建立化疗耐药型白血病模型 体外

本实验的总体目标是更好地在体外建立耐药性急性淋巴细胞白血病（ALL）的模型。该方法有助于解答关于骨髓微环境如何影响 ALL 细胞对化疗药物产生耐药性的关键问题，从而推动难治性 ALL 的治疗研究。该技术的主要优势在于，与传统的动物模型相比，该方法成本显著更低，且耗时更短，可用于研究药物对难治性 ALL 细胞的作用。

首先，将5至20乘以10的6次方个白血病细胞接种于10毫升肿瘤特异性培养基中，加入至含有80%至90%融合度的骨髓基质细胞或成骨细胞的100毫米培养皿中。每第四天，将培养皿倾斜，吸除除1毫升外的所有培养基，注意不要扰动贴壁细胞层。然后，沿培养皿侧壁的角落逐滴加入9毫升新鲜的白血病细胞培养基，以确保对贴壁细胞的干扰最小。

共培养第12天后，轻轻吹打培养板中的培养基上下混合约5至10次，以收集悬浮的白血病细胞，并将细胞转移至15毫升锥形管中。然后，将细胞重新接种到一个新的培养板上，该培养板含有80%至90%融合度的骨髓基质细胞或成骨细胞，操作方法如前所述。

到第四天时，白血病细胞将形成三个亚群，其中悬浮的白血病细胞自由漂浮于培养基中。相位明亮型白血病细胞附着在贴壁细胞单层的表面，而相位暗淡型白血病细胞则迁移至单层下方。为制备G10珠柱，首先将每根柱所需的30毫升细胞培养基在水浴中重新加热至37摄氏度。

接下来，使用镊子将玻璃棉拉成细而松散的丝状，并为每个所需的层析柱向一个10毫升注射器中添加多层疏松的丝状物。当注射器填充至三分之二满时，将一个处于关闭状态的单向旋塞连接到注射器尖端，并将注射器夹在铁架台上，高度需确保可在旋塞下方放置一个50毫升的锥形收集管。

现在，在注射器柱下方放置一个收集管。使用10毫升移液器将悬浮于PBS中的G10颗粒逐滴加至玻璃棉上方。持续加入G10颗粒，直至形成2毫升的沉淀颗粒。

然后，向柱中加入两份预热的培养基，每份两毫升。缓慢打开旋塞阀，使培养基以逐滴的方式从柱中流出。当10毫升培养基完全流经柱体后，关闭旋塞阀。

弃去穿流液，并在柱下方放置一个新的收集管。为收获悬浮的肿瘤亚群，吸出白血病细胞共培养板中的培养基，并用相同的培养基轻轻冲洗培养板一次。然后，将悬浮的白血病细胞亚群转移至15毫升锥形管中。

为收获相位明亮的肿瘤亚群，向共培养板中加入10毫升新鲜培养基，充分冲洗约五次，冲洗力度需足以去除贴壁的白血病细胞，同时不破坏贴壁细胞单层。随后，将相位明亮的亚群转移至一个独立的15毫升锥形管中。

为收获相位暗型肿瘤亚群，先用一毫升 PBS 洗涤以去除残留培养基，随后在 37 摄氏度条件下用三毫升胰蛋白酶消化使细胞脱落。五分钟后，轻敲培养皿侧壁以松动贴壁细胞，接着加入一毫升胎牛血清（FBS）以终止酶促反应。

然后，用血清冲洗三到五次，以分散任何较大的细胞团块。将未纯化的相位暗细胞亚群转移至新的15毫升锥形管中。当所有亚群收集完毕后，离心沉淀细胞。

将每个沉淀重悬于1毫升预热的培养基中。将旋塞完全关闭后，针对每个亚群，使用1,000微升移液器将全部1毫升细胞悬液逐滴加至已准备好的G10柱顶部，确保细胞保持在G10沉淀的上方或内部。室温下孵育20分钟，使细胞与G10沉淀充分作用。

然后，向柱中加入一到三毫升新鲜的预热培养基。打开活塞，使培养基以逐滴的方式缓慢流出。继续以一到二毫升的增量向柱中添加预热的培养基。

当收集到总共 15 至 20 毫升的白血病细胞后，关闭旋塞并盖上收集管。然后离心细胞，将沉淀重新悬浮于适当的下游分析缓冲液中。在对贴壁细胞层进行胰蛋白酶消化后，通过前向散射与侧向散射分析可观察到两种不同的细胞群体。

经过G10分离后，可获得纯度较高的ALL细胞群体。特别值得注意的是，从骨髓基质细胞或成骨细胞共培养体系中分离得到的所有暗相细胞，在接触细胞毒性化疗药物后均表现出极低甚至无细胞死亡。在进行这些操作时，务必尽可能规范地执行每一步骤，以减少白血病细胞可能出现的任何表型改变。

该技术为白血病研究领域的研究人员提供了一种方法，可在体外模型中模拟耐化疗的白血病，该模型更接近骨髓微环境。