流型引导的高密度条形码抗体微阵列制备

本方法学的总体目标是构建一种可用于单细胞分析的抗体芯片。该方法有助于回答单细胞分析领域中的关键科学问题，例如：如何从同一个单细胞中同时检测分泌蛋白和细胞内蛋白？以及，如何构建一种微阵列平台以实现该目标？

该技术的主要优势在于其可定制性。通过改变流动图案化策略，可创建不同尺寸的阵列。预先制备用于条形码流动图案的 SU-8 母版。

文本方案中提供了详细说明。该过程包括设计并制作铬光刻掩模，将掩模置于光刻胶涂层上，再进行紫外光照射以形成图案。

开始制备PDMS条形码模具时，将40克硅弹性体基质与4克固化剂混合，然后剧烈搅拌10分钟。接着，在真空条件下对预聚物溶液脱气20分钟。随后，将溶液注入含有条形码图案SU-8主模板的硅片的培养皿中。

将溶液倒入至7.45毫米深度。然后，在培养皿中对混合物进行脱气，以去除任何残留的气泡。接着在75 °C下烘烤混合物1小时，使PDMS固化。

接下来，使用手术刀小心切割并移除条形码模具。然后，小心地将平板从晶圆上剥离。接着，修整平板的边缘，以制成模具所需的形状。

使用带推杆的活检打孔器，在图案的圆形结构上打孔，形成代表入口和出口的半毫米孔洞，完成模具制作。用氮气吹枪吹去经多聚-L-赖氨酸包被的玻片表面的灰尘后，将PDMS模具贴附于玻片上。仔细对齐模具边缘与玻片的位置。

现在，将组装件在 75 摄氏度下烘烤 90 分钟，以增强 PDMS 与载玻片之间的粘合。同时，准备 20 段柔性聚乙烯管作为进样口和出样口。在每段管子上安装一根直径为 1 毫米的不锈钢中空针。

然后，通过插销向槽内加入一厘米或更长的多聚-L-赖氨酸。待其与玻璃结合后，小心地将插销固定到模具的入口处。这是制备过程中最困难的一步。

请勿急于完成该过程。将管子的另一端连接至一个压力可调的氮气罐装置，该装置由20个三通阀组成的网络构成，可同时处理两个模具。使用该装置，以0.5至1 PSI的压力将溶液吹过模具，持续至少六小时。

首先，通过不锈钢针头将新配制的单链DNA溶液吸入BS-3中，并进入聚乙烯管路。然后，将PDMS模具连接至氮气源，使溶液流经条形码模具约40分钟，或直至所有通道完全充满。随后停止流动，让模具在室温下孵育两小时。

数小时后，将条形码模具在75摄氏度下烘烤1小时。烘烤完成后，将模具从载玻片上取下，并用0.1% SDS轻轻清洗载玻片。随后，用超纯水清洗载玻片三次。

使用载玻片离心干燥机干燥条形码载玻片，完成洗涤步骤。干燥后，将条形码载玻片存放在洁净的50毫升离心管中。接下来，请按照文字版实验方案验证一维条形码图案。

为了执行验证程序，封闭载玻片，将Cy3互补DNA杂交至其上并测量结果。用于3×3阵列的SU-8母版具有与第一种设计流向垂直的流道模式。使用先前所述的方法制备该流道的新PDMS模具。

首先，配制九种寡核苷酸的新鲜工作浓度溶液。接着，在0.5至1 PSI的压力下，将3% BSA封闭溶液注入芯片载玻片的全部20个通道，孵育1小时。然后，将DNA溶液分别加入对应的通道中。

流过约40分钟后，在室温下孵育载玻片2小时，使DNA杂交。接着，将3% BSA封闭溶液注入所有20个通道，持续1小时。这将去除未杂交的DNA。

现在，将阵列芯片从PDMS上剥离，并将其浸入3% BSA溶液中一次。随后，将芯片在PBS中浸洗两次，再在2% PBS中浸洗一次。然后，与之前相同，使用载玻片离心干燥仪将芯片干燥。

接下来，执行一个类似于验证一维芯片的验证步骤。使用全部与花青素三（cyanine three）偶联的一磷酸至九磷酸寡核苷酸。将 3×3 阵列芯片保存在 50 毫升离心管中，以供后续使用。

文本方案进一步说明了如何将DNA芯片转化为抗体芯片。在制备并纯化抗体-寡核苷酸偶联物后，准备另一个带有微腔的PDMS模具。详见文本部分。

将此模具与阵列芯片配对。现在用1% BSA封闭芯片，并在室温下孵育1小时。在孵育期间，准备200微升抗体-寡核苷酸偶联物。

在封闭后，将抗体-寡核苷酸混合液加入体系中。于37摄氏度条件下使抗体在芯片上孵育1小时，随后清洗并干燥芯片，再继续进行文本方案中所述的芯片浸渍步骤。按照所述方案操作后，使用3×3阵列获得的抗体组合被用于多重检测，主要通过夹心ELISA平台实现。

蛋白质在玻片的一端到另一端之间的变异小于10%。在3×3阵列中，可同时检测多达七种蛋白质，以及一个由Cy3标记的参照和一个阴性对照。在一项针对肿瘤研究的单细胞实验中，六种蛋白质均被同时检测到。

进行校准时，将不同浓度的重组蛋白施加到芯片上。检测灵敏度与传统的夹心 ELISA 相似。在进行此操作时，需注意保持 PDMS 模具无颗粒物污染。

通道中的灰尘可能导致阵列表现出较差的均一性和低灵敏度。该技术开发完成后，为癌症研究领域的研究人员探索肿瘤微环境模型中的细胞间信号传导铺平了道路。