Name: 建模化疗耐药白血病体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习利用人骨髓基质细胞与急性淋巴细胞白血病细胞的体外共培养模型，分离并分析化疗耐药的白血病细胞亚群，为研究耐药机制及评估新型治疗策略提供经济高效的研究平台。

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本研究由美国国立卫生研究院（国家心肺血液研究所）R01 HL056888（LFG）、国家癌症研究所 RO1 CA134573NIH（LFG）、P30 GM103488（LFG）、西弗吉尼亚州 CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942、亚历山大·B·奥斯本造血系统恶性肿瘤与移植项目以及西弗吉尼亚州研究信托基金资助。我们感谢凯西·布伦戴奇博士及西弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室的支持，该实验室由 NIH S10-OD016165 以及美国国立卫生研究院普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）（CoBRE P30GM103488 和 INBRE P20GM103434）资助。

1. 高级准备
<ol>
	<li>制备葡聚糖G10颗粒。
	<ol>
		<li>通过向10 g G10颗粒中加入50 ml 1× PBS来制备G10悬液。轻轻颠倒混匀，并于4 °C过夜静置，使G10颗粒从磷酸盐缓冲液（PBS）中充分沉降。</li>
		<li>进行G10柱分离当天，吸除沉降后的G10颗粒上层PBS，加入50 ml新鲜PBS，颠倒混匀。重复此洗涤步骤两次，每次均向沉降的G10颗粒中加入50 ml新鲜PBS，最后将G10颗粒储存于4 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养骨髓间充质干细胞（BMSC）和成骨细胞（OB）。
	<ol>
		<li>将BMSC或OB细胞在37 °C、6% CO2条件下培养，接种于10 cm组织培养皿中，直至细胞融合度达到90%。</li>
		<li>用胰酶消化BMSC或OB细胞，按1:2比例传代至新的10 cm培养皿中。按此标准持续培养细胞，直至用于白血病细胞共培养实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 建立并维持共培养体系
<ol>
	<li>加入 5-20 x 106 将白血病细胞以10 ml肿瘤特异性培养基接种至80%-90%融合度的BMSC或OB培养板中。 
	注意： 我们的实验室在37 °C、5% O₂条件下维持共培养体系2 更好地模拟已被证实范围为1%至7%的骨髓微环境16-18 然而，在该氧张力下维持共培养体系对于三种白血病亚群的建立并非关键，可由实验室自行决定。</li>
	<li>每4th 第几天时，除去培养基（包括悬浮的白血病细胞）至仅剩1 ml，然后加入9 ml新鲜的白血病细胞培养基。从培养板中移除9 ml培养基时，注意不要扰动骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）的贴壁层。
	<ol>
		<li>倾斜培养板一侧以去除培养基，并从培养板角落处吸除培养基。此外，添加新鲜培养基时，务必沿培养板侧壁的角落逐滴加入，以尽量减少对贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>12 小时后th 共培养当天，用移液管将培养基在培养皿表面轻轻反复吹打5至10次，冲洗白血病细胞使其脱离骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层，收集于15 ml锥形管中。按照步骤2.1所述方法，重新接种至新的、融合度达80%–90%的BMSC或OB培养板中。 
	注意： 按照步骤2.3所述轻柔冲洗共培养体系，可去除S和PB来源的白血病细胞，同时不破坏骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层结构。此操作仅使肿瘤细胞转移至下一共培养板。该12天周期可根据用户需求重复多次。</li>
</ol>
3. 准备 G10 葡聚糖凝胶柱
注意：如果在 G10 柱分离后需要进行无菌的下游分析或培养，则应使用无菌技术操作，且 G10 柱应在无菌生物安全柜中设置。
<ol>
	<li>将细胞培养基在水浴中预热至 37°C（每列约 30 ml）。使用 10 ml 一次性注射器，取出并丢弃活塞。向注射器中加入玻璃棉。</li>
	<li>使用镊子将玻璃棉撕成细而松散的丝状。将多层疏松填充的玻璃棉加入注射器中，直至注射器体积的 2/3 被玻璃棉填满。 
	注意：玻璃棉对于防止松散的 G10 颗粒污染白血病细胞收集物至关重要。确保玻璃棉填充程度足以支撑 G10 颗粒，但又不能过于紧密而阻碍培养基流经柱体。</li>
	<li>将单向旋塞连接到注射器尖端，并处于关闭位置。</li>
	<li>将注射器柱体夹在铁架台上，高度应足以使 50 ml 锥形管（收集管）可置于旋塞下方。将收集管放置在注射器柱体下方。</li>
	<li>使用 10 ml 移液器，将悬浮于 PBS 中的 G10 颗粒逐滴加入柱体，位于玻璃棉上方。持续加入 G10 颗粒，直至在玻璃棉上方形成约 2 ml 的颗粒沉淀（根据注射器上的刻度测量）。</li>
	<li>用预热的培养基平衡 G10 柱体。
	<ol>
		<li>向柱体中加入 2 ml 预热的培养基。缓慢打开旋塞阀门，使培养基以逐滴方式流出柱体。</li>
		<li>重复步骤 3.6.1，直至总共 10 ml 预热的培养基流经柱体。 
		注意：若在收集管的流出液中观察到 G10 颗粒，则应：1）添加更多 G10 颗粒以维持约 2 ml 的沉淀，确保无额外 G10 颗粒从柱体逸出；或 2）更换为未使用的柱体，并重复步骤 3.4–3.6.1。</li>
		<li>当预热的培养基从柱体排尽后，关闭旋塞，并丢弃含有流出液的收集管。在柱体下方更换新的收集管。柱体现已准备好加载培养基与细胞混合物。 
		注意：柱体应立即使用，不得使其干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 共培养中三个亚群的分离
<ol>
	<li>悬浮（S）肿瘤亚群的收集。
	<ol>
		<li>用移液器吸出共培养板中的培养基，并轻轻将同一培养基重新加入板中以冲洗，收集含有白血病细胞的培养基至15 ml锥形管中。所收集的白血病细胞即为S亚群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亮相（PB）肿瘤亚群的收集。
	<ol>
		<li>将10 ml新鲜培养基重新加入共培养板中。通过移液器反复吹打约5次，充分冲洗以去除贴壁的白血病细胞，但力度不宜过大，以免脱离贴壁的骨髓基质细胞/成骨细胞（BMSC/OB）组分。</li>
		<li>用移液器吸出液体，并将培养基收集至15 ml锥形管中。所收集的细胞即为PB亚群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暗相（PD）肿瘤亚群的收集。
	<ol>
		<li>用1 ml PBS冲洗培养板以去除残留培养基。加入3 ml胰蛋白酶进行消化，并置于37 °C培养箱中孵育5 min。</li>
		<li>将培养板从培养箱中取出，轻轻敲击板壁两侧，使贴壁的BMSC/OB细胞脱落。</li>
		<li>加入1 ml胎牛血清（FBS），并吹打3–5次以分散大的细胞团块。</li>
		<li>将含有细胞的液体收集至15 ml锥形管中。这些细胞为未纯化的PD亚群，其中也包含BMSC/OB细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分离得到的3个亚群在400 × g下离心7 min。吸除并弃去上清液，分别将沉淀重悬于1 ml预热的培养基中。细胞即可用于加载至G10柱中。</li>
</ol>
5. 将共培养细胞上样至 G10 柱
注意：在向G10层析柱中加入含细胞的培养基之前，务必确保旋塞完全关闭。此外，每个亚群必须分别通过独立的G10层析柱进行分离，以避免在后续分析中引入群体间的偏差。
<ol>
	<li>使用 1,000 µl 移液器，将每种细胞亚群在预热培养基中的 1 ml 逐滴加入到单独的 G10 柱中。确保含有细胞的培养基保持在 G10 沉淀物的上方或内部。在室温下孵育 20 分钟。 
	注意： 孵育期间，活塞始终保持关闭状态。</li>
</ol>
6. 从 G10 柱收集白血病细胞
<ol>
	<li>向每个G10柱中加入1-3 ml预热的培养基。打开活塞阀，使培养基以逐滴方式缓慢流出。 
	注意：必须保持柱子流出速度缓慢，否则含有BMSC/OB的G10沉淀物可能被冲出柱子，从而污染分离得到的白血病细胞。</li>
	<li>持续以小量（1-2 ml）向G10柱中添加预热的培养基，直至总共15至20 ml培养基流经柱子并被收集完毕。关闭活塞阀，并盖紧收集管管盖。 
	注意：若在收集管底部观察到G10颗粒沉淀，应轻柔移除上清液，保留G10颗粒沉淀不受扰动，并将其转移至新管中。</li>
	<li>将收集的流出液在室温下以400 × g离心7分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适用于下游应用的缓冲液中。</li>
	<li>此时细胞为纯化的白血病细胞群体，不含BMSC或OB污染，可根据用户需要直接用于后续实验。 
	注意：白血病细胞在通过G10柱后，其活力应保持不变。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

微小残留病（MRD）是导致疾病复发的重要因素，在侵袭性难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）以及其他多种血液系统恶性肿瘤的治疗中，仍然是一个主要的临床挑战。骨髓微环境是ALL最常见的复发部位3,8。因此，能够模拟骨髓微环境的模型对于验证化疗过程中白血病肿瘤细胞存活及MRD维持相关假说至关重要。尽管小鼠模型是评估药物疗效相关问题的金标准，二维共培养仍是测试与骨髓微环境支持白血病细胞存活相关的假说和药物策略的一种经济有效的方法。许多研究已表明，当白血病细胞与骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）共培养时，在接受化疗药物处理后可获得生存优势9,10,12-14,19-21。以往在间充质干细胞（MSC）共培养体系中对正常未成熟CD34+造血细胞的研究发现，造血细胞会与贴壁的MSC单层相互作用，形成三种空间分布不同的造血细胞群体22,23。CD34+细胞的增殖和分化程度与其在共培养体系中的位置相关22。我们在该观察基础上进一步拓展，利用二维共培养模型研究骨髓微环境基质细胞对耐药肿瘤细胞亚群的支持作用，并探索将其分离以用于后续分析的方法。
<p clas...

该方法的总体目标是提供一种高效、经济 体外 一种支持研究化疗期间骨髓支持白血病细胞存活机制的方法。已有充分证据表明，治疗后仍存活的残留肿瘤细胞会导致疾病复发，且复发常比初诊时更具侵袭性，治疗效果也往往更差。1-8仅包含白血病细胞的模型（例如仅将细胞在培养基中进行培养的模型）在测试治疗策略时未考虑这些关键信号，也未考虑疾病异质性，而这种异质性是由微环境信号的可获得性所引发的，其中与微环境细胞具有特定相互作用的肿瘤细胞亚群会获得更强的保护作用。标准的二维共培养模型将骨髓来源的基质细胞与白血病细胞共同培养，在一定程度上弥补了骨髓微环境的影响，研究表明，与骨髓微环境细胞相互作用可增强白血病细胞对化疗的耐药性，并改变其生长特性。9-14然而，这些模型通常无法再现肿瘤细胞的长期存活情况，也不能准确反映与导致微小残留病（MRD）的最耐药白血病细胞群体相关的结局。 在体 模型在临床试验前对创新疗法的研究中仍然至关重要，并被视为“金标准”，但其常受限于验证耐药性肿瘤及疾病复发相关假设所需的时间和成本。因此，开发信息量更丰富的二维模型将有助于开展初步研究，从而为后续基于小鼠的临床前研究设计提供更可靠的指导。 
二维 体外 本报告中呈现的模型缺乏真实情况的复杂性 体内 微环境，但提供了一种经济高效且可重复的方法，用于研究肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，尤其适用于富集具有化疗耐药性的肿瘤细胞亚群。这一特性具有重要价值，因为对全部肿瘤细胞群体的评估可能会掩盖那些虽占少数却构成最重要靶标的治疗耐药细胞的表型。该模型的另一优势在于其可扩展性，可根据具体分析需求进行调整。对于需要大量回收肿瘤细胞的分析，可建立大规模培养体系；而对于基于PCR或显微镜观察的评估，则可采用多孔板中的小规模共培养体系。 
基于这一需求，我们开发了一种 体外 用于研究B系急性淋巴细胞白血病（ALL）特征性异质性疾病的模型。我们证明，ALL细胞与其正常对应细胞具有许多共同特征，可在骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）共培养体系的不同区室中定植。共培养可产生三种具有不同表型的肿瘤细胞亚群，适用于治疗反应的研究。具体而言，我们发现从共培养的“相位暗区”（PD）群体中回收的ALL细胞对治疗 consistently 呈耐药状态，其存活率接近未接触细胞毒性药物的肿瘤细胞。这些ALL细胞无论来源于已建立的细胞系或原代患者样本，均可迁移至贴壁的基质细胞或成骨细胞层下方，但可通过消化培养物后利用凝胶型10号交联葡聚糖（G10）颗粒柱分离不同细胞类型而被捕获。15. 
本文介绍了一种可用于模拟骨髓微环境基质细胞（BMSC/OB）与白血病细胞之间相互作用的二维共培养体系。尤为重要的是，我们观察到白血病细胞相对于基质细胞单层会形成三种空间亚群，其中贴近基质层（PD）的细胞群体由于与BMSC或成骨细胞（OB）相互作用而表现出化疗耐药性。此外，我们展示了如何利用G10柱有效分离这些白血病细胞亚群。值得注意的是，分离这些亚群后，可对最具耐药性的PD细胞群体进行下游分析，以确定其因与骨髓微环境基质细胞或成骨细胞相互作用而获得的潜在耐药机制。在此共培养与分离模型基础上，我们已采用的下游技术包括流式细胞术分析、蛋白质组学分析、靶向蛋白表达检测，以及近期发展的激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）和Seahorse代谢分析，用于评估细胞的代谢特征。结合本模型与上述技术，我们发现：与单独在培养基中培养的白血病细胞或共培养体系中其他亚群分离的细胞相比，PD亚群具有独特的化疗耐药表型。因此，该模型适用于更深入的研究，以评估靶向治疗那些通过与骨髓微环境相互作用而获得耐药表型的最耐药白血病细胞的策略。

<table><tbody><tr><td>G10 Sephadex 小珠</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td>文中称为凝胶型10交联葡聚糖颗粒</td></tr><tr><td>10 ml 无菌注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Pyrex</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>单向旋塞阀</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14054-10</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021039</td><td>用作收集管</td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021037</td><td>用于细胞收集</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成骨细胞培养基&amp;nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-27001</td><td>用于人成骨细胞培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-040</td><td>用于肿瘤培养基制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;贴壁细胞：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人成骨细胞</td><td>PromoCell</td><td>C-12720</td><td>人成骨细胞按照供应商的建议进行培养。&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人骨髓基质细胞</td><td>WVU 生物样本核心库</td><td></td><td>去标识化的原代人白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心库和西弗吉尼亚大学病理学组织库提供。BMSC 培养物的建立方法如先前所述 (*)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;白血病细胞：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>REH</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CRL-8286</td><td>REH 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SD-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 366</td><td>SD-1 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. 依托泊苷对骨髓基质细胞功能的破坏。Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 年 8 月；3(3):122&amp;ndash;132。</td></tr></tbody></table>

建立化疗耐药型白血病模型 体外

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

众所周知，骨髓微环境为血液系统疾病提供了一个独特的庇护所，这些疾病在此部位发生并进展。本报告中介绍的模型利用人原代骨髓基质细胞和成骨细胞作为骨髓微环境中的两种代表性细胞类型，以研究其对肿瘤细胞表型的影响。 体外 上述人源白血病细胞与主要微环境组分共培养的条件，可支持产生一群具有化疗耐药性的肿瘤细胞亚群，该亚群可高效地从培养体系中回收，并用于多种技术手段的分析。通过严格的换液程序以避免营养波动，并利用凝胶型10号交联葡聚糖（G10）颗粒回收已迁移至贴壁的骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）下方的肿瘤细胞，从而获得“相位暗化”（PD）肿瘤细胞群体，此方法可稳定地提供纯化的治疗耐药性白血病细胞。这一具有临床相关性的肿瘤细胞群体可通过标准方法进行评估，用于研究凋亡、代谢及细胞周期调控通路，同时也为在临床前研究针对微小残留病灶开发新型治疗策略时，提供更为严格的靶标。

成功建立并培养该共培养模型后，相对于贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层，白血病细胞将形成3个亚群。图1展示了将急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞接种至BMSC单层后，最初仅表现为单一的悬浮白血病细胞群。在4天的培养过程中，白血病细胞与BMSC相互作用，逐渐形成3个空间上可区分的白血病细胞亚群：悬浮型（S）、相位明亮型（PB）和相位暗淡型（PD）。尽管在与BMSC或OB共培养24小时后通常即可观察到这3个肿瘤细胞亚群，但我们选择共培养4天，以确保白血病细胞与BMSC/OB细胞之间的全部动态相互作用在任何操作或实验干预前充分发生（图1）。此外，需注意我们维持共培养体系的氧张力为5%，以模拟骨髓生理环境，文献报道骨髓氧浓度范围为1%–7%16–18。
绝大多数下游分析都需要将白血病细胞与BMSC或OB分离。为此，我们使用G10柱来收获纯的白血病细胞群...

本报告总结了一种可用于模拟骨髓微环境生态位对白血病细胞影响的实验方案，重点在于富集化疗抗性最强的亚群细胞。

众所周知，骨髓微环境为血液系统疾病提供了一个独特的庇护所，这些疾病既可在此处发生，也可在此处...

本实验的总体目标是更好地在体外建立耐药性急性淋巴细胞白血病（ALL）的模型。该方法有助于解答关于骨髓微环境如何影响 ALL 细胞对化疗药物产生耐药性的关键问题，从而推动难治性 ALL 的治疗研究。该技术的主要优势在于，与传统的动物模型相比，该方法成本显著更低，且耗时更短，可用于研究药物对难治性 ALL 细胞的作用。首先，将5 × 10⁶至20 × 10⁶个白血病细胞接种于10 mL肿瘤特异性培养基中，加入到一个含有80%～90%融合度的骨髓基质细胞或成骨细胞的100 mm培养皿中。每隔4天，将培养皿倾斜至一侧，吸除除1 mL以外的所有培养基，注意不要扰动贴壁细胞层。然后，沿培养皿侧壁的角落逐滴加入9 mL新鲜的白血病细胞培养基，以最大程度减少对贴壁细胞的干扰。共培养第12天后，轻轻吹打培养板中的培养基上下混合约5至10次，以收集悬浮的白血病细胞，并将细胞转移至15毫升锥形管中。然后，将细胞重新接种到一个新的培养板上，该培养板含有80%至90%融合度的骨髓基质细胞或成骨细胞，操作方法如前所述。到第四天时，白血病细胞将形成三个亚群，其中悬浮的白血病细胞自由漂浮于培养基中。相位明亮型白血病细胞附着在贴壁细胞单层的表面，而相位暗淡型白血病细胞则迁移至单层下方。为制备G10珠柱，首先将每根柱所需的30毫升细胞培养基在水浴中复温至37摄氏度。接下来，使用镊子将玻璃棉拉成细而松散的丝状，并为每个所需的层析柱向一个10毫升注射器中添加多层疏松的丝状物。当注射器填充至三分之二满时，将一个处于关闭状态的单向旋塞连接到注射器尖端，并将注射器夹在铁架台上，高度需确保可在旋塞下方放置一个50毫升锥形收集管。现在，在注射器柱下方放置一个收集管。使用10毫升移液器将悬浮在PBS中的G10颗粒逐滴加至玻璃棉上方。持续加入G10颗粒，直至形成2毫升的沉淀颗粒。然后，向柱中加入两份预热的培养基，每份两毫升。缓慢打开旋塞阀，使培养基以逐滴的方式从柱中流出。当10毫升培养基完全流经柱子后，关闭旋塞阀。弃去穿流液，在柱下方放置一个新的收集管。为收获悬浮的肿瘤亚群，吸出白血病细胞共培养板中的培养基，并用相同的培养基轻轻冲洗培养板一次。随后，将悬浮的白血病细胞亚群转移至15毫升锥形管中。为收获相位明亮的肿瘤亚群，向共培养板中加入10毫升新鲜培养基，并充分冲洗约五次，以去除贴壁的白血病细胞，同时不破坏贴壁细胞单层。然后，将相位明亮的亚群转移至一个15毫升的圆锥形离心管中。为收获相位变暗的肿瘤亚群，先用一毫升 PBS 洗涤以去除残留培养基，随后在 37 摄氏度下用三毫升胰蛋白酶消化使细胞脱落。五分钟后，轻轻敲击培养皿侧壁以松动贴壁细胞，接着加入一毫升胎牛血清（FBS）以终止酶促反应。然后，用血清冲洗三到五次，以分散任何较大的细胞团块。将未纯化的暗相细胞亚群转移至新的15毫升锥形管中。当所有亚群收集完毕后，离心沉淀细胞。将每个沉淀重悬于1 mL预热的培养基中。将旋塞完全关闭后，针对每个亚群，使用1,000 µL移液器将全部1 mL细胞悬液逐滴加至已准备好的G10柱顶部，确保细胞保持在G10沉淀的上方或内部。室温下孵育20分钟，使细胞与G10沉淀充分接触。然后，向柱中加入一到三毫升新鲜的预热培养基。打开活塞，使培养基以滴状缓慢从柱中流出。继续以一到二毫升的增量向柱中添加预热的培养基。当收集到总共 15 至 20 毫升的白血病细胞后，关闭旋塞并盖上收集管。然后离心细胞，将沉淀重新悬浮于适当的下游分析缓冲液中。在对贴壁细胞层进行胰蛋白酶消化后，通过前向散射与侧向散射分析可观察到两种不同的细胞群体。经过G10分离后，可获得纯度较高的ALL细胞群体。特别值得注意的是，从骨髓基质细胞或成骨细胞共培养体系中分离得到的所有暗相细胞，在接触细胞毒性化疗药物后均表现出极低甚至无细胞死亡。在进行这些操作时，务必尽可能规范地执行每一步骤，以减少白血病细胞可能出现的任何表型改变。该技术为白血病研究领域的研究人员提供了一种方法，可在体外模型中模拟耐化疗的白血病，该模型更接近骨髓微环境。

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科研

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Medicine

医学

建模化疗耐药白血病<em&gt;体外</em

本视频介绍了将白血病细胞与骨髓基质细胞进行长期二维共培养的技术，用于研究白血病细胞与骨髓微环境之间的相互作用。该二维共培养模型利用急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞或成骨细胞，以观察后者对肿瘤细胞表型的影响。本研究将有助于揭示在化疗药物作用下，骨髓微环境支持白血病细胞存活的相关机制。...

白血病细胞与骨髓基质细胞的二维共培养：一种获取白血病细胞亚群的方法

本视频介绍了一种从二维共培养体系中空间分离三种白血病细胞亚群的方法：悬浮在培养基中自由漂浮的白血病细胞、黏附在间充质基质细胞单层表面的相亮白血病细胞，以及迁移至间充质基质细胞单层下方的相暗白血病细胞。...

白血病亚群收获：一种从二维共培养体系中空间分离白血病细胞亚群的方法

受体酪氨酸激酶在多种癌症中异位表达，并已被确定为急性白血病治疗的靶点。本文描述了一种用于评估酪氨酸激酶抑制剂治疗急性白血病的高效临床前策略。...

急性白血病治疗中酪氨酸激酶抑制剂的临床前评价

我们描述了一种用于原代多发性骨髓瘤细胞的高通量药物敏感性检测方法。该方法包括在多孔板中重建骨髓微环境（包含细胞外基质和基质细胞），以及一种对细胞活力进行纵向定量的非侵入性方法。...

一种用于表征原代多发性骨髓瘤细胞药物敏感性的类器官高通量系统

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外...

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

本文描述了利用体外和体内遗传学方法以及人源化小鼠模型，对c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点进行遗传学和化学验证的实验方案。该方法可广泛应用于任何靶点的遗传学验证及治疗开发。...

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

利用慢病毒shRNA文库进行高通量RNA干扰（RNAi）筛选，可作为发现恶性肿瘤中具有治疗意义的合成致死靶点的工具。我们提供一种基于shRNA文库的筛选方法，用于研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传调控因子。...

利用shRNA文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

本方案提供了从细胞系和新鲜患者样本在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中建立人急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植模型并进行问题排查的逐步操作指南，同时包含使用流式细胞术评估药物反应的指导原则。该实验流程也可根据需要调整用于实体瘤研究。...

快速 体内 利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

本方案描述了患者来源的B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的在卵内 异种移植，该过程发生在注射后4天。...

体内 异种移植患者来源的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞（PDX-ALL）

该方案旨在描述一种基于诱导化疗反应动力学的小鼠急性淋巴细胞白血病复发模型。...

急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

学习利用人骨髓基质细胞与急性淋巴细胞白血病细胞的体外共培养模型，分离并分析化疗耐药的白血病细胞亚群，为研究耐药机制及评估新型治疗策略提供经济高效的研究平台。

建立化疗耐药型白血病模型体外

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