相关疾病的研究。
- 视觉辅助材料对于掌握该技术至关重要。
常见问题
行业重要性概述
分离具有活性的皮肤浸润性白细胞，可实现对炎症性皮肤疾病模型中治疗靶点的机制性风险评估。本方案通过可重复地获取免疫细胞群体，用于表型和功能分析，从而支持靶点验证。该方法通过保持对基于流式细胞术决策至关重要的表面标志物完整性，提高了临床前研究的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离病变皮肤中的浸润性免疫细胞，可验证治疗假设。
- 操作价值：提供一种经济高效的替代方法，避免使用机械解离装置和损伤细胞活性的强烈酶解方法。
- 预测价值：保持CD4、CD8-alpha、CD44和CD62L等表面标志物的完整性，支持可靠的表型鉴定。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可生成高活性的单细胞悬液，适用于后续的流式细胞术和功能分析。
- 操作价值：使用易获取的试剂（胶原酶D、密度梯度介质）和常规实验室设备，有助于提高实验的标准化程度。
- 可扩展性：能够稳定获得免疫细胞产量（在炎症皮肤中约为每平方毫米250个活细胞），支持可重复的筛选工作流程。
转化与临床前研究
- 转化连续性：支持对氧化唑酮诱导的皮炎等皮肤炎症模型中的免疫浸润进行分析。
- 机制性风险降低：可定量分析CD45+免疫细胞浸润（激发后增加67倍），以评估靶点参与情况。
- 临床前模型相关性：可分离出T细胞和中性粒细胞，其浸润模式与人类皮肤病理特征相似。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期免疫学中的假设验证到通过炎症疾病模型中的免疫细胞谱型分析进行先导优化的整个发现流程。
- 发现生物学：通过分离皮肤浸润性白细胞，阐明皮肤病理中的免疫机制，支持假设验证。
- 筛选：制备可用于检测的细胞悬液，以评估化合物对免疫细胞募集或活化的影响。
- 分析：提供可定量的结果，如活细胞计数及适用于流式细胞术的细胞亚群，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：通过保留跨模型追踪免疫细胞表型所需的标记物，连接基础发现与临床前验证。
- 企业级应用：建立一种可重复使用的分离方案，适用于多种皮肤疾病模型及不同组织常驻细胞类型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过精确表征浸润性白细胞亚群，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过标准化的酶消化和梯度分离步骤，提升实验可重复性。
- 战略价值：通过提供可靠的免疫细胞数据支持决策，降低候选药物筛选中的生物学风险。
- 项目组合影响：基于相关临床前模型中免疫调节效应的评估，支持对化合物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备组织采集的专业技能，特别是从小鼠皮肤中去除脂肪和结缔组织。
- 依赖于离心机、旋转板、70微米滤网以及用于切碎组织的外科工具。
- 需要接受密度梯度分层和界面提取的培训，以避免气泡形成并确保细胞回收。
- 在应用于除唑酮刺激以外的不同小鼠品系、年龄或皮肤损伤模型时，可能需要进行方法调整。
- 实际局限性：熟练掌握该技术需要实践，特别是在梯度液操作方面，以获得稳定的白细胞产量。
