高密度条码抗体芯片的水流模式的指导下制作
2016年1月6日
这个协议概括了大规模的制造中，复用的二维DNA或抗体阵列，在细胞信号研究和生物标记物检测的应用潜力。
该方法的总体目标是构建用于单细胞分析的抗体阵列。这种方法可以帮助回答单细胞分析领域的关键问题，例如我们如何同时从同一单细胞中检测秘密蛋白质和细胞内蛋白质。我们如何制造微阵列平台来实现该目标。
这种技术的主要优点是它是可定制的。通过改变流模式策略，可以创建各种维度的数组。提前为条形码流模式生成 SU-8 主控。
文本协议中提供了说明。这涉及设计和制作 chrome 照片蒙版。将蒙版放在光刻胶涂层上并应用 UV 可提供图案。
要开始准备 PDMS 条形码模具，请将 40 克硅弹性体基料与 4 克固化剂混合，然后剧烈搅拌 10 分钟。然后，在真空下对预聚物溶液脱气 20 分钟。接下来，将溶液加载到含有硅晶片的培养皿中，该培养皿具有条形码图案的 SU-8 母版。
将溶液倒入 7.45 毫米的深度。然后，对培养皿中的混合物进行脱气以去除任何残留的气泡。脱气后，将混合物在 75 摄氏度下烘烤一小时以固化 PDMS。
接下来，用手术刀切割，小心地取下条形码模具。然后，小心地从晶圆上剥下板。接下来，修剪板的边缘以制作模具所需的形状。
使用带柱塞的活检冲头在模型上代表入口和出口的圆形特征上打出半毫米的孔，从而完成模具。用氮气吹尘枪吹掉聚-L-赖氨酸涂层载玻片上的灰尘后，将 PDMS 模具连接到载玻片上。小心地将模具的边缘与载玻片对齐。
现在，在 75 摄氏度下烘烤组件 90 分钟，以加强 PDMS 和载玻片之间的粘合。同时，为入口和出口准备 20 根柔性聚乙烯管。在每根管路上，连接一个直径为 1 毫米的不锈钢空心销。
然后，通过针脚，用一厘米或更多的聚-L-赖氨酸填充长度。粘合到玻璃上后，小心地将销钉固定到模具的入口处。这是准备中最困难的步骤。
不要急于求成。将管子的另一端连接到压力调节氮气罐装置上，该装置由 20 个三通阀组成的网络组成，可以同时处理两个模具。使用设置，以 0.5 到 1 PSI 的比例将溶液吹过模具至少 6 小时。
首先，将新鲜制备的 BS-3 单链 DNA 溶液通过不锈钢针吸入聚乙烯管中。然后，将 PDMS 模具耦合到氮气源，使溶液流经条形码模具约 40 分钟或直到所有通道都充满。然后，停止流动，让霉菌在室温下孵育 2 小时。
几个小时后，将条形码模具在 75 摄氏度下烘烤一小时。烘烤后，将模具从载玻片上拆下，并用 01%SDS 轻轻清洗载玻片。然后，用超纯水洗涤载玻片 3 次。
通过使用载玻片旋转器干燥条形码载玻片来进行洗涤。干燥后，将条形码载玻片存放在干净的 50 毫升试管中。要继续，请按照文本协议验证一维模式。
要执行验证程序，请封闭载玻片，将 3 个 互补 DNA 杂交并测量结果。用于 3 x 3 阵列的 SU-8 主控具有垂直于第一个设计的流型。使用前面描述的方法制作此模式的新 PDMS 模具。
首先，制备 9 个寡核苷酸的新工作浓度。现在，将 3% BSA 封闭溶液流入阵列玻片的所有 20 个通道中，以 0.5 比 1 PSI 的速度流入一小时。接下来，将 DNA 溶液加载到各自的通道中。
流动约 40 分钟后，将玻片在室温下孵育 2 小时，让 DNA 杂交。接下来，将 3% 的 BSA 封闭溶液流入所有 20 个通道，持续一小时。这将去除非杂交 DNA。
现在，从 PDMS 上剥离阵列玻片，并将玻片浸入 3% BSA 中一次。然后，将玻片浸入 PBS 中两次，然后浸入 2% PBS 中一次。然后，像以前一样，使用显微镜载玻片旋转器干燥载玻片。
要继续，请执行类似于验证一维幻灯片的验证步骤。使用寡核苷酸，一引物至九引物，均与花青素三偶联。将 3 x 3 阵列玻片保存在 50 mL离心管中以备后续使用。
文本实验方案进一步解释了如何将 DNA 阵列转换为抗体阵列。准备并纯化抗体 - 寡核苷酸偶联物后，准备另一个带有微室的 PDMS 模具。有关详细信息，请参阅文本。
将此模具与阵列载玻片配合。现在，用 1% BSA 封闭载玻片，并在室温下孵育一小时。在孵育过程中，制备 200 μL 抗体-寡核苷酸偶联物。
封闭后，将抗体-oligo 混合物添加到设置中。让抗体在 37 摄氏度下在阵列上孵育一小时，然后清洁并干燥玻片，然后再进行文本方案中描述的玻片浸泡。按照所述方案后，使用 3 x 3 阵列，将所得抗体面板用于多重检测，主要通过夹心 ELISA 平台。
蛋白质从载玻片的一端到另一端的差异小于 10%。在 3 x 3 阵列上，可以检测到多达 7 种蛋白质以及用花青素 3 标记的参考蛋白质和阴性对照。在为肿瘤研究进行的单细胞实验中，同时检测到六种蛋白质。
为了进行校准，将重组蛋白以不同浓度上样到阵列中。检测灵敏度与传统的夹心 ELISA 非常相似。在尝试此程序时，请务必记住保持 PDMS 模具没有颗粒物。
通道中的灰尘会导致阵列均匀性差和灵敏度低。开发后，这项技术为癌症研究领域的研究人员使用肿瘤微环境模型探索细胞间信号传导铺平了道路。
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概述
该协议概述了一种可定制抗体阵列的制作方法，应用于单细胞分析。其目的是同时从同一单细胞中检测分泌和细胞内蛋白质。
关键研究组成部分
科学领域
- 单细胞分析
- 抗体阵列制作
- 生物标志物检测
背景
- 了解细胞信号传导对生物学研究至关重要。
- 目前的方法可能无法有效检测单细胞中的多种蛋白质。
- 可定制的阵列可以增强检测能力。
- 流动图案策略允许不同尺寸的阵列。
研究目的
- 开发一种同时检测单细胞中蛋白质的方法。
- 创建一个为特定研究需求量身定制的微阵列平台。
- 改善对细胞内过程的理解。
使用的方法
- 大规模抗体阵列的制作。
- 使用SU-8主板进行条形码流动图案。
- 可定制的流动图案策略。
- 将阵列应用于单细胞分析。
主要结果
- 成功制作了多重抗体阵列。
- 展示了从单细胞中检测多种蛋白质的能力。
- 可定制阵列在应用中表现出多样性。
- 在生物标志物检测方面有可能实现重大进展。
结论
- 开发的方法增强了单细胞分析的能力。
- 可定制阵列可以为特定研究问题量身定制。
- 这种方法可能为细胞信号传导和生物标志物研究带来新的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-density barcode antibody microarrays fabricated via flow-patterning enable multiplexed protein detection at single-cell resolution, addressing critical needs in early discovery and translational research. This platform supports simultaneous analysis of secreted and intracellular proteins, enhancing mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation. The customizable, miniaturized format facilitates integration into diverse R&D workflows, supporting portfolio-wide biomarker and signaling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein expression and signaling pathways at the single-cell level.
- Supports functional target validation by detecting multiple analytes from individual cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed protein profiling.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microarray platforms for high-throughput screening of protein biomarkers.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization.
- Supports scalable, printer-free fabrication adaptable to various assay formats.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein expression in single cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant single-cell models for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting multiplexed protein analysis.
- Reduces biological risk in advancing candidates by providing high-content, quantitative data.
- Facilitates studies of cell-cell signaling in tumor microenvironments and other complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
This barcode microarray technology integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting multiplexed protein analysis in single-cell and tissue models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification at single-cell resolution.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables sensitive, multiplexed measurement of protein expression and signaling outputs.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease-relevant model studies.
- Enterprise Reuse: Delivers a customizable, scalable platform adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and miniaturizes microarray fabrication for broad laboratory adoption.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content data early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust protein profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, DNA-antibody conjugation, and microarray validation.
- Needs access to PDMS molding, flow-patterning equipment, and fluorescence detection systems.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Adaptable to various model systems, including single-cell and tissue microenvironments.
- Uniformity and sensitivity depend on particulate-free fabrication and precise handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
One-dimensional DNA Barcode Slides: Preparing the PDMS Barcode Mold
2:21
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of Poly-L-lysine (PLL)
3:39
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of ssDNA
5:00
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Preparing the PDMS Barcode Mold and Flow Patterning of ssDNA
6:17
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Validation and Immunoassay
7:32
Results: Multiplex-protein Detection from Single-cell Preparations
8:25
Conclusion
