时间推移视频显微镜对EYFP-Parkin的聚集性评估作为蜂窝Mitophagy一个标记

这种延时视频显微镜的总体目标是追踪线粒体自噬过程中 Parkin 介导的受损线粒体的选择性去除。这种方法可以帮助回答分子代谢领域的关键问题，例如线粒体自噬如何影响持久的病理状况。这项技术的主要优点是它提供了一个非常强大的工具，用于跟踪标记蛋白质在其分子过程中的动力学。

这种方法可以提供对线粒体生命周期的见解。它也可以应用于其他系统，例如原代细胞培养、胚胎学研究和预测优先级。本研究中使用的永生化小鼠胚胎成纤维细胞在 37 摄氏度的 10 厘米组织培养板上，在含有 5% 二氧化碳的潮湿气氛中在 10 厘米的组织培养板上生长。

当细胞达到 80% 汇合时，通过无菌抽吸丢弃培养基，并加入 10 毫升无菌 PBS。去除 PBS，加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将板在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 分钟，直到细胞分离。

加入 4 mL 完全 DMEM 培养基，然后重新悬浮细胞。取出 10 微升细胞悬液，用血细胞计数器计数。将 10 到 6 个细胞接种到 10 厘米的组织培养皿中，并孵育 24 小时。

第二天，用 PBS 洗涤细胞一次，然后通过胰蛋白酶消化分离细胞，如前所述。加入 4 mL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞，并将细胞悬液转移至 15 mL 试管中。在 250 克和 4 摄氏度下离心细胞 5 分钟。

弃去上清液，将沉淀重新悬浮在一毫升无菌 PBS 中。再次旋转单元格。第二次旋转后弃去上清液。

将 100 微升用于电穿孔的溶液混合物添加到细胞沉淀中，然后通过移液轻轻重新悬浮沉淀。然后向细胞悬液中加入 2 μg EYFP Parkin 表达质粒和 1 μg DsRed2 Mito 表达质粒。使用一次性巴斯德移液器将溶液转移到无菌比色皿中。

使用预设程序对细胞进行电穿孔。电穿孔后，立即向细胞中加入 500 μL 新鲜的预热完全 DMEM 培养基，并将细胞接种在 6 厘米处。实时成像级组织培养板。

将细胞置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的潮湿环境中孵育 24 小时。在开始此过程之前，将显微镜室的温度设置为 37 摄氏度。接下来，通过混合以下不含苯酚的 DMEM 制备特定的活成像培养基，补充有 10% FBS、每升 2 毫摩尔的 L-谷氨酰胺、每毫升 100 单位的青霉素和 100 毫克/毫升链霉素。

在水浴中将培养基预热至 37 摄氏度。通过无菌抽吸丢弃电细胞的培养基，并加入一毫升预热的活成像培养基。将板在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。

在确认显微镜的腔室处于 37 摄氏度的稳定温度后。将 5% 的二氧化碳流入腔室。小心地，不要大的移动或振荡，将带有电穿孔单元的板放入显微镜的腔室中。

使用软件界面，设置显微镜以检测来自 EYFP Parkin 和 DsRed2 Mito 表达载体编码的融合蛋白的荧光信号。打开延时视频显微镜软件。在上方菜单中，为 EYFP Parkin 选择 FITC，为 DsRed2 Mito 选择 Rhodamine。

选择 20 倍的放大倍率。使用软件界面，寻找表达两种共转染载体的单个细胞并配准位置。对于每个实验条件，至少对 10 个细胞执行此作。

选择菜单 Apps，然后单击 Multi Dimensional Acquisition。在 Multi Dimensional Acquisition 窗口中，选择所需的参数，例如采集次数、每次采集之间的时间间隔以及记录的单元格的位置。单击 Acquire，开始对两种荧光信号进行基础采集。

每 5 分钟收集一次图像，总间隔为 15 分钟。在进行图像采集时，准备预热的实时成像培养基，其中含有羰基氰化物 4 三氟氧基甲氧基苯腙或 FCCP，其浓度是最终工作浓度的两倍。中断采集过程，将 1 毫升预热的含 FCCP 的实时成像培养基轻轻加入显微镜腔室内的板中。

添加 FCCP 后，在重新开始图像采集之前重新聚焦显微镜非常重要。如前所述重新启动采集过程，并使用记录的位置收集总共三个小时的图像。图像采集完成后，保存所有采集的图像以供以后分析。

此处显示的是 FCCP 给药前成纤维细胞中 EYFP-Parkin 和 DsRED2-Mito 荧光信号的延时图像。白色框表示右侧各个面板的放大区域。在基础时间点，以绿色显示的 EYFP-Parkin 在整个细胞中均匀扩散。

粒体网络（以红色显示）似乎相互关联良好，如白色箭头所示。FCCP 给药后，在 5 分钟时观察到由于膜去极化引起的线粒体分级。然而，EYFP-Parkin 仍然均匀地扩散在整个细胞质中。

在 FCCP 给药后 55 分钟，EYFP-Parkin 被募集到受损的线粒体膜上以触发线粒体自噬过程。FCCP 给药后 EYFP-Parkin 向线粒体膜的运动显示在这部具有代表性的延时电影中。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。

开发后，这项技术为自噬实验线粒体回收领域的研究人员铺平了道路。允许细胞研究线粒体自噬过程作为细胞中的线粒体质量控制。