延时视频显微镜用于评估EYFP-Parkin聚集作为细胞有丝分裂吞噬的标志物

本时间延时视频显微技术的总体目标是追踪线粒体自噬过程中由 Parkin 介导的选择性清除受损线粒体的过程。该方法有助于解答分子代谢领域中的关键科学问题，例如线粒体自噬如何影响持续性的病理状态。该技术的主要优势在于，它为动态追踪标记蛋白在其分子过程中的行为提供了极为强大的工具。

该方法可深入了解线粒体的生命周期，也可应用于其他系统，如原代细胞培养、胚胎学研究以及优先级预测。本研究中使用的永生化小鼠胚胎成纤维细胞在含有5%二氧化碳的湿润环境中，于37摄氏度下，接种于10厘米组织培养皿中的完全DMEM培养基中进行培养。

当细胞达到 80% 融合度时，通过无菌抽吸弃去培养基，并加入 10 毫升无菌 PBS。移除 PBS，加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将培养板在 37 °C 下孵育 2 至 3 分钟，直至细胞脱落。

加入 4 mL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞。取 10 µL 细胞悬液，用血细胞计数板进行计数。将 1 × 10⁶ 个细胞接种至 10 cm 组织培养皿中，培养 24 小时。

次日，用 PBS 洗涤细胞一次，并按前述方法通过胰酶消化使细胞脱离。加入 4 毫升完全 DMEM 培养基，重悬细胞，将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。在 250 ×g 及 4°C 条件下离心 5 分钟。

弃去上清液，并将沉淀重悬于一毫升无菌 PBS 中。再次离心细胞。第二次离心后弃去上清液。

向电穿孔溶液混合物中加入100微升至细胞沉淀中，并用移液器轻轻吹打重悬沉淀。然后向细胞悬液中加入2微克EYFP Parkin表达质粒和1微克DsRed2 Mito表达质粒。使用一次性巴斯德吸管将溶液转移至无菌比色杯中。

使用预设程序对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即向细胞中加入 500 µL 新鲜预热的完全 DMEM 培养基，并将细胞接种至一个六厘米的活细胞成像级组织培养板中。

将细胞置于含5%二氧化碳的湿润环境中，37摄氏度培养24小时。在开始此操作前，将显微镜培养室的温度设定为37摄氏度。接着，通过混合以下成分制备特定的活细胞成像培养基：不含酚红的DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、2毫摩尔/升L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素。

将培养基在37摄氏度的水浴中预热。通过无菌抽吸弃去电穿孔细胞的培养基，并加入1毫升预热的活细胞成像培养基。在37摄氏度下孵育培养板30分钟。

确认显微镜腔室温度已稳定在 37 摄氏度后，向腔室内通入 5% 二氧化碳。小心地、避免大幅移动或振荡，将含有电穿孔细胞的培养板放入显微镜的腔室内。

使用软件界面设置显微镜，以检测由 EYFP Parkin 和 DsRed2 Mito 表达载体编码的融合蛋白产生的荧光信号。打开延时视频显微软件。在顶部菜单中，为 EYFP Parkin 选择 FITC，为 DsRed2 Mito 选择 Rhodamine。

选择20倍放大倍数。通过软件界面，寻找同时表达两种共转染载体的单个细胞，并记录其位置。每种实验条件至少对10个细胞进行操作。

选择菜单“Apps”，然后点击“Multi Dimensional Acquisition”。在“Multi Dimensional Acquisition”窗口中，选择所需的参数，例如采集次数、每次采集之间的时间间隔以及记录细胞的位置。点击“Acquire”以开始对两种荧光信号进行基础采集。

每5分钟采集一次图像，总时长为15分钟。在图像采集过程中，准备预热的活细胞成像培养基，其中含有浓度为最终工作浓度两倍的羰基氰化物-4-三氟甲氧基苯腙（Carbonyl Cyanide 4-trifluoromethoxy phenylhydrazone，FCCP）。暂停采集过程，轻轻向显微镜腔室内的培养板中加入1毫升含FCCP的预热活细胞成像培养基。

加入FCCP后，在重新启动图像采集之前，必须重新对显微镜进行聚焦。按照之前所述方法重新启动采集过程，并使用记录的位置连续采集图像，总时长为三小时。图像采集完成后，保存所有获取的图像以供后续分析。

此处显示的是给予 FCCP 前成纤维细胞中 EYFP-Parkin 与 DsRED2-Mito 荧光信号的时间延时图像。白色框表示右侧对应图中放大区域。在基础时间点期间，绿色显示的 EYFP-Parkin 均匀弥散分布于整个细胞中。

红色显示的线粒体网络似乎具有良好的相互连接性，如白色箭头所示。加入FCCP后五分钟，可观察到由于膜去极化导致的线粒体碎片化现象。然而，EYFP-Parkin 仍均匀地弥散分布在细胞质中。

在施加 FCCP 后 55 分钟，EYFP-Parkin 被招募至受损的线粒体膜，以启动线粒体自噬过程。本代表性延时录像展示了施加 FCCP 后 EYFP-Parkin 向线粒体膜的移动。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在两小时内完成。

该技术问世后，为自噬领域研究人员开展线粒体回收实验铺平了道路，使细胞能够将线粒体自噬过程作为细胞内线粒体质量控制机制进行研究。