改善二维与三维皮肤模型 体外 使用大分子拥挤效应的模型

本实验的总体目标是利用大分子拥挤效应增强细胞外基质的沉积，从而改进现有的二维和三维皮肤模型。大分子拥挤可在较短的时间内促进细胞来源基质的形成以及成熟类器官培养物的构建。该方法能够解答组织工程领域中的关键问题，因为它为生物工程化皮肤及其他组织中细胞来源细胞外基质的构建提供了更优的策略。

该技术的主要优势在于，将大分子拥挤效应应用于这些培养体系时，可显著缩短细胞来源基质和类器官皮肤结构的制备时间。干涉反射显微技术使您能够在无需抗体染色的情况下，直接观察细胞外基质的整体沉积情况。这些技术的应用范围将从皮肤细胞分泌细胞外基质的研究，拓展到更优的创面治疗策略，特别是通过构建更高质量的皮肤替代物以及用于移植的组织培养。

首先，在24孔板的每个孔中加入一毫升培养基，接种50,000个原代成纤维细胞、原代角质形成细胞，或两者的共培养细胞。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜，使其贴壁。随后，弃去旧培养基，更换为含大分子拥挤剂和100微摩尔抗坏血酸的一毫升新鲜培养基。

将培养物孵育六天，每两天更换一次培养基。按照文本方案进行免疫荧光和蛋白质印迹分析。如需制备和使用细胞来源基质，在细胞中加入分子拥挤剂和抗坏血酸培养六天后，首先用1×PBS洗涤细胞层两次，以去细胞化细胞层，获得细胞来源基质。

吸去 PBS，然后加入 250 µL 0.5% 脱氧胆酸钠，冰上孵育 10 分钟。吸去细胞裂解液，再加入 250 µL 0.5% 脱氧胆酸钠，重复孵育 10 分钟并吸去液体，共重复两次。用蒸馏水洗涤细胞来源的基质两次。

吸去水分，然后加入1× PBS。将基质置于4摄氏度保存，最多可保存一周。为制备次级细胞悬液，吸去基质中的PBS，并在F基质顶部接种50,000个角质形成细胞，例如。

让细胞贴壁过夜。如需在细胞来源的基质上进行干涉反射显微镜（RIM）观察，请按照文本方案使用共聚焦显微镜进行图像采集。若要在细胞培养插件中制备包埋成纤维细胞的胶原凝胶，需将10毫升大鼠尾部Ⅰ型胶原液分装至预冷的烧杯中。

加入1毫升冷DMEM和0.5毫升1摩尔氢氧化钠以中和酸性胶原。然后加入0.5毫升成纤维细胞悬液。使用预冷的移液器，将12毫升溶液均匀分配至6孔培养板中的细胞培养插件内。

将凝胶在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。待凝胶完全凝固后，将其浸入成纤维细胞培养基（FM）中。继续孵育24小时后，吸除FM。使用4毫升含有大分子拥挤剂的新鲜培养基替换旧的FM，其中2毫升加入细胞培养插入物内部，2毫升加入细胞培养插入物外部。经过24小时孵育后，使用0.125%胰蛋白酶解离试剂对角质形成细胞进行胰蛋白酶消化。

轻轻敲击培养瓶侧面以使细胞脱落，并加入含血清的培养基以中和胰蛋白酶。计数细胞后，制备角质形成细胞悬液。接着，吸除细胞培养小室中的培养基，将角质形成细胞接种至凝胶表面。

将凝胶孵育一小时。待角质形成细胞贴附于凝胶表面后，使用两毫升 KSFM 或 CTN-57 无血清培养基浸没凝胶培养插件内的细胞，并在细胞培养插件外侧加入两毫升 FM。经过 24 小时孵育后，弃去旧培养基，更换为含有大分子拥挤剂的新鲜培养基。

在浸没培养7天后，为将培养物提升至气液界面，将培养插件转移至深孔板中。在细胞培养插件外部加入10毫升分层培养基，保持插件内部干燥。最后，将培养物继续孵育，并每3天更换一次培养基，持续14天。

根据文本方案收获并处理它们。如图所示，与对照培养相比，大分子拥挤环境使得成纤维细胞沉积更多的细胞外基质（ECM）。经去垢化处理后可以明显看出，成纤维细胞是I型胶原、IV型胶原和纤连蛋白的主要沉积者。

该图表明，主要是成纤维细胞而非角质形成细胞沉积了Ⅶ型胶原蛋白，这也是首次报道在体外成功实现Ⅶ型胶原蛋白沉积。利用反射干涉显微术（RIM），可完整捕获细胞来源基质的全部范围。将RIM图像与抗体染色结果叠加，可以显示该细胞外基质成分相对于总细胞外基质量的相对含量。

在一种三维体外皮肤模型中，大分子拥挤（MMC）将获得成熟器官型皮肤共培养物所需的培养时间从五周缩短至三周。如图中苏木精和伊红染色所示，在三周时，添加MMC的培养物形成了多层的表皮和具有乳头状结构的真皮。此外，与对照组培养物中微弱且呈斑片状的胶原蛋白VII免疫染色相比，在细胞拥挤的培养物中，真皮-表皮连接处检测到强烈且连续的胶原蛋白VII免疫染色信号。

透射电子显微镜还显示，在经MMC处理后生成的类器官培养物中存在锚定纤维，表明存在功能性的VII型胶原蛋白。细胞来源的基质可作为替代支架用于二次细胞接种，因为其保持了细胞外基质的复杂性，并且由细胞自身产生。在大分子拥挤条件下生成的类器官皮肤培养物可作为改进的三维皮肤模型，因其包含间质乳头状真皮、主要的真皮-表皮连接结构以及多层复层表皮。

使用大分子拥挤剂生成的组织型皮肤等效物培养物也可用于皮肤移植，因为其真皮-表皮连接结构更为完善，可能提高移植成功率。除了增强细胞外基质的沉积外，大分子拥挤还可应用于其他体外系统，以加速反应速率受限的反应过程，而无需增加试剂用量，例如聚合酶链式反应（polymerase chain reactions）。