Name: 蛋白表达的定量分析来研究宗族规范小鼠植入前胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜和单细胞分辨率对小鼠植入前胚胎进行蛋白质表达的定量原位分析方法。该技术可高通量检测蛋白质浓度，揭示细胞异质性和谱系规范机制。

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作者感谢Stefano Di Talia、Alberto Puliafito、Venkatraman Seshan和Panagiotis Xenopoulos在数据处理、分析与呈现方面的建议，感谢Berenika Plusa在免疫荧光实验方案设计和抗体测试方面的协助，以及Hadjantonakis实验室成员对本文稿及本实验方案开发提出的宝贵意见。本实验室的工作得到了美国国立卫生研究院R01-HD052115和R01-DK084391项目以及NYSTEM N13G-236项目的资助。

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<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
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<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种对小鼠着床前胚胎进行整体免疫荧光定量分析的方法。首先采用一种可靠的免疫荧光方案22，随后进行高分辨率的整体共聚焦成像，并利用定制软件4进行图像分割。尽管免疫荧光方案的选择并非关键，但我们发现此处所述方案22快速、可靠，且对我们测试过的多种抗体均能产生稳定的信号。只要在相同实验中保持一致性，也可采用其他方案。虽然多种因素会影响单个实验的结果，且实验之间未必能直接比较，但我们发现，在重复实验中力求一致并进行足够数量的技术重复可显著降低变异性。因此，在优化完成后，相同实验之间的固定与免疫标记试剂及方案，以及成像条件均应保持恒定。
该方案实施过程中可能出现的主要问题分为两类：1）染色质量差，信号微弱；2）分割效果不理想，错误较多（即，过分割与欠分割）。免疫荧光质量较低通常源于样本固定不当，或所用抗体不适合整体免疫荧光染色。确保多聚甲醛（PFA）新鲜（either freshly prepared or thawed to RT from -20 ºC no longer than a wee...

小鼠植入前胚胎是研究多能性出现与维持的经典模型 体内以及细胞命运决定研究的模型 从头合成 上皮化在哺乳动物中的发生。哺乳动物发育的着床前阶段致力于建立构成囊胚的三个细胞谱系，即多能性的上胚层（其将发育为大多数体细胞组织和生殖细胞），以及两个胚外谱系——滋养层（TE）和原始内胚层（PrE）。图1A) 1,2本方案描述了以下操作步骤：（1）获取并固定小鼠着床前阶段胚胎；（2）进行免疫荧光染色以标记目标蛋白；（3）利用具备z轴层扫功能的共聚焦显微镜对完整胚胎进行全封片成像；（4）对共聚焦图像进行细胞核分割及后续定量图像分析。该流程可实现对蛋白水平的无偏定量，用于确定细胞身份，进而表征细胞亚群 原位该方案从胚胎收集到数据分析，单窝（通常最多10个鼠胚）可在3至4天内完成。图1B同时分析多窝幼崽会增加成像和数据分析的时间负担，从而延长整个实验方案的总时长。
小鼠植入前阶段胚胎是一种实验上易于操作的体系，因其体积小且具有典型的形态特征 3，非常适合于 整体上 以单细胞分辨率对细胞过程进行成像。为了对具有统计学意义数量的胚胎进行无偏倚的系统水平分析，需要建立一种自动化的定量分析流程。然而，由于囊胚内细胞团（ICM）具有较高的细胞核密度，图1A、2D），传统的图像分割平台无法提供足够的准确性，以建立自动化或半自动化的分析流程。另一方面，尽管手动分割具有较高的准确性，但其无法处理大量细胞和胚胎样本，也不适用于可重复、无偏倚的细胞身份鉴定——这在研究标志物表达模式尚未完全明确的发育阶段时尤为关键。例如，不会在群体中呈现二元分布）。我们近期开发并验证了一种专用于小鼠植入前胚胎及小鼠胚胎干细胞（ESCs）的图像分割方法，该方法具有高准确性，且所需用户输入极少 4-8.
本文介绍的分析流程基于 MATLAB 的图像分割工具——模块化交互式核分割工具（Modular Interactive Nuclear Segmentation, MINS）4。在用户通过图形用户界面（GUI）设定少量图像属性后，MINS 可对大量共聚焦 Z 层图像进行无监督的核分割（表1）4。该流程已被证实可高效生成关于野生型、实验处理及基因修饰胚胎和胚胎干细胞（ESCs）中蛋白质表达与细胞定位的高通量数据5-7。在本实验方案中，我们描述了 MINS 在植入前阶段胚胎图像分割中的应用。关于 MINS 在 ESCs 上性能的示例，请参见文献4,7。自动化的核分割步骤显著降低了细胞识别过程的时间成本，而空间位置与荧光强度的测量则可实现对细胞身份的无偏判定，并生成胚胎中基因表达区域与细胞位置的三维图谱（图1C）。此外，该工作流程具有良好的可扩展性，适用于分析单个产仔批次乃至大量实验处理的胚胎，或具有不同遗传背景的胚胎5,6。MINS 可在&#160;http://katlab-tools.org 免费获取（软件运行需具备 MATLAB 许可证）。
迄今为止，尚无任何方法能够获得关于小鼠植入前胚胎中蛋白质表达和细胞定位的如此深入的数据。此前所有对这类数据进行定量的尝试均局限于手动确定胚胎中不同细胞群体的细胞数量（完全手动或借助软件）9-19。该方法（结合MINS软件）已针对小鼠植入前胚胎和胚胎干细胞（ESCs）进行了优化和验证；尽管尚未在其他高细胞核密度体系中进行测试，但预计其表现将与之相当。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;胚胎收集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于检查栓塞的钝头探针</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德玻璃吸管</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>预组装吸液管 &amp;和吹嘴</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>更长的橡胶管</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>家族性偏瘫型偏头痛</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>酸性Tyrode溶液</td><td>默克密理博</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>4孔板</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;免疫荧光&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R&amp;研发</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-9053</td><td>1:100，固定10分钟</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-1237</td><td>1:100，过夜固定</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R&amp;研发</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-5279</td><td>1:100，固定10分钟至过夜</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>二抗</td><td>Life Technologies</td><td>各种</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;分割&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>运行 64 位 Windows 操作系统的计算机</td><td></td><td>n/a</td><td>在 http://katlab-tools.org 和 Lou 等（2014）《Stem Cell Reports》中核实最低系统要求</td></tr><tr><td>MATLAB（软件）</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS（软件）</td><td>免费</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位 蛋白质表达分析用于研究谱系特化 在小鼠植入前胚胎中的应用。本文描述了胚胎收集、免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像以及图像分割与分析所需的各项步骤。该方法可对胚胎中所有细胞的多种核标志物表达水平及空间（XYZ）坐标进行定量分析。本方法利用MINS——一种专为分析植入前胚胎和胚胎干细胞（ESC）集落的共聚焦图像而开发的图像分割软件工具。MINS可在X、Y和Z维度上实现无需人工监督的核分割，仅需极少的用户输入，即可提供细胞在三维空间中的位置信息以及各通道的核荧光强度数据。尽管本实验方案已针对小鼠植入前胚胎图像的分析进行了优化，但也可便捷地适用于其他具有较高信噪比、且高核密度对图像分割构成挑战的样本分析例如.，胚胎干细胞（ESC）集落的表达分析，培养中分化细胞，其他物种或发育阶段的胚胎 等等。).

为便于数据分析与展示，在收集和操作胚胎时应小心避免损伤，以确保所有细胞及其相对位置均可被分析。图2A - D展示了不同发育阶段具有扩张腔的完整胚泡示例。若发生损伤，在分析和解释结果时应格外谨慎。
使用本方案所获得数据的质量和可靠性取决于固定液的质量以及用于检测目标蛋白的抗体的信噪比。在开始一系列实验之前，务必使用新鲜的固定液，并对新抗体进行测试，同时设置适当的阳性和阴性对照。图2A展示了多种核蛋白的优质抗体示例。图2B展示了用于细胞质蛋白（DAB2）的一种优质抗体示例。图2C展示了一种染色效果较差的情况，其信噪比较低，该样本仅固定了10分钟。在此情况下，用于GATA4的抗体（Santa Cruz，sc-1237）需要过夜固定才能获得强信号（参见24中使用该抗体对过夜固定的胚胎进行染色的实例）。在后...

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位 分析蛋白质表达以研究小鼠植入前胚胎的谱系特化。本文描述了囊胚收集、蛋白质全胚免疫荧光检测、共聚焦显微镜样品成像以及核分割与图像分析所需的各项操作步骤。

本方案介绍了一种对小鼠中细胞谱系特化进行研究的定量单细胞原位蛋白质表达分析方法。

本实验方案的总体目标是原位定量小鼠植入前胚胎中的蛋白质水平。因此，该方法使我们能够以半自动化的方式，对共聚焦显微镜图像进行高通量分析，并达到单细胞分辨率。该方法可用于在共聚焦图像上定量蛋白质浓度，尤其适用于细胞核密度较高，以及需要研究细胞群体内异质性的情况。首先，使用明火加热玻璃巴斯德吸管，使其尖端拉制成毛细管末端。轻轻将吸管远端在毛细管上摩擦，使其断裂并形成钝端。在选定的胚胎发育时间点处死一只怀孕雌鼠后，按照文本方案暴露腹腔内脏，找到子宫。握住宫颈端，剪开宫颈，轻轻上提以拉伸两侧子宫角。去除其周围的脂肪组织，注意不要刺破子宫壁。在输卵管上方、卵巢下方剪断，完整取出整个子宫，置于培养皿中。接下来，用 PBS 覆盖子宫，并从宫颈两侧近端切断，分离两侧子宫角。然后在连接部位下方剪断子宫与每侧输卵管之间的峡部，将每侧输卵管与子宫分离。在解剖显微镜下，使用带皮下注射针头的 1 mL 注射器，从宫颈开口处向每个子宫角注入 0.5–1 mL 操作液，将胚泡冲出子宫并进入操作培养基中。冲出后，让囊胚在培养皿底部沉降一到两分钟。然后找到囊胚，使用带毛细管末端的口控玻璃巴斯德吸管收集囊胚，并转移至一滴新鲜培养液中。清洗囊胚后，用酸性泰罗德溶液短暂洗涤胚胎，以去除透明带。一旦透明带不可见，立即将囊胚转移回操作培养基中。用室温的PBS洗涤囊胚，并将其转移至含4%多聚甲醛（PFA）的PBS中，在室温下固定10分钟。固定后，将囊胚重新转移至PBS中，于4摄氏度保存。按照文本中的方案完成免疫荧光操作后，使用细口移液器在35 mm玻璃底培养皿的玻璃表面滴加少量PBS或细胞核染色液，然后用矿物油覆盖。将胚胎放入这些微滴中，并以一致的方式排列，最好使内细胞团（ICM）腔面平行于玻璃表面，随后将培养皿安装到显微镜载物台上。进行共聚焦成像时，应使用能够获得较强信噪比且不导致荧光染料漂白的最低激光功率。调节增益和偏移，以获得最宽的动态范围，同时避免样本曝光过度。捕获大部分或全部灰度范围将有助于检测图像间微小的强度差异。请遵循文本方案中概述的其他详细步骤，对胚胎沿整个Z轴进行成像。按照基于 MATLAB 的分割工具 Modular Interactive Nuclear Segmentation（MINS）的图形用户界面操作，加载共聚焦显微镜生成的单张图像或完整的原始 Z 轴层叠数据。如需查看每一步的结果，请点击相应的“查看”按钮。按钮上方的黄色标签表示操作正在进行中。绿色标签表示操作已完成。在进行分割之前，评估检测步骤的结果。如果结果不理想，请修改检测参数并重新运行。在“批量模式运行”菜单中，点击“添加文件”并一次性加载所有需要处理的文件。点击“开始批量模式运行”，并留出足够时间让软件处理这些文件。分割结果将保存在原始文件所在的同一目录中。识别假阳性，例如凋亡小泡或其他非完整细胞核但可能被MINS误判为完整细胞核的成分。从starstatistics.csv文件中删除对应假阳性的记录。为便于日后参考，请保留原始的 starstatistics.csv 文件，并仅编辑其副本。若某个细胞核被过度分割并显示为两个或多个细胞核，可通过取其平均荧光强度合并记录，或保留该细胞的一个记录并删除其余记录。为解决分割不足的问题，需识别MINS未能检测到两个或多个细胞核之间边界而将其分割为单个细胞核的事件，或未能检测到某个细胞核的情况。使用ImageJ测量分割不足或未分割细胞中各通道的平均灰度值。接着，在DNA通道中找到分割不足或未分割细胞核的中层切面，利用套索工具勾勒出该细胞核的轮廓。然后，按 Control+M，或转到“分析”菜单并选择“测量”。这将记录所划定区域的平均灰度值，并在新窗口中显示。使用在 DNA 通道中刚刚选定的相同划定区域，重复测量每个感兴趣的荧光通道。结果将追加到测量结果窗口中前一次的结果之后。然后使用获得的测量数据替换 starstatistics.csv 文件中的错误记录。如果细胞核被欠分割，则复制其所在行，为每个新细胞分配不同的细胞编号，并在对应列中填入在 ImageJ 中测得的数值。在此情况下，两个细胞将共享相同的空间坐标。当有丝分裂的细胞核需要在分析中单独考虑时，应手动计数并将其信息添加到数据文件中。有关额外的图像处理说明，请参考文本版实验方案。该图展示了囊腔扩张的不同阶段完整胚泡的示例。图中显示了多种核蛋白的优质抗体示例，包括 CDX2、GATA4、GATA6、NANOG 和 OCT4。该样品用细胞质蛋白 DAB2 进行标记，具有较高的信噪比。本图中展示了 GATA4 染色效果不佳的示例，信噪比较低，原因是样品仅固定了 10 分钟。该抗 GATA4 抗体需要过夜固定才能获得强信号。这些胚胎使用 40 倍油镜物镜（数值孔径 NA 为 1.30，工作距离为 0.21 mm）进行成像。中间图显示了内细胞团（ICM）或单个细胞核的放大图像，可分辨出它们之间的边界。底部图示说明了胚胎发育越成熟，细胞核密度越高，因此分割错误的可能性也越大。这些图像展示了MINS可能出现的错误，例如将凋亡的细胞核误判为活细胞、过度分割或分割不足。该系列Z层切片揭示了一个分割不足的事件，其中两个细胞被识别为一个细胞。一旦掌握，该方案从开始到结束可在三至四天内完成，每天需投入两至四小时。在执行该操作过程中，务必注意实验条件的一致性，即免疫荧光方案和成像参数应保持一致。该技术建立后，为小鼠发育生物学领域的研究人员提供了在单细胞水平上对基因和蛋白质表达进行原位定量分析的途径。观看本视频后，您将充分了解如何获取适用于定量原位表达分析的图像数据。

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