通过重组腺相关病毒载体注射立体的α-突触核蛋白基于大鼠模型为帕金森氏病的发展

该程序的总体目标是通过在中枢神经系统中立体定向注射开发一种基于病毒载体的帕金森病动物模型。该方法可用于开发正常的动物模型，允许临床前药物测试，并可能有助于研究帕金森病以及许多其他神经退行性疾病的分子机制。这种技术的主要优点是它可以用于大脑区域的特定靶向。

可以实现高挖沟脑表达，并且可用于创建特定动物品系和物种的动物模型。已经开发了不同的最终向量系统。载体系统的选择取决于您要表达的沟渠大小、基因表达的持续时间、您想要靶向的声音以及生物安全问题。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Annelies Aertgeerts。首先根据批准的方案对 8 周龄的雌性 Wistar 大鼠进行适当麻醉。通过挤压每只爪子检查是否实现了手术麻醉平面，并注意没有撤退反射。

接下来，使用 MicroTransponder 植入器将 MicroTransponder 放在大鼠的背部。检查微应答器的位置是否正确，以及是否可以获得读数。现在剪掉大鼠头皮上的毛发，并在头皮和耳朵上涂抹局部麻醉剂。

将大鼠转移到层流罩中，并使用无菌技术执行其余程序。将大鼠放在立体定位框架中，固定耳杆，然后是嘴巴和鼻子杆。用纸毯盖住大鼠的身体，以避免体温下降。

涂抹眼部润滑剂以防止眼睛干燥。接下来，根据批准的程序对头皮进行消毒。这里使用 70% 异丙基中的 1% 碘。

在头皮中线做一个小切口后，轻轻刮掉颅骨上的膜，然后用生理盐水冲洗。让头骨干燥后，确保可以清楚地看到前囟和 lambda。现在，用重组 AAV 填充 10 微升、30 号 20 毫米显微注射注射器，并将其放置在连接到立体定位仪器的电动显微注射泵上。

对于黑质多巴胺能神经元的特异易，重组 AV 载体是首选，因为它们具有高滴度和转导多巴胺能神经元的效率。通过释放一滴 AAV 来测试流。将任何释放的 AAV 丢弃在多价清洁剂中。

目视检查头部是否笔直固定在头架中。然后检查颅骨是否平坦，首先将针尖移动到前囟并测量此时的高度，沿背腹方向降低针尖直到接触颅骨。在 lambda 处重复该过程。

将针头返回前囟后，将针头沿前后和内侧方向移动到立体定位坐标进行显微注射。记下坐标。在注射部位，像以前一样测量颅骨的高度，并确保它与前囟高度的差异不超过 0.3 毫米。

然后小心地在颅骨上钻一个两毫米的孔。钻孔后，测量硬脑膜的高度以确定应用背腹坐标的参考。使用 26 号针头穿透硬脑膜。

用无菌组织吸收任何血液，只有在所有出血停止后才能进行。现在慢慢地将预装显微注射注射器的针头放入大脑中至背腹坐标。然后暂停一分钟。

然后以每分钟 0.25 微升的速度注射 3 微升 AAV。注射后，让针头再保持原位五分钟，以防止针头沿针迹回流，然后再慢慢取下针头。使用编码编织聚酯 3.0 缝合头皮，并用 1% 的碘和 70% 的异丙醇对皮肤进行消毒。

要松开鼻子和嘴巴的杆，然后松开两个耳杆，轻轻地将动物从立体定位器中取出。此时给予镇痛剂，如果需要，使用麻醉逆转剂。然后将大鼠放在一个干净的笼子里，放在设置为 38 摄氏度的加热板上，密切监测直到它醒来。

手术后，可以使用行为测试和 PET 成像在整个动物中研究神经退行性疾病的动力学，并在处死后使用免疫组织化学技术进行研究。在将表达 A53T 突变 α 突触核蛋白的重组 AAV 显微注射到黑质后的不同时间点进行圆柱体试验以评估自发前肢的使用。从注射后 3 周开始，在接受中位剂量的大鼠中观察到显着的运动障碍。

注射后 4 周，观察到自发对侧前爪使用减少 50%。而对照 eGFP 注射的动物在前爪使用中没有显示不对称性。接受较高剂量重组 AAV 2/7A53T α 突触核蛋白的大鼠在注射后 29 天表现出更明显的前爪使用损害。

为了证明观察到的运动障碍是多巴胺依赖性的，给予了单剂量的 L-doba。当在 L-dopa 处理后 45 分钟重复气瓶测试时，观察到重组 AAV 2/7A53T α 突触核蛋白注射动物的前爪使用完全恢复。为了随着时间的推移非侵入性地跟踪黑质纹状体多巴胺能神经变性的动力学，在个体动物中，使用以 F-18FECT 作为放射性配体的小动物正电子发射断层扫描对多巴胺转运结合进行定量。

随着时间的推移，注射重组 AAV 2/7A53T α 突触核蛋白的大鼠同侧尾状核蛋白的 DAT 结合显著降低。32 天后，观察到 DAT 结合降低高达 85%。作为阳性对照，在 SN 中注射神经毒素 6 OHDA 诱导 7 天内 90% 的 DAT 结合丢失。

时间显微注射重组 AAV 2/7A53T α 突触核蛋白的大鼠脑切片进行酪氨酸羟化酶免疫染色，酪氨酸羟化酶是多巴胺能神经元的标志物。该图显示了显微注射后 29 天内多巴胺能神经元的进行性丢失。一旦掌握，这项技术可以在 45 分钟内完成。

在尝试此过程时，使用高质量的最终向量匹配非常重要。在此程序之后，可以进行其他技术，如无创 PET 成像、行为分析和免疫组织化学分析，以确定神经退行性和神经病理学的水平。观看此视频后，您应该对如何将病毒载体注射到黑质中以开发基于病毒载体的帕金森病动物模型有一个很好的了解。

不要忘记，使用病毒载体可能很危险，并且应始终按照此程序采取预防措施，例如在层流下工作和适当的废物净化。