小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

本实验方案的总体目标是原位定量小鼠植入前胚胎中的蛋白质水平。因此，该方法使我们能够以半自动化的方式，对共聚焦显微镜图像进行高通量分析，并达到单细胞分辨率。该方法可用于在共聚焦图像上定量蛋白质浓度，尤其适用于细胞核密度较高，以及需要研究细胞群体内异质性的情况。

首先，使用明火加热玻璃巴斯德吸管，使其尖端拉制成毛细管末端。轻轻将吸管远端在毛细管上摩擦，使其断裂并形成钝端。在选定的胚胎发育时间点处死一只怀孕雌鼠后，按照文本方案暴露腹腔内脏，找到子宫。

握住宫颈端，剪开宫颈，轻轻上提以拉伸两侧子宫角。去除其周围的脂肪组织，注意不要刺破子宫壁。在输卵管上方、卵巢下方剪断，完整取出整个子宫，置于培养皿中。

接下来，用 PBS 覆盖子宫，并从宫颈两侧近端切断，分离两侧子宫角。然后在连接部位下方剪断子宫与每侧输卵管之间的峡部，将每侧输卵管与子宫分离。在解剖显微镜下，使用带皮下注射针头的 1 mL 注射器，从宫颈开口处向每个子宫角注入 0.5–1 mL 操作液，将胚泡冲出子宫并进入操作培养基中。

冲出后，让囊胚在培养皿底部沉降一到两分钟。然后找到囊胚，使用带毛细管末端的口控玻璃巴斯德吸管收集囊胚，并转移至一滴新鲜培养液中。清洗囊胚后，用酸性泰罗德溶液短暂洗涤胚胎，以去除透明带。

一旦透明带不可见，立即将囊胚转移回操作培养基中。用室温的PBS洗涤囊胚，并将其转移至含4%多聚甲醛（PFA）的PBS中，在室温下固定10分钟。固定后，将囊胚重新转移至PBS中，于4摄氏度保存。

按照文本中的方案完成免疫荧光操作后，使用细口移液器在35 mm玻璃底培养皿的玻璃表面滴加少量PBS或细胞核染色液，然后用矿物油覆盖。将胚胎放入这些微滴中，并以一致的方式排列，最好使内细胞团（ICM）腔面平行于玻璃表面，随后将培养皿安装到显微镜载物台上。进行共聚焦成像时，应使用能够获得较强信噪比且不导致荧光染料漂白的最低激光功率。

调节增益和偏移，以获得最宽的动态范围，同时避免样本曝光过度。捕获大部分或全部灰度范围将有助于检测图像间微小的强度差异。请遵循文本方案中概述的其他详细步骤，对胚胎沿整个Z轴进行成像。

按照基于 MATLAB 的分割工具 Modular Interactive Nuclear Segmentation（MINS）的图形用户界面操作，加载共聚焦显微镜生成的单张图像或完整的原始 Z 轴层叠数据。如需查看每一步的结果，请点击相应的“查看”按钮。按钮上方的黄色标签表示操作正在进行中。

绿色标签表示操作已完成。在进行分割之前，评估检测步骤的结果。如果结果不理想，请修改检测参数并重新运行。

在“批量模式运行”菜单中，点击“添加文件”并一次性加载所有需要处理的文件。点击“开始批量模式运行”，并留出足够时间让软件处理这些文件。分割结果将保存在原始文件所在的同一目录中。

识别假阳性，例如凋亡小泡或其他非完整细胞核但可能被MINS误判为完整细胞核的成分。从starstatistics.csv文件中删除对应假阳性的记录。

为便于日后参考，请保留原始的 starstatistics.csv 文件，并仅编辑其副本。若某个细胞核被过度分割并显示为两个或多个细胞核，可通过取其平均荧光强度合并记录，或保留该细胞的一个记录并删除其余记录。

为解决分割不足的问题，需识别MINS未能检测到两个或多个细胞核之间边界而将其分割为单个细胞核的事件，或未能检测到某个细胞核的情况。使用ImageJ测量分割不足或未分割细胞中各通道的平均灰度值。接着，在DNA通道中找到分割不足或未分割细胞核的中层切面，利用套索工具勾勒出该细胞核的轮廓。

然后，按 Control+M，或转到“分析”菜单并选择“测量”。这将记录所划定区域的平均灰度值，并在新窗口中显示。使用在 DNA 通道中刚刚选定的相同划定区域，重复测量每个感兴趣的荧光通道。结果将追加到测量结果窗口中前一次的结果之后。

然后使用获得的测量数据替换 starstatistics.csv 文件中的错误记录。如果细胞核被欠分割，则复制其所在行，为每个新细胞分配不同的细胞编号，并在对应列中填入在 ImageJ 中测得的数值。

在此情况下，两个细胞将共享相同的空间坐标。当有丝分裂的细胞核需要在分析中单独考虑时，应手动计数并将其信息添加到数据文件中。有关额外的图像处理说明，请参考文本版实验方案。

该图展示了囊腔扩张的不同阶段完整胚泡的示例。图中显示了多种核蛋白的优质抗体示例，包括 CDX2、GATA4、GATA6、NANOG 和 OCT4。该样品用细胞质蛋白 DAB2 进行标记，具有较高的信噪比。

本图中展示了 GATA4 染色效果不佳的示例，信噪比较低，原因是样品仅固定了 10 分钟。该抗 GATA4 抗体需要过夜固定才能获得强信号。这些胚胎使用 40 倍油镜物镜（数值孔径 NA 为 1.30，工作距离为 0.21 mm）进行成像。中间图显示了内细胞团（ICM）或单个细胞核的放大图像，可分辨出它们之间的边界。

底部图示说明了胚胎发育越成熟，细胞核密度越高，因此分割错误的可能性也越大。这些图像展示了MINS可能出现的错误，例如将凋亡的细胞核误判为活细胞、过度分割或分割不足。该系列Z层切片揭示了一个分割不足的事件，其中两个细胞被识别为一个细胞。

一旦掌握，该方案从开始到结束可在三至四天内完成，每天需投入两至四小时。在执行该操作过程中，务必注意实验条件的一致性，即免疫荧光方案和成像参数应保持一致。该技术建立后，为小鼠发育生物学领域的研究人员提供了在单细胞水平上对基因和蛋白质表达进行原位定量分析的途径。

观看本视频后，您将充分了解如何获取适用于定量原位表达分析的图像数据。