蛋白表达的定量分析来研究宗族规范小鼠植入前胚胎
February 22nd, 2016
该协议提出对蛋白质表达的原位分析进行定量，单细胞研究在小鼠植入前胚胎沿袭规范的方法。必要的囊胚的汇编程序，整个安装蛋白的免疫检测，在一个共焦显微镜，和核分割和图像分析的样品的成像进行描述。
该方案的总体目标是量化小鼠植入前胚胎中的原位蛋白质水平。因此，这种方法使我们能够以半自动化方式对具有单细胞分辨率的共聚焦显微镜图像进行高通量分析。该方法可用于量化共聚焦图像上的蛋白质浓度，其中核密度高，并且想要研究细胞群内的异质性。
首先，在玻璃巴斯德移液管上使用明火在尖端绘制毛细管末端。轻轻地将移液器的远端摩擦毛细管，使其断裂，同时形成钝端。在所需的胚胎发育日处死怀孕的雌性小鼠后，根据文本方案暴露腹部内脏并定位子宫。
握住宫颈端，切开子宫颈，轻轻向上拉以伸展两个子宫角。修剪掉它的脂肪，注意不要刺穿子宫壁。切开输卵管上方，卵巢下方，以释放整个子宫，并放在培养皿上。
接下来，用 PBS 覆盖子宫，并通过切开子宫颈两侧的近端来分离两个子宫角。然后通过在连接它们的峡部下方切开每个输卵管与子宫分开。在解剖显微镜下，使用带有皮下注射针头的 1 mL 注射器将囊胚从子宫冲洗出并放入作培养基中，方法是将 0.5-1 mL 培养基从宫颈口穿过每个角。
冲洗后，等待 1 到 2 分钟，让囊胚沉到培养皿底部。然后找到囊胚，并使用带有毛细管末端的口控玻璃巴斯德移液管，收集囊胚并转移到新鲜的培养基滴中。冲洗囊胚后，使用 Acidic Tyrode 溶液短暂清洗胚胎，去除透明带。
一旦带不再可见，就将囊胚转移回作培养基中。在室温 PBS 中洗涤囊胚，并在室温下转印到 4% PFA 的 PBS 溶液中 10 分钟以固定它们。固定后，将囊胚转移回 PBS 中，在 4 摄氏度下储存。
根据文本方案进行 imunoflourescence 后，使用细口移液器在 35 mm 玻璃底培养皿的玻璃表面上制备 PBS 或核染色溶液的微滴，并用矿物油覆盖它们。将胚胎放入微滴中并以一致的方式排列，最好使 ICM 腔通道平行于玻璃表面，然后将培养皿放在显微镜支架上。要进行共聚焦成像，请使用最低的激光功率，该激光功率可提供较强的信噪比，而不会漂白荧光团。
调整增益和偏移设置以获得最宽的动态范围，而不会过度曝光采样。捕获大部分或整个灰度范围将有助于检测图像之间强度的微小差异。按照文本协议中概述的其他细节，在整个 Z 轴上对胚胎进行成像。
按照基于 MATLAB 的分割工具模块化交互式核分割 （MINS） 的图形用户界面，加载显微镜生成的共聚焦图像或整个 Z 堆栈的原始数据。要查看每个步骤的结果，请单击相应的 View "按钮。按钮上方的黄色标签表示正在进行的作。
绿色标签表示作已完成。在继续分段之前，请评估检测步骤的结果。如果不满意，请修改检测参数并重新执行。
在批处理模式的"运行菜单中，单击添加文件并一次性加载所有要处理的文件。单击 Start Batch Mode Run"，并留出时间让软件处理文件。分段输出将保存在与原始文件相同的目录中。
识别假阳性，例如凋亡囊泡或其他不是完整细胞核但可能已被 MINS 识别的元件。从 starstatistics 中删除相应的误报记录。CSV 文件。
保留原始 starstatistics. csv 文件以供将来参考，并仅编辑该文件的副本。如果一个细胞核被过度分割并呈现为两个或多个细胞核，则通过平均其强度水平来合并记录，或者保留该细胞的一条记录并丢弃其余记录。
要解决分割不足的问题，请识别 MINS 未能检测到两个或多个细胞核之间的边界并将其分割为单个细胞核的事件，或者完全无法检测到细胞核的事件。使用 ImageJ 测量下分段或未分段单元格中每个通道的平均灰度。接下来，在 DNA 通道上找到下分节或未分节细胞核的内侧部分，使用徒手选择工具，勾勒出下分界或未分节细胞核的周边。
然后，按 Control M"或转到"分析"菜单并选择"测量"这将记录轮廓区域的平均灰度值并将其显示在新窗口中。使用刚刚在 DNA 通道中选择的相同轮廓区域，重复测量每个感兴趣的荧光通道。结果将在测量结果窗口中颠倒为前一个结果。
然后使用获得的测量值替换 starstatistics. csv 文件中的错误记录。如果细胞核已被下分段，则复制其行，为每个新细胞分配不同的单元格 ID，并在相应列下引入 ImageJ 中获得的值。
在这种情况下，两个像元将共享空间坐标。当在分析中单独考虑有丝分裂细胞核时，请手动对它们进行评分并将信息添加到数据文件中。有关其他图像处理说明，请参阅文本协议。
该图显示了不同阶段具有扩大腔的完整囊胚的示例。此处显示的是针对多种核蛋白的良好抗体示例，包括 CDX2、GATA4、GATA6、NANOG 和 OCT4。该样品用细胞质蛋白 DAB2 标记，该蛋白具有高信噪比。
在该图中，显示了信噪比低的 GATA4 不良染色示例，其中样品仅固定 10 分钟。这种特殊的抗 GATA4 抗体需要过夜固定才能提供强信号。这些胚胎使用 40 倍油浸物镜进行成像，NA 为 1.30，工作距离为 0.21 mm中间面板显示了 ICM 或单个细胞核的放大倍率，可以区分它们之间的边界。
底部面板说明了胚胎越先进，核密度越高，因此分割误差的可能性就越大。这些图像显示了 MINS 可能犯的错误，例如将凋亡细胞核检测为活细胞、过度分割或分割不足。此 Z 切片序列揭示了一个 undersegmentation 事件，其中两个单元格被识别为 1。
一旦掌握，该方案可以从头到尾在 3 到 4 天内完成，每天的时间负担为 2 到 4 小时。在执行此程序时，重要的是要记住与实验条件非常一致，即免疫荧光方案和成像参数。开发后，该技术为小鼠发育生物学领域的研究人员对单细胞中的基因和蛋白质表达进行原位定量分析铺平了道路。
观看此视频后，您将对如何获取适合定量原位表达分析的图像数据有很好的了解。
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概述
该协议介绍了一种方法，用于执行定量、单细胞原位分析蛋白质表达，以研究小鼠植入前胚胎的谱系规定。该方法允许对共聚焦显微镜图像进行具有单细胞分辨率的高通量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 原位定量蛋白质水平对于理解胚胎发育至关重要。
- 单细胞分辨率有助于研究细胞群体内的异质性。
- 共聚焦显微镜是成像细胞结构的强大工具。
- 该方法适用于小鼠植入前胚胎。
研究目的
- 定量小鼠植入前胚胎中的蛋白质浓度。
- 分析早期发育过程中的谱系规定。
- 增强对胚胎组织中细胞异质性的理解。
使用的方法
- 从孕鼠中收集囊胚。
- 全胚胎免疫荧光检测蛋白质。
- 使用共聚焦显微镜对样品进行成像。
- 核分割和图像分析用于定量。
主要结果
- 成功地以单细胞分辨率定量蛋白质水平。
- 识别植入前胚胎中的蛋白质表达模式。
- 洞察早期发育过程中的谱系规定。
- 展示了该方法的高通量能力。
结论
- 该方法为研究胚胎中的蛋白质表达提供了一种稳健的方法。
- 它促进了对细胞水平发育过程的理解。
- 该协议可以适应用于各种感兴趣的蛋白质。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell protein expression analysis in preimplantation embryos enables mechanistic de-risking of lineage specification hypotheses. This approach supports target validation by providing spatially resolved, quantitative data on nuclear markers critical for early developmental pathways. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking molecular heterogeneity to cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitation of multiple nuclear markers and their spatial coordinates in intact embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein expression patterns associated with lineage specification events.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating high-resolution, reproducible data on target engagement in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantitative nuclear fluorescence readouts for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized imaging and segmentation workflows that reduce variability in high nuclear density samples.
- Scalability: Supports platform reuse across embryonic stem cell colonies, differentiating cultures, and cross-species embryos with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression dynamics to preclinical validation through spatial and quantitative phenotyping.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in lineage commitment models by resolving heterogeneities within cell populations at single-cell resolution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing objective thresholds for protein co-expression and localization in developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven quantification of protein expression prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through unsupervised nuclear segmentation and multi-channel fluorescence quantification.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs suitable for evaluating compound effects on embryonic protein expression networks.
- Analytics: Generates spatial (XYZ) coordinates and nuclear fluorescence levels per channel, enabling statistical comparison of expression states across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking protein expression patterns to lineage specification in disease-relevant developmental models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging and analysis capability for studying cellular heterogeneity in diverse preclinical systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early lineage decisions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated segmentation and minimal user input via MINS software.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, spatially resolved protein expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence, and nuclear segmentation software.
- Depends on access to laser scanning confocal microscopes and MATLAB-based MINS tool for 3D image analysis.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for varying nuclear density and signal-to-noise ratios across model systems.
- Limited by sample availability and the need for optimization when applying to non-embryonic or low-abundance targets.
