Name: 分离和流式细胞仪分析从缺血小鼠脑免疫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学习从缺血小鼠脑中分离免疫细胞并通过流式细胞术进行表型分析的方法。该技术利用密度梯度离心快速获取高活性细胞，有助于深入理解脑卒中后炎症机制并开发免疫调节治疗策略。

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作者感谢 Isabell Schulz 提供出色的技术支持。

所有动物实验必须符合动物护理的相应标准（例如，美国国立卫生研究院（NIH）出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版号85-23，1996年修订版）以及须经相应的州级主管部门批准。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>消化缓冲液（每半脑1 ml）：溶解含有纯化消化酶的标准化混合物， 例如， 低热蛋白酶浓度的Liberase（TL）至指定浓度&#160;2U/ml，溶于含钙（Ca）和镁（Mg）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中</li>
	<li>含DNA酶的洗涤缓冲液：将DNA酶I溶解于含10%胎牛血清（FCS）的HBSS（无Ca/Mg）中，终浓度为666 U/ml</li>
	<li>不含DNA酶的洗涤缓冲液：含10% FCS的HBSS（无Ca/Mg）</li>
	<li>密度梯度介质&#160;（每半脑5 ml）：制备等渗密度梯度储备液&#160;中等密度（SIP；100%），通过将九份密度梯度介质与一份其他组分混合制备&#160;用一份1.5 M氯化钠溶液混合。通过加入适量含3%胎牛血清（FCS）的HBSS（无钙/镁）溶液，将SIP稀释至25%密度</li>
	<li>流式细胞术（FC）缓冲液：配制含3% FCS的磷酸盐缓冲液（PBS）</li>
</ol>
2. 大脑中动脉短暂阻断
注意：通过血管内缝线法进行短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO），在12周龄雄性C57BL/6小鼠中按先前所述方法进行18。
<ol>
	<li>简要来说，使用100%氧气中含2.0%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过反馈控制的加热装置将小鼠体温维持在36.5 °C ± 0.5 °C。</li>
	<li>结扎颈总动脉和颈外动脉后，将标准化的硅胶包被单丝线插入颈总动脉，并推进至大脑中动脉起始处。</li>
	<li>45分钟后撤出线栓以恢复再灌注。对于假手术动物，在阻塞大脑中动脉后立即撤出线栓，以避免缺血发生。</li>
</ol>
3. 经心灌注与脑组织分离
<ol>
	<li>将灌流管的一端浸入冰冷的无钙镁HBSS中，准备蠕动灌流泵。在灌流管的另一端安装一根钝头23 G针头，启动泵，使HBSS（无钙镁）完全充满管路。</li>
	<li>使用4%异氟烷深度麻醉小鼠，并通过吸入CO2实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于塑料托盘内的解剖板上，尽量展开前肢和后肢，并用20 G针头将其固定在解剖板上。</li>
	<li>用直型1×2齿镊夹住腹部皮肤，使用锐利的虹膜剪沿侧方切开皮肤和腹壁，暴露肝脏。</li>
	<li>提起胸骨，用锐/钝虹膜剪的钝刃切开膈肌，继续沿两侧肋骨从尾侧向头侧方向剪开肋骨。注意避免损伤肺、心脏及胸主动脉。</li>
	<li>用钝镊提起皮肤瓣，并用针固定在解剖板上。使用钝头镊和剪刀小心分离心脏周围的结缔组织。</li>
	<li>用钝头镊夹住心脏，将连接灌流管的钝头23 G针头插入左心室心尖部。注意：针头插入左心室不宜过深，以免损伤室间隔。如有必要，可用直型锐镊将套管固定在位。</li>
	<li>用锐利的虹膜剪剪开右心耳，并立即启动灌流泵（流速：8–10 ml/min）。</li>
	<li>持续灌流直至肝脏呈现浅咖啡色（约使用30 ml HBSS）。整个灌流过程中应小心避免管路中产生气泡。</li>
	<li>用直型手术剪在颅骨后方剪断小鼠头部。使用虹膜剪沿头皮正中线切开，暴露颅骨。</li>
	<li>将锐利虹膜剪的一侧尖端插入枕骨大孔，向侧方剪开颅骨。另一侧重复相同操作。</li>
	<li>使用锐利虹膜剪从同一空腔沿正中线向上朝鼻部小心剪开。操作时尽量保持剪刀尖端靠近表面，避免损伤脑组织。</li>
	<li>用精细镊子轻轻剥离大脑半球的颅骨。注意：梗死组织可能黏附于脑膜或颅骨，务必小心解剖，避免丢失脑组织。</li>
	<li>用刮铲轻轻托起脑组织，使用锐利虹膜剪小心剪断固定脑部的颅神经纤维。将脑组织放入盛有10 ml HBSS（含钙镁）的15 ml离心管中，短暂置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 将脑组织解离为单细胞悬液
<ol>
	<li>使用洁净的剃刀小心去除脑干和小脑。用洁净的剃刀将脑组织沿中线切为左右两半，并将每侧半球沿冠状面切成大小大致相等的三块。</li>
	<li>使用5 ml注射器的推杆端，将每侧半球的解剖组织通过100 µm细胞筛网进行研磨，同时持续用预冷的含钙镁HBSS缓冲液冲洗细胞筛网。将匀浆后的样品置于冰上保存。</li>
	<li>在286 × g、4 °C条件下离心5分钟，小心弃去上清液。将沉淀物重悬于1 ml消化缓冲液中，并将悬液转移至2 ml离心管中。在37 °C下缓慢持续旋转孵育1小时。</li>
	<li>将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤，并先用含有DNA酶的3 ml洗涤缓冲液充分冲洗，再用15 ml不含DNA酶的洗涤缓冲液冲洗。在286 × g、18 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。注意：使用DNA酶可消除因细胞裂解产生的DNA黏液，避免细胞聚集，从而提高细胞存活率。</li>
</ol>
5. 密度梯度离心法去除髓鞘和细胞碎片
<ol>
	<li>将细胞沉淀重悬于5 ml的25%密度梯度培养基中&#160;，用移液器将悬液转移至15 ml离心管中。通过反复轻柔吹打充分混匀，避免产生气泡。注意：密度梯度培养基&#160;应在室温下使用&#160;，以防止细胞聚集。</li>
	<li>在521 × g、18 °C条件下离心20分钟。使用转子最低加速度档位，并让转子自然停止，不使用刹车。从离心机中轻轻取出离心管，避免振荡。小心吸除上清液及髓鞘层，同时保留管底的细胞沉淀。注意：务必彻底清除全部髓鞘层，残留物将影响流式细胞术分析结果。</li>
	<li>将沉淀用10 ml无DNase的洗涤缓冲液重悬，并用移液器将悬液转移至新的15 ml离心管中。注意：此洗涤步骤至关重要，充分去除密度梯度培养基&#160;可显著提高最终细胞样本的数量与质量。</li>
	<li>再次在286 × g、10 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于100 µl冷洗涤缓冲液中，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定细胞数量和活力。将样本置于4 °C保存，并尽快进行后续处理。</li>
</ol>
6. 流式细胞术分析的抗体染色
<ol>
	<li>在抗体标记之前，将细胞悬液在 4 °C 下孵育 10 分钟，加入抗小鼠 CD16/CD32 Fc 受体阻断试剂（终浓度为 2.5 µg/ml，稀释倍数为 1:200），以防止非特异性结合。</li>
	<li>将荧光素偶联的一抗抗体以适当浓度（见表 1）加入细胞悬液中，于 4 °C 避光孵育 20 分钟。注意：对照样品不加一抗抗体，其余处理相同。</li>
	<li>用 2 ml FC 缓冲液洗涤细胞，在 350 × g、10 °C 条件下离心 7 分钟。小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µl FC 缓冲液中。样品暂时保存在 4 °C 避光处，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
7. 通过计数微球进行绝对定量
<ol>
	<li>反向移液 40 µl 的&#160;FC 缓冲液和&#160;将10 µl细胞悬液加入含有已知数量荧光微球的计数管中。注意：应确保移液器校准准确，能够精确移取10 µl样本，因为后续白细胞计数的计算均基于此体积。</li>
	<li>将细胞悬液与FITC标记的CD45抗体（终浓度5 µg/ml，稀释倍数1:100）在4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>将200 µl FC缓冲液倒置加入计数管中，无需洗涤步骤，直接在流式细胞仪中记录CD45+细胞。</li>
</ol>
8. 流式细胞术数据采集
注意：为了分析建议的抗体组合，所用流式细胞仪必须配备蓝色（488 nm）、红色（635 nm）和紫色（405 nm）激光器，并配备用于 FITC、PE、PerCP Cy5.5、PECy7、APC-Cy7 和 AmCyan 的滤光片。
<ol>
	<li>使用缺血半球的未染色细胞调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。在显示FSC面积与高度的点图中，区分双联体与单个细胞。</li>
	<li>将所有单个细胞在每个使用的荧光通道的单参数直方图中显示，并调整光电倍增管（PMT）电压，使单个细胞显示在直方图最左侧。</li>
	<li>使用CD45-FITC单染样本，通过在每个直方图和散点图中反向设门CD45high免疫细胞，检查目标细胞的散射和PMT设置。注意：调整FITC的PMT电压，以便区分CD45阴性、中等（int）表达和高表达的细胞。</li>
	<li>使用抗体捕获的补偿微珠进行多色补偿。设定小胶质细胞（CD45int）和白细胞（CD45high）的门控，并根据图1所示的设门策略进一步定义白细胞亚群。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种在实验性脑卒中后从小鼠脑组织中分离白细胞的简单且有效的方法。该方法可稳定地从每个脑半球获得高度可重复的细胞计数，从而能够在同一个生物学重复样本中检测不同的流式抗体组合。
显然，若未能完全清除包括免疫细胞在内的血液，将导致对进入缺血脑组织的炎症细胞实际数量的误判。因此，在使用本方案时，务必特别注意进行彻底的经心灌注，以防止浸润的免疫细胞被非炎症性的循环白细胞污染。根据经验，使用钝针穿刺左心室可降低室间隔损伤的风险，否则将导致体循环灌注被绕过。灌注液从鼻孔流出 表明灌注压力过高，因此应避免流速 &#62;10 ml/min。脑组织呈现苍白至白色表明灌注良好，而粉红色则提示灌注不良。
该方案的另一个关键步骤是高效解离脑组织，包括机械性破碎和酶消化。通过细胞筛网切碎组织对于提高蛋白酶的消化效率至关重要。然而，在匀浆组织时应避免施加过大压力，因为单核吞噬细胞极易发生自溶。22。对于酶消化，使用 Liberase TL&#160;推荐使用由高纯度胶原酶I和II组成的混合酶液，其中含有低浓度的中性蛋白酶嗜热菌蛋白酶。与先前报道的分离方案直接比较14,22,23Liberase TL显著提高了活细胞的回收率&#160;处理（K.M. 未发表数据）。与常用于从脑组织中分离免疫细胞的胶原酶相比，Liberase TL&#160;内毒素含量极低。如果细胞需经分选用于后续分析，这一点尤为重要，因为高水平的内毒素可能改变免疫细胞的活化状态。24 并严重损害细胞培养结果25传统胶原酶的另一个缺点 不同批次间酶活性存在显著差异，这会危及实验结果的可重复性，因此需要为每一批次确定工作浓度26.
在成年大脑中，通过密度梯度离心去除髓鞘是后续应用（如流式细胞术或基因与蛋白质表达研究）不可或缺的步骤。该方案的一个主要优势在于采用单层密度法，无需耗时制备梯度液。此外，即使由经验较少的实验人员操作，该分离方案也能获得可靠的结果。该方法避免了使用密度相近的多层梯度，从而防止在加样过程中因扰动层间界面而影响分离效果。
根据表面标志物 CD45 的表达情况，该方案可从缺血性脑组织中分离出三大类主要细胞。其中绝大多数细胞属于 CD45 阴性群体，由神经元细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞和内皮细胞组成。这类细胞的大量存在归因于单层密度梯度法，该方法主要旨在高效去除髓鞘和细胞碎片。此外，还存在 CD45int 代表常驻小胶质细胞的群体27可以从CD45区分高 主要包含侵入性的血源性白细胞的群体。然而，需要注意的是，活化的微胶质细胞可能表现出类似于血液来源的髓系细胞的表型和功能。因此，仅通过复杂的实验技术（如异体共生）28骨髓嵌合体29 或命运图谱分析30 在炎症期间能够清晰区分这两个群体。
流式细胞术中的数据分析通常局限于特定细胞群体的百分比分布。然而，在比较梗死半球与非梗死脑组织时，此类信息可能具有误导性，因为它未考虑缺血性损伤所改变的全脑白细胞总数。因此，为了全面了解卒中后炎性浸润的程度和表型，除了免疫细胞亚群的相对分布外，还应补充绝对细胞数量的测定。当按照本方案所述使用微珠时，必须精确移取固定体积的样本，以获得可靠的结果。此外，强烈建议采用反向移液法，以避免计数管中产生泡沫。产生的气泡会减少微珠的预期体积，从而导致样本中绝对CD45high白细胞计数被高估。
总之，本方案提供了一种简便且可靠的从脑组织中分离免疫细胞的方法，可作为解析缺血性脑卒中后炎症反应复杂性的有力工具。未来可应用于研究单核细胞亚群在缺血性脑炎症扩散与消退过程中随时间变化的作用。类似地，卒中后适应性免疫系统的作用目前仍知之甚少。通过流式细胞术分析表达亚群特异性转录因子或细胞因子的T细胞亚群 原位 可能有助于阐明其对中风后长期康复的影响，从而为开发新的治疗策略开辟有前景的途径。

脑卒中会引发持续的炎症反应，这种反应在局部血流停止后迅速启动，并几乎涉及免疫系统的各个部分。该炎症反应的一个重要特征是免疫细胞按时间顺序向脑组织浸润，这一过程由脑内皮细胞活化、大量趋化因子分泌以及交感神经输出增强所驱动1-3。过去认为，炎症细胞浸润在缺血性脑卒中中是有害的，然而，先前设计用于无差别阻断白细胞向脑部迁移的多种治疗试验均未能产生可测量的临床获益4。近年来逐渐明确的是，单核细胞来源的细胞在最初促进缺血性损伤进展5的同时，也可能在炎症消退及后续组织修复过程中发挥关键作用6。
由于发现了单核细胞和巨噬细胞在表型和功能上的异质性，人们对单核吞噬细胞在炎症发生与消退过程中的作用有了显著深入的认识。在小鼠中，循环单核细胞可根据其表面淋巴细胞抗原6复合物（Ly-6C）的表达水平至少分为两个功能不同的亚群7。其中，Ly-6Chigh“炎症性单核细胞”已被明确证实对控制细菌感染至关重要8，但其在无菌性损伤中的作用仍存在争议。在缺血性脑卒中模型中，选择性清除CCR2+ Ly-6Chigh单核细胞会导致出血性梗死转化6；然而，采用相同的实验手段却可改善脑出血后的急性神经功能缺损9。类似地，在缺血性脑损伤中，不同亚群的T细胞被认为可能发挥有害10或保护性作用11，但相关数据仍存在矛盾12,13，亟需进一步研究。鉴于免疫系统复杂性的不断增加，深入理解各类免疫细胞在缺血性损伤与修复过程中的具体作用，对于将实验研究成果转化为针对卒中后炎症的治疗策略至关重要。
目前，分析细胞免疫反应最强大的工具是多色流式细胞术。它能够在炎症部位识别和定量各种免疫细胞亚群，而无需通过体内标记或基因操作对系统引入偏倚14。同时对细胞表面标志物以及细胞内细胞因子15或转录因子16进行抗体染色，还可进一步提供关于经表型鉴定的单个细胞功能状态的信息。然而，流式细胞术的主要缺点之一是需要制备单细胞悬液，因此会丢失细胞浸润的空间定位信息。尽管组织学方法非常适合获取空间分布信息，但其在单次实验中可用于鉴定特定组织内免疫细胞亚型的抗体数量有限。目前，需要结合多种表面标志物的表达与缺失情况，才能明确鉴定出稀有的免疫细胞亚群，尤其是在炎症过程中不同的单核细胞来源的细胞群体17。
本文介绍了一种利用简单的单层密度梯度法，从缺血后小鼠脑组织中高效分离大量白细胞的实验方案。所获得的细胞悬液可直接用于多维流式细胞术分析，也可进一步通过流式细胞分选或免疫磁珠分选进行富集，以开展高特异性的下游分析。本方法详细描述了经心脏灌注、脑半球的分离、脑组织解离为单细胞悬液、密度梯度离心去除髓鞘，以及用于流式细胞术分析的抗体染色等步骤。

<table><tbody><tr><td>Peri-Star Pro 蠕动泵，4通道</td><td>World precision instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 培养箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSmix 试管旋转混合仪</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>4831850</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>含钙/镁的 HBSS</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Plus</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-5445-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>3302-P101003</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trucount</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Biochrom AG</td><td>L 182-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Horizon V500</td><td>BD Biosciences</td><td>562128</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0454</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE</td><td>Biolegend</td><td>100307</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>115519</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560596</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管，1 米</td><td>World precision instruments</td><td>503022</td><td></td></tr><tr><td>精细虹膜剪，尖头</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>精细虹膜剪，尖头/钝头</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>直型 1 x 2 齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器推杆</td><td>Carl Roth GmbH (Braun)</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，100 &amp;micro;m</td><td>Dr. I. Schubert, BD</td><td>2360-00</td><td></td></tr><tr><td>Omnican Fine 注射器，1 ml</td><td>Braun</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，70 &amp;micro;m</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>542 070</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>BD Bioscience GmbH</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>移液管，10 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>移液管，10 ml</td><td>Sarstedt AG&amp;amp;Co</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>移液管，25 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>移液管，5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>移液管，25 ml</td><td>Sarstedt AG&amp;amp;Co</td><td>861,685,020</td><td></td></tr><tr><td>移液管，5 ml</td><td>Sarstedt AG&amp;amp;Co</td><td>861,253,025</td><td></td></tr><tr><td>吸头，0.1 - 10 &amp;micro;l</td><td>Corning B.V.Life Sciences</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>吸头，100 - 1,000 &amp;micro;l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>吸头，10 - 200 &amp;micro;l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>739296</td><td></td></tr><tr><td>反应管，1.5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>反应管，2 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>623201</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养皿，94 x 16 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>VWR International GmbH (BD)</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板</td><td>Biochrom AG</td><td>PDHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>CK07.1</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

缺血性脑卒中会引发强烈的炎症反应，该反应始于血管内腔室，并涉及脑内常驻细胞的快速活化。这种炎症反应的关键机制之一是循环免疫细胞在趋化因子释放和内皮黏附分子表达增加的促进下，迁移至缺血脑组织。侵入脑组织的白细胞在早期继发性缺血性损伤中的作用已被广泛认知，但其在炎症终止及后期脑修复过程中的重要性直到最近才受到关注。
本文提供了一种高效分离缺血小鼠脑组织中免疫细胞的简单方案。经心脏灌注后，分离脑半球并进行机械性解离。随后使用Liberase&#160;进行酶消化，并通过密度梯度（如Percoll）离心去除髓鞘和细胞碎片。该方案的一个主要优势在于采用单层密度梯度法，无需耗时的梯度制备过程，操作可靠。该方法可获得高度可重复的每侧脑半球细胞数量，且能够在同一个生物学重复样本中检测多个流式细胞术分析面板。对实验性脑卒中后侵入脑组织的白细胞进行表型鉴定与定量分析，有助于深入理解其在缺血性损伤与修复过程中所发挥的多重作用。

采用左大脑中动脉短暂性线栓法（MCAO）在12周龄雄性C57BL/6小鼠中诱导脑缺血。假手术组插入线栓以阻塞左大脑中动脉后立即撤出，实现即刻再灌注。值得注意的是，常用的脑卒中模型之间，细胞神经炎症反应存在显著差异19。在将动物实验结果外推至人类脑卒中复杂的病理生理过程时，必须充分考虑这一差异。
在大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时处死小鼠，以分析早期免疫细胞向缺血性脑组织的浸润情况。通过密度梯度离心法获得的缺血半球（MCAO 同侧；0.95 ± 0.25 × 10E6）细胞计数与对侧半球（MCAO 对侧；1.09 ± 0.30 × 10E6）以及假手术小鼠同侧半球（假手术同侧；1.12 ± 0.18 × 10E6，单因素方差分析，p = 0.524）相比无显著差异。通过台盼蓝排斥法测定的分离细胞存活率较高，且各组之间无显著差异（假手术组 96.85 ± 0.60%，MCAO 对侧 97.12 ± 1.18%，MCAO 同侧 95.68 ± 2.04%，单因素方差分析，p = 0.253）。
通过流式细胞术分析确定了MCAO后24小时脑内浸润细胞的组成。图1以示意图形式展示了设门策略（A）以及在代表性卒中动物中的实际应用（B）。脑内浸润的白细胞定义为CD45high细胞，可与CD45int的小胶质细胞相区分。在CD45high细胞群体中，通过Ly-6G的表达鉴定出多形核中性粒细胞（PMN），而T淋巴细胞则被界定为CD45high CD3+细胞。其余的CD45high细胞则根据CD19（B淋巴细胞）和CD11b的表达进一步区分。CD11b+亚群进一步细分为Ly-6Chigh的“促炎单核细胞”和一个Ly-6Clow群体，后者包含单核细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞。
在脑卒中的急性期，髓系免疫细胞是脑部浸润的主要细胞类型3,20。中性粒细胞在血管闭塞后迅速进入脑组织，并促进炎性单核细胞的血管外渗21。图2A显示了MCAO术后24小时，缺血半球与对侧半球及假手术组相比，Ly6-G+中性粒细胞比例的增加情况。相比之下，缺血半球中CD3+ T细胞的比例（相对）低于健康脑组织。在CD11b+细胞群体中，脑缺血导致Ly-6Chigh炎性单核细胞占据显著优势（图2B）。
除了相对分布外，还使用计数管根据 CD45 阳性事件来确定样本中免疫细胞亚群的绝对数量（图 3）。计数管中含有冻干小球，可释放已知数量的荧光微球。通过将细胞事件与微球事件进行比较，可确定样本中阳性细胞的绝对数量。为计算每侧半脑中 CD45high 白细胞的数量，使用以下公式：每侧半脑 CD45high 细胞数 = （CD45high 事件数 × 总计数微球数 / 样本微球事件数）×（总悬浮体积（100 µl）/ 样本体积（10 µl））。在 MCAO 术后 24 小时，梗死侧半脑的总白细胞计数显著高于对侧半脑及假手术组（图 3D，单因素方差分析，p = 0.0004）。不同免疫细胞亚群（PMN、T 细胞、B 细胞、Ly-6Chigh 和 Ly-6Clow 单核细胞）的数量可通过将其相对频率乘以相应样本中总的 CD45high 白细胞数而简便计算得出。
<img alt="流式细胞术细胞群体分析的设门策略示意图及散点图，白细胞分化。" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 流式细胞术设门策略。（A）设门策略的示意图。（B）显示在大脑中动脉闭塞后24小时从小鼠脑中分离的白细胞的流式细胞术分析结果。FSC 前向散射，PMN 多形核中性粒细胞，cDC 经典树突状细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术结果；MCAO 研究中的 Ly-6G/CD3 和 Ly-6C/CD11b 等高线图" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 免疫细胞亚群的区分。 在大脑中动脉闭塞（MCAO）或相应的假手术后 24 小时，同侧（ipsi）和对侧（contra）半脑中 Ly-6G+ 中性粒细胞（A）、CD3+ T 细胞（A）以及通过 Ly-6C 差异表达鉴定的单核细胞亚群（B）的相对分布。每个细胞群的比例在设门区域中标示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；CD45标志物；散点图；细胞分化；统计图表结果。" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 通过计数微球定量脑部白细胞。（A）显示高度双阳性的微球门控。在单细胞群体中（B），CD45int 小胶质细胞可与CD45high 白细胞区分开来（C）。为进行定量，将门控内CD45high 事件的数量标准化至所计数的微球事件。注意，在大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时，同侧（ipsi）半脑的总白细胞（CD45high）数量相较于对侧（contra）半脑和假手术组显著增加。**p &lt;0.01，***p &lt;0.001，采用单因素方差分析及Tukey事后多重比较检验。每组n = 4 - 6。FSC：前向散射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table colgroup="" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">荧光染料</td>
			<td rowspan="2">FITC</td>
			<td rowspan="2">PE</td>
			<td>PerCP</td>
			<td rowspan="2">PC7</td>
			<td rowspan="2">APC-Cy7</td>
			<td rowspan="2">V500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗原</td>
			<td>CD45.2</td>
			<td>CD3</td>
			<td>Ly-6G</td>
			<td>CD19</td>
			<td>Ly-6C</td>
			<td>CD11b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终浓度 [µg/ml]</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释倍数</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/200</td>
			<td>1/1,000</td>
			<td>1/1,000</td>
			<td>1/200</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>克隆号</td>
			<td>104</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>1A8</td>
			<td>6D5</td>
			<td>AL-21</td>
			<td>M1/70</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于缺血性脑组织中免疫细胞鉴定的基础抗体组合。

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。

缺血性脑卒中会引发强烈的炎症反应，这种反应始于血管内腔室，并涉及脑内常驻细胞的快速活化……

本实验的主要目标是从缺血小鼠脑组织中分离免疫细胞，并通过多参数流式细胞术对其进行定量和表型表征。利用多色流式细胞术分析脑组织缺血后的炎症反应，有助于深入理解参与病灶进展、修复过程以及卒中总体预后的免疫学机制。本方法的主要优势在于采用快速、一步式密度梯度离心法，能够从缺血小鼠脑组织中分离出大量具有活性的免疫细胞。该技术的应用旨在识别和验证可在更宽时间窗内应用于卒中的新型免疫调节治疗策略。首先，将蠕动灌注泵管的一端浸入冰冷的无钙无镁HBSS中，将一根钝头23号针头固定在管子的另一端。然后打开泵，用HBSS完全充满管路。接下来，将已处死的小鼠背侧朝下放置在嵌于塑料托盘中的解剖板上，并用20号针头将前肢和后肢的脚掌尽可能向外固定。使用一对直的双齿镊夹住腹部皮肤，用锋利的虹膜剪沿侧方切开皮肤和腹壁，以暴露肝脏。然后抬起胸骨，使用一对锐钝型虹膜剪的钝端切开膈肌。继续沿两侧从尾侧向头侧方向剪开肋骨 cage，注意不要损伤肺、心脏和胸主动脉，并用钝头镊子展开皮肤瓣。将皮瓣固定在解剖板上，仔细分离心脏与结缔组织。用钝头镊子夹住心脏，将灌注管末端的23号针头插入左心室心尖处，注意避免损伤室间隔。使用锐利的虹膜剪剪开右心房，立即启动泵，注意防止泵内产生气泡。当肝脏变为浅咖啡色时，用直手术剪在颅骨后方剪断小鼠头部。然后使用虹膜剪在头皮正中做一纵行切口。当颅骨暴露后，将锐利的虹膜剪的一侧刀尖插入枕骨大孔，向侧方在颅骨上做切口。在另一侧重复相同操作。然后使用锋利的虹膜剪从同一腔隙沿中线向上朝鼻部方向小心剪开。用精细镊子轻轻剥离颅骨与大脑半球之间的颅骨。接着用刮勺将脑组织轻轻抬起，并使用锋利的虹膜剪仔细分离固定脑组织至颅骨的脑神经纤维。将脑组织放入含有10毫升冰上预冷的含钙和镁的HBSS的15毫升离心管中。为将脑组织解离成单细胞悬液，首先使用一把干净的刀片小心去除脑干和小脑。然后使用另一把干净的刀片将脑半切，沿冠状面将每个半球切成大小大致相等的三块。使用5毫升注射器的推杆端，将脑组织碎片通过100微米细胞筛网研磨，并持续用含钙和镁的冰浴HBSS冲洗筛网。然后将匀浆后的组织置于冰上。待所有样品处理完毕后，离心细胞悬液，并小心弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升消化缓冲液中。然后将细胞悬液转移至2毫升离心管中，在37摄氏度下缓慢持续旋转孵育细胞。1小时后，用70微米细胞筛过滤细胞悬液，并用3毫升含有DNase的洗涤缓冲液彻底冲洗滤膜。然后用15毫升无DNase的洗涤缓冲液清洗滤网，离心收集细胞，并弃去上清液。为去除细胞碎片和髓鞘，将细胞重悬于5毫升室温、25%密度梯度介质中，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。通过反复轻柔吹打，充分混匀梯度中的细胞。然后离心细胞悬液。分离结束后，小心吸除髓鞘层和上清液，注意不要扰动沉淀，将细胞重悬于10毫升无DNase的洗涤缓冲液中。将细胞转移至15毫升离心管中，再次离心，并将沉淀重悬于100微升冷洗涤缓冲液中。然后通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量，并将细胞置于4°C保存。开始免疫染色前，在4°C条件下用抗小鼠CD26/CD32 Fc受体阻断试剂孵育细胞10分钟，以防止非特异性结合。随后在避光条件下，于4°C加入目标荧光标记的一抗，孵育20分钟。孵育结束后，用两毫升流式细胞术缓冲液洗涤细胞，离心沉淀。将沉淀重悬于200微升流式细胞术缓冲液中，4摄氏度避光保存，直至进行流式细胞术分析。为了通过微球计数定量浸润性免疫细胞的绝对数量，需用反向加样法将40微升流式细胞术缓冲液和10微升细胞悬液准确加入含有已知数量荧光微球的计数管中。接着，将细胞与微球的混合悬液与FITC标记的CD45抗体在4摄氏度避光孵育20分钟，随后用200微升流式细胞术缓冲液反向充满计数管。然后立即上机进行流式细胞术检测，记录微球以及CD45阳性细胞的事件数。大脑中动脉闭塞24小时后，可通过其高表达CD45鉴定浸润脑组织的白细胞。在CD45高表达细胞群中，表达LY-6G的为多形核中性粒细胞，而T淋巴细胞则表现为CD45-high、CD3阳性细胞表面表型。其余CD45高表达细胞可通过其CD19和CD11b的表达进一步区分。尽管CD11b阳性细胞群可进一步细分为Ly-6C高表达的炎性单核细胞，以及包含单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的Ly-6C低表达细胞群。在脑卒中的急性期，Ly-6G阳性中性粒细胞在血管闭塞后迅速进入脑组织。相比之下，缺血半球中CD3阳性T细胞的频率较假手术组脑组织及对侧半球有所降低。在 CD11b 阳性细胞群中，脑缺血导致 Ly-6C 高表达的炎性单核细胞占主导地位。此外，在大脑中动脉闭塞后 24 小时，梗死半球的总白细胞数量显著高于对侧半球以及假手术组脑组织。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过机械破碎、酶消化和密度梯度离心法从缺血脑组织中分离免疫细胞，并了解如何利用流式细胞术对这些细胞进行表型分析。一旦掌握，该技术若操作得当，可在四小时内完成。在进行该操作时，需牢记总细胞得率在很大程度上取决于脑组织的充分解离。此外，充分的经心灌注是必要的，以防止非炎症性循环免疫细胞污染脑内浸润的白细胞。采用此方法后，可进一步开展基因表达检测或细胞因子谱分析等其他方法，以深入了解不同免疫性脓肿在缺血性脑卒中背景下的功能相关性。

isolation-flow-cytometric-analysis-immune-cells-from-ischemic-mouse

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。...

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。...

微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

学习从缺血小鼠脑中分离免疫细胞并通过流式细胞术进行表型分析的方法。该技术利用密度梯度离心快速获取高活性细胞，有助于深入理解脑卒中后炎症机制并开发免疫调节治疗策略。

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

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