从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本实验的主要目标是从缺血小鼠脑组织中分离免疫细胞，并通过多参数流式细胞术对其进行定量和表型特征分析。利用多色流式细胞术分析脑组织缺血后的炎症反应，有助于深入理解参与病灶进展、修复过程以及卒中总体预后的免疫学机制。该方法的主要优势在于采用快速、一步式密度梯度离心法，能够从缺血小鼠脑组织中分离出大量具有活性的免疫细胞。

该技术的应用旨在识别和验证可在更宽时间窗内应用于中风的新型免疫调节治疗策略。首先，将蠕动灌注泵管的一端浸入冰冷的无钙无镁HBSS溶液中，将一根钝头23号针头固定在管子的另一端。

然后启动泵，用HBSS完全充满管路。接下来，将已处死的小鼠背侧朝下放置在嵌于塑料托盘中的解剖板上，并用20号针头将前肢和后肢的脚掌尽可能向外固定。使用一对直的双齿镊夹住腹部皮肤，用锋利的虹膜剪沿侧方切开皮肤和腹壁，以暴露肝脏。

然后抬起胸骨，使用一对锐钝型虹膜剪的钝端切开膈肌。继续沿两侧从尾侧向头侧方向剪开肋骨 cage，注意不要损伤肺、心脏和胸主动脉，并用钝头镊子将皮肤瓣展开。将皮瓣用针固定在解剖板上，仔细分离心脏与结缔组织。

用钝头镊子夹住心脏，将灌注管末端的23号针头插入左心室心尖处，注意避免损伤室间隔。使用锋利的虹膜剪剪开右心房，立即启动泵，注意避免泵内产生气泡。当肝脏变为浅咖啡色时，用直手术剪在颅骨后方剪断小鼠头部。

然后使用虹膜剪在头皮正中做一纵行切口。当颅骨暴露后，将锐利的虹膜剪的一侧尖端插入枕骨大孔，向侧方在颅骨上做切口。在对侧重复相同操作。

然后使用锋利的虹膜剪从同一腔体沿中线向上朝鼻部方向小心剪开。用精细镊子轻轻剥离每个脑半球的颅骨。接着用刮勺将脑组织抬起，并使用锋利的虹膜剪仔细分离固定脑组织至颅骨的脑神经纤维。

将脑组织放入一个15毫升的离心管中，管内含有10毫升预冷的含钙和镁的HBSS溶液。为了将脑组织解离成单细胞悬液，首先使用一把干净的刀片小心去除脑干和小脑。然后使用另一把干净的刀片将脑半切，沿冠状面将每个半球切成大小大致相等的三块。

使用5毫升注射器的推杆端，将脑组织碎片通过100微米细胞筛网研磨，并持续用含钙和镁的冰冻HBSS冲洗筛网。然后将匀浆后的组织置于冰上。当所有样品处理完毕后，离心细胞悬液，并小心弃去上清液。

将沉淀重悬于1毫升消化缓冲液中。然后将细胞悬液转移至2毫升离心管中，在37摄氏度下缓慢持续旋转孵育细胞。1小时后，用70微米细胞筛过滤细胞悬液，并用3毫升含有DNase的洗涤缓冲液彻底冲洗滤膜。

然后用15毫升无DNase的洗涤缓冲液清洗滤网，离心收集细胞，并弃去上清液。为去除细胞碎片和髓鞘，将细胞重悬于5毫升室温、25%密度梯度介质中，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。通过反复轻柔吹打，充分混匀梯度中的细胞。

然后离心细胞悬液。分离结束后，小心吸除髓鞘层和上清液，避免扰动沉淀，将细胞重悬于10毫升无DNase的洗涤缓冲液中。将细胞转移至15毫升离心管中，再次离心，并将沉淀重悬于100微升冷洗涤缓冲液中。

然后通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量，并将细胞置于 4°C 保存。开始免疫染色前，在 4°C 条件下用抗小鼠 CD26/CD32 Fc 受体阻断试剂孵育细胞 10 分钟，以防止非特异性结合。然后在避光条件下，于 4°C 加入荧光素标记的目标一抗，孵育 20 分钟。

孵育结束后，用两毫升流式细胞术缓冲液洗涤细胞，离心沉淀。将沉淀重悬于200微升流式细胞术缓冲液中，并将样品置于4摄氏度保存，直至进行流式细胞术分析。

为了通过微球计数法量化浸润性免疫细胞的绝对数量，需用反向加样法将40微升流式细胞术缓冲液和10微升细胞悬液准确加入含有已知数量荧光微球的计数管中。接着，将细胞与微球悬液与FITC标记的CD45抗体在4摄氏度避光孵育20分钟，随后用200微升流式细胞术缓冲液反向加样至计数管中。然后立即上机进行流式细胞术检测，记录微球数量以及CD45阳性细胞事件。

大脑中动脉闭塞24小时后，可通过其高表达CD45鉴定浸润脑组织的白细胞。在CD45高表达细胞群中，多形核中性粒细胞通过LY-6G的表达进行鉴定，而T淋巴细胞则表现为CD45高表达、CD3阳性的细胞表面表型。其余CD45高表达细胞可通过其CD19和CD11b的表达进一步区分。

尽管CD11b阳性细胞群可进一步分为Ly-6C高表达的炎性单核细胞，以及包含单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的Ly-6C低表达群体。在卒中的急性期，Ly-6G阳性的中性粒细胞在血管闭塞后迅速进入脑组织。相比之下，与假手术组脑组织及对侧半球相比，缺血半球中CD3阳性T细胞的频率有所降低。

在 CD11b 阳性细胞群中，脑缺血导致平衡向 Ly-6C 高表达的炎性单核细胞显著偏移。此外，在大脑中动脉阻塞后 24 小时，梗死半球的总白细胞计数明显高于对侧半球以及假手术组脑组织。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过机械破碎、酶消化和密度梯度离心法从缺血脑组织中分离免疫细胞，并了解如何利用流式细胞术对这些细胞进行表型分析。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在四小时内完成。在进行该操作时，需牢记总细胞得率在很大程度上取决于脑组织的充分解离。此外，充分的经心灌注是必要的，以防止循环中的非炎症性免疫细胞污染脑内浸润的白细胞。

采用此方法后，可进一步进行基因表达检测或细胞因子谱分析等其他方法，以深入了解不同免疫性脓肿在缺血性脑卒中背景下的功能相关性。