Name: 通过重组腺相关病毒载体注射立体的α-突触核蛋白基于大鼠模型为帕金森氏病的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 了解通过立体定向注射重组腺相关病毒载体在大鼠黑质区域建立帕金森病动物模型的方法。该技术可实现靶向基因表达，用于临床前药物测试及神经退行性疾病机制研究。

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作者感谢 Joris Van Asselberghs 和 Ann Van Santvoort 提供的出色技术协助。本研究由 IWT-Vlaanderen（IWT SBO/80020）、FWO Vlaanderen（G.0768.10）、欧盟第六框架计划“DiMI”（LSHB-CT-2005-512146）、第七框架计划研发项目 MEFOPA（HEALTH-2009-241791）、第七框架计划“INMiND”（HEALTH-F2-2011-278850）、鲁汶大学（IOF-KP/07/001、OT/08/052A、IMIR PF/10/017）以及 MJFox 基金会（靶点验证 2010）资助。A. Van der Perren 和 C. Casteels 是&#160;佛兰德科学基金会的博士后研究员。K. Van Laere 是佛兰德科学基金会的高级临床研究员。

所有动物实验均按照1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）进行，并已获得比利时鲁汶大学生物伦理委员会的批准。
1. 重组腺相关病毒的生产与纯化
注意：rAAV 载体的生产和纯化由鲁汶病毒载体中心（LVVC）按照先前所述方法完成17。
<ol>
	<li>简而言之，使用25 kDa线性聚乙烯亚胺（PEI）转染液（含150 nM NaCl）及DMEM培养基（含2%胎牛血清），以1:1:1的比例对低传代（&#60;50代）、亚融合状态的贴壁HEK 293T细胞进行转染。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后，更换为新鲜的DMEM培养基（含2%胎牛血清）。 
	注意：所用质粒包括AAV7血清型的包装质粒、携带在CMVie增强型突触素1启动子控制下表达人源A53T突变型α-SYN的AAV转移质粒，以及pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒17。</li>
	<li>在瞬时转染后第5天收集培养上清，并采用切向流过滤法进行浓缩17。</li>
	<li>利用碘克沙醇阶梯梯度离心法从浓缩后的上清中纯化重组AAV（rAAV）病毒颗粒17。</li>
	<li>采用实时定量PCR标准技术测定基因组拷贝数（GC）。本方案中，使用3.0 E11 GC/ml的病毒滴度构建基于α-SYN的帕金森病大鼠模型17。</li>
</ol>
2. 大鼠黑质中rAAV α-SYN载体的立体定位注射（图2）
<ol>
	<li>将约200-250 g重的八周龄雌性Wistar大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的正常循环条件下，自由摄取颗粒饲料和自来水。</li>
	<li>对大鼠进行腹腔注射（i.p.）麻醉，麻醉剂为氯胺酮（60 mg/kg）和美托咪啶（0.4 mg/kg）的混合液。当大鼠已麻醉且挤压各足爪均无反应时，使用微型应答器植入器在其背部皮下植入微型应答器，以便后续识别。检查微型应答器是否定位正确，并能被读取设备正常读取。</li>
	<li>剪除头顶部的毛发，在头皮和耳朵部位涂抹局部麻醉剂。在层流罩内采用无菌技术进行后续手术操作。</li>
	<li>使用两个耳杆、一个口部固定器和一个鼻部固定器将大鼠固定于立体定位仪中。用纸毯覆盖大鼠身体，防止体温下降。涂抹眼用润滑剂以防止眼睛干燥。</li>
	<li>用70%异丙醇中含1%碘伏消毒头皮，并沿中线做一小切口。轻轻刮除颅骨表面的膜状组织，并用生理盐水冲洗。让颅骨干燥数分钟。观察颅骨缝线及两个解剖参考点：前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。</li>
	<li>为将rAAV载体注射至黑质（SN），需以前囟为参考点确定坐标（前后向：5.3 mm；内外向：2.0 mm；背腹向：7.2 mm，自硬脑膜起计算）。 
	注意：可通过大鼠脑立体定位图谱，以前囟作为解剖参考点，计算出各目标区域的三维坐标。</li>
	<li>用rAAV载体填充10 µl微量注射器（30号，20 mm），并将其安装至连接电动微量注射泵的立体定位装置上。通过释放一滴载体液体来校准注射体积，并将其滴入pH为9的多效清洗消毒剂（例如 RBS）中清除。</li>
	<li>目视检查头部是否在头架中保持正直，并评估左右轴线。仔细目测前囟和后囟的前后向与内外向坐标，并使用立体定位仪背腹向臂上的30号20 mm针头测量其高度。
	<ol>
		<li>前囟与后囟之间的高度差不得超过0.3 mm。将针头重新置于前囟位置，并通过调节立体定位仪的前后向和内外向臂来设定前后向与内外向坐标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在注射位点测量颅骨高度，确保其与前囟高度相差不超过0.3 mm。用直径约2 mm的钻头在颅骨上钻孔。测量硬脑膜的高度，作为设定背腹向坐标的参考值；也可采用固定的颅骨厚度值（0.9 mm）进行减除估算。</li>
	<li>使用26号针头穿破硬脑膜，并用无菌纱布吸除血液。等待直至出血完全停止后再继续操作。</li>
	<li>将预先装有载体溶液的10 µl微量注射器缓慢插入脑内至预定深度（背腹向坐标）。针头留置1分钟。使用电动微量注射泵以0.25 µl/min的速度注射3 µl载体溶液（3.0 E11 基因组拷贝/ml（中等剂量）或1.0 E12 GC/ml（高剂量）的rAAV2/7 α-SYN 或 eGFP对照载体）。</li>
	<li>注射完成后，将针头留置5分钟后再缓慢拔出。使用涂层编织聚酯缝线（3.0）缝合头皮，用70%异丙醇中含1%碘伏消毒，然后小心将动物从立体定位仪中取出。先松开鼻部和口部固定器，再松开两个耳杆。</li>
	<li>为逆转麻醉效果，向大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿替美唑，并将其置于38 °C加热板上的清洁笼盒中直至苏醒。用纸毯覆盖大鼠以防止体温下降。</li>
	<li>术后最初几小时内应确保食物和水易于获取。在最初几天内密切观察大鼠状态，必要时给予镇痛处理。 
	注意：无需拆除头皮缝线。1-2周后颅骨完全愈合，缝线会自行脱落。</li>
</ol>
3. 采用非侵入性PET成像、行为学测试和免疫组织化学分析评估rAAV2/7 α-SYN注射大鼠
<ol>
	<li>为在单个动物体内无创地长期追踪黑质纹状体多巴胺能神经变性的动力学过程，可使用小动物正电子发射断层扫描（PET）结合多巴胺转运体（DAT）示踪剂，对多巴胺转运体（DAT）结合进行定量分析 例如 [18F]-FECT16.</li>
	<li>为检测多巴胺能神经变性程度是否足以诱导大鼠出现运动功能障碍，对大鼠进行圆筒实验以评估其自发前肢使用情况。
	<ol>
		<li>将大鼠放入一个20 cm宽的透明玻璃圆筒中，记录其沿筒壁垂直运动及后肢站立后着陆时的行为视频。记录每只前肢接触筒壁的次数，总计20次接触。有关评分标准的详细描述参见Schallert 等18 表达受损前肢接触次数（例如 左前爪接触次数占双侧前肢总接触次数（左前爪加右前爪）的百分比。 
		注意：未损伤的对照组大鼠应双侧前肢使用均衡，其得分在此测试中应约为50%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫组织化学（IHC）分析，以评估转基因表达水平及多巴胺能细胞的丢失情况。
	<ol>
		<li>在不同终点时间点，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（60 mg/kg，i.p.）处死大鼠，随后进行心脏灌注，先用冷生理盐水灌注，再用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注19. 在4 °C下过夜固定脑组织，使用振动切片机切割50 µm厚的冠状脑切片。</li>
		<li>使用抗α-SYN和酪氨酸羟化酶抗体对游离切片进行免疫组化染色，以分析α-SYN表达水平及神经退行性变程度16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Magen, I., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+Parkinson%27s+disease+The+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art.</a> Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+loss+and+inclusion+body+formation+in+alpha-synuclein+mice%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders.</a> Science. 287, 1265-1269 (2000).</li>
<li>Freichel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cognitive+decline+and+amygdala+pathology+in+alpha-synuclein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice.</a> Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).</li>
<li>Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+parkinsonism%3A+strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations.</a> NeuroRx. 2, 495-503 (2005).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+insolubility+of+alpha-synuclein+in+human+Lewy+body+diseases+is+recapitulated+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model.</a> Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+genes+at+work+in+the+living+brain+with+non-invasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging.</a> Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).</li>
<li>Manfredsson, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+nigral+human+parkin+over-expression+partially+ameliorates+motor+deficits+via+enhanced+dopamine+neurotransmission+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).</li>
<li>Vercammen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+protects+against+neurotoxicity+in+the+6-hydroxydopamine+rat+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease.</a> Mol Ther. 14, 716-723 (2006).</li>
<li>Winklhofer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parkin+protein+as+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+therapeutic+targets%22%5BJournal%5D)">The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson-like+neurodegeneration+induced+by+targeted+overexpression+of+alpha-synuclein+in+the+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system.</a> J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+alpha-synucleinopathy+induced+by+viral+vector-mediated+overexpression+of+human+alpha-synuclein%3A+a+new+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).</li>
<li>Lauwers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+and+neurodegeneration+in+rodent+brain+induced+by+lentiviral+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+pathology%22%5BJournal%5D)">Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein.</a> Brain pathology. 13, 364-372 (2003).</li>
<li>Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+cell+loss+induced+by+human+A30P+alpha-synuclein+gene+transfer+to+the+rat+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra.</a> Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).</li>
<li>Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector-Based+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Beh+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease.</a> Curr Top Beh Neurosci. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+follow-up+and+characterization+of+a+robust+rat+model+for+Parkinson%27s+disease+based+on+overexpression+of+alpha-synuclein+with+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors.</a> Neurobiol Aging. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transduction+of+dopaminergic+neurons+in+rat+substantia+nigra+by+rAAV++2%2F1%2C+2%2F2%2C+2%2F5%2C+2%2F6.2%2C+2%2F7%2C+2%2F8+and+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9.</a> Gene Ther. , (2011).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Methods+of+Animal+Brain+Surgery%3A+Perfusion%2C+Brain+Removal%2C+and+Histological+Techniques.+Brain+Neurotrauma%3A+Molecular%2C+Neuropsychological%2C+and+Rehabilitation+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li>
<li>Dale, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+Lewy+bodies+and+pale+bodies+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).</li>
<li>Dawson, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+flies+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of flies and mice.</a> Science. 288, 631-632 (2000).</li>
<li>Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+PD%3A+pieces+of+the+same+puzzle%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Animal models of PD: pieces of the same puzzle?</a> Neuron. 35, 219-222 (2002).</li>
<li>LeVine, H. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+beta-sheet+amyloid+fibril+structures+with+thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T.</a> Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).</li>
<li>Oliveras-Salva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV2%2F7+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+mouse+substantia+nigra+induces+protein+aggregation+and+progressive+dose-dependent+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何实际或潜在的利益冲突。

实验方案中包含若干关键步骤。载体滴度以及载体纯度会直接影响模型的表型结果。过高的载体滴度或纯度不足的载体批次可能导致非特异性毒性。因此，使用高质量的载体批次以及适当的对照载体至关重要。此外，将大鼠头部在立体定位仪中的精确固定以及坐标参数的准确确定，对于靶向黑质区域至关重要。在颅骨注射位点钻孔后，必须将针头垂直插入大鼠脑内，避免触碰任何边缘组织。注射病毒载体后，应缓慢拔出针头，以防止载体泄漏。最后，缝合完成后，应使用含1%碘的70%异丙醇对头皮进行消毒，以防止其他动物啃咬缝线。也可选用其他抗菌试剂进行替代处理。
所述方法也可用于构建基于rAAV2/7 α-SYN的帕金森病小鼠模型24在小鼠中，我们在黑质（SN）内注射 2 µl 的 rAAV 载体。与大鼠相比，小鼠的致密部（DN）对 α-SYN 过表达的敏感性似乎略低，导致神经退行性变的表现延迟。此外，大脑中的其他区域（例如 纹状体，海马体，皮层 等等。) 可作为靶点。不同脑区的坐标可在立体定位图谱中找到。坐标的优化可通过注射碳素墨水或使用编码报告基因的病毒载体来实现。...

为了研究帕金森病（PD）的病理生理机制并开发新的治疗策略，迫切需要建立能够紧密模拟人类帕金森病神经病理学、生理学及运动症状的动物模型。动物模型的预测价值越高，就越有助于将新疗法从动物模型成功转化应用于患者。
1997年发现α-突触核蛋白（α-SYN）是首个PARK基因，由此推动了首批遗传性帕金森病（PD）模型的建立。在过去十年中，已成功构建了多种过表达人源野生型（WT）或突变型（A30P、A53T）α-SYN的转基因小鼠模型。研究表明，α-SYN的过表达水平在病理发展过程中起着关键作用。此外，小鼠品系、内源性α-SYN的存在与否，以及所表达的是全长形式还是截短形式，均具有影响（详见Magen和Chesselet1的综述）。在转基因小鼠中过表达野生型及多种临床突变型人源α-SYN，均可导致α-SYN的病理性聚集和神经元功能障碍2-6。然而，迄今为止，大多数α-SYN转基因小鼠模型均未能表现出明显的多巴胺能神经元丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。
这一难题通过使用过表达α-突触核蛋白（α-SYN）的病毒载体直接靶向黑质（substantia nigra, SN）而得以克服。病毒载体来源于病毒，能够高效感染细胞，将遗传物质整合到宿主基因组中，并迫使宿主细胞复制病毒基因组以产生新的病毒颗粒。病毒可被改造为不能复制的病毒载体，但仍保留进入细胞和导入基因的能力。通过删除病毒基因组的部分序列，并用目的基因替代，该载体可在宿主细胞中实现单轮感染而不发生复制，通常称为“转导”（transduction）。病毒载体既可用于基因过表达，也可用于基因沉默。所表达的外源基因可以是报告蛋白（例如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶）7、用于基因治疗的治疗性蛋白8–10，或如本文所关注的，用于疾病建模的疾病相关蛋白11–14。
病毒载体介导的基因递送为在中枢神经系统中表达外源基因提供了一种具有多种优势的替代方法。通过局部递送外源基因，可靶向特定脑区。此外，可在成年期诱导外源基因表达，从而降低发育过程中出现代偿机制的风险。同时，可在不同物种和品系中构建模型。最后，可轻松组合不同的外源基因。利用病毒载体可实现高水平的外源基因表达，这一点可能至关重要，因为疾病的发生时间和严重程度通常依赖于过表达的水平。
基于不同病毒的多种载体系统已被开发出来。载体系统的选择取决于目的基因的大小、所需基因表达的持续时间、靶细胞类型以及生物安全问题。对于脑内的稳定基因转移，目前认为慢病毒（LV）和重组腺相关病毒（rAAV）载体是首选的载体系统，因为它们能够在啮齿类动物脑内实现高效且长期的基因表达。为了特异性靶向黑质中的多巴胺能神经元（DN），由于rAAV载体具有更高的滴度和对DN更高的转导效率，已逐渐取代了LV载体。
目前可用的最佳基于α-SYN的啮齿类动物模型是通过结合使用新型AAV血清型（rAAV 1、5、6、7、8）以及优化的载体构建体、滴度和纯度而开发的15,16。载体滴度及载体纯度直接影响模型的表型结果。过高的载体滴度或纯度不足的载体批次可能导致非特异性毒性。因此，合适的对照载体不可或缺。在病毒载体的生产、放大和纯化流程中投入大量时间也被证明对于获得可重复且高质量的载体批次至关重要。

<table><tbody><tr><td>8周龄雌性Wistar大鼠</td><td>一月</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>氯胺酮（Nimatek）</td><td>欧洲兽医动物健康</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定（Dormitor）</td><td>Orion-Pharma / Janssen动物健康</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;头皮和耳部局部麻醉：Xyloca&amp;iuml;2% 琼脂糖凝胶</td><td>阿斯利康</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>土霉素</td><td>辉瑞</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>布普鲁卡因&amp;eacute;诺啡（Vetergesic）</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>1%碘异丙醇</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>立体定向头架</td><td>斯托林</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器（30 号针头 -20 毫米 -pst 2）</td><td>汉密尔顿/过滤服务</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>阿替美唑（Antisedan）</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T &amp;alpha;-SYN 载体</td><td>LVVC，鲁汶大学</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/chinese/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Nembutal）</td><td>Ceva Santé Animale&amp;eacute;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>微米</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆突触核蛋白抗体</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5,000</td></tr><tr><td>兔多克隆 TH 抗体</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>基于硅酸镥探测器的FOCUS 220断层扫描仪</td><td>西门子/康科德微系统公司</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>放射性配体：18F-FECT</td><td>内部</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-多巴：Prolopa 125</td><td>罗氏</td><td></td><td>6 mg/kg 腹腔注射</td></tr><tr><td>DMEM，Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>N&amp;deg; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>N&amp;deg; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD 线性聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质：碘克沙醇</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&amp;deg; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 第一卷 Watson 立体定位图谱，第四版</td><td>爱思唯尔</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

为了研究帕金森病（PD）的分子通路并开发新的治疗策略，科研人员依赖于动物模型。与帕金森病相关基因的发现推动了遗传性帕金森病模型的发展。大多数转基因α-SYN小鼠模型会逐渐出现α-SYN病理改变，但缺乏明显的多巴胺能细胞丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。这一难题通过使用过表达帕金森病相关基因的病毒载体直接靶向黑质得以解决。利用病毒载体进行局部基因递送，为在中枢神经系统中表达外源基因提供了一种有效的方法。可特异性靶向特定脑区（e.g. 黑质），可在成年动物中诱导基因表达，并实现高水平的表达。此外，还可采用基于不同病毒的多种载体系统。本实验方案详细阐述了在大鼠黑质中进行病毒载体注射以建立基于病毒载体的α-突触核蛋白帕金森病动物模型的全部关键步骤。

实验的整体方案如图1所示
rAAV 2/7 介导的 A53T α-SYN 过表达可诱导多巴胺依赖性运动功能障碍。 
为了检测 α-SYN 过表达水平是否足以在大鼠中诱导运动功能障碍，我们对大鼠进行了筒壁实验，以评估其自发前肢使用情况（图 3A）。自注射后第 3 周起，接受 3.0 E11 GC/ml 剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠出现显著的运动功能障碍。注射后第 4 周，其自发对侧（左侧）前爪使用率下降了 50%，而对照组注射 eGFP rAAV2/7 载体的大鼠则未表现出前爪使用不对称性（图 3B）。接受更高剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠在注射后第 29 天表现出更明显的前爪使用障碍（下降 70%）（图 3C）。为了证实所观察到的...

本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。

为了研究帕金森病（Parkinson's disease, PD）的分子通路并开发新的治疗策略，科研人员依赖于……

本实验的总体目标是通过立体定向注射中枢神经系统，建立基于病毒载体的帕金森病动物模型。该方法可用于构建正常的动物模型，从而进行临床前药物测试，并有助于研究帕金森病以及多种其他神经退行性疾病的分子机制。该技术的主要优势在于能够对脑区进行特异性靶向。可实现高效的脑部转染表达，并可用于在特定动物品系和物种中建立动物模型。目前已开发出多种不同的终末载体系统。载体系统的选择取决于您希望表达的转染片段大小、基因表达持续时间、靶向的脑区以及生物安全问题。本实验操作由本实验室技术员 Annelies Aertgeerts 示范。首先，根据批准的实验方案，对一只八周龄的雌性Wistar大鼠进行适当的麻醉。通过轻捏每只足掌来检查是否已达到外科麻醉水平，并确认无退缩反射。 接下来，使用 MicroTransponder 植入器将 MicroTransponder 植入大鼠背部。检查 MicroTransponder 是否位置正确，并确认能够获得读数。然后剪除大鼠头皮上的毛发，并在头皮和耳朵部位施用局部麻醉剂。将大鼠转移至超净工作台，后续操作均采用无菌技术进行。将大鼠固定于立体定位仪上，先固定耳杆，随后固定口腔和鼻部固定杆。用纸制毯子覆盖大鼠身体，以防止体温下降。使用眼用润滑剂以防止眼睛干燥。随后按照批准的程序对头皮进行消毒。此处使用含1%碘的70%异丙醇。在头皮中线处做一个小切口后，轻轻刮除颅骨上的膜状物，并用生理盐水冲洗。待颅骨干燥后，确保前囟和后囟清晰可见。接着，用重组腺相关病毒（AAV）充满一支10微升、30号、20毫米的微量注射器，并将其安装到与立体定位仪相连的电动微量注射泵上。对于黑质多巴胺能神经元的特异性转导，重组腺相关病毒（AAV）载体是首选，因其具有高滴度以及高效转导多巴胺能神经元的能力。通过释放一滴 AAV 来测试液体流动情况。将任何已释放的 AAV 置于多价清洁去污剂中进行处理。目视检查头部是否在头架中固定端正。然后通过以下步骤检查颅骨是否水平：首先将针尖移动至前囟，通过在背腹方向降低针尖直至接触颅骨，测量此位置的高度。在后囟处重复该操作。将针头回退至前囟后，沿前后方向和内外侧方向移动针头至用于微量注射的立体定位坐标。记录下该坐标值。在注射位点处，如前所述测量颅骨高度，并确保其与前囟高度的差异不超过0.3 mm。然后在颅骨上小心钻一个两毫米的孔。钻孔完成后，测量硬脑膜的高度，以确定应用背腹向坐标的参考位置。使用26号针头穿透硬脑膜。用无菌纱布吸去血液，待出血完全停止后再进行下一步操作。现在，将预装好试剂的显微注射器针头缓慢插入脑内，到达背腹向坐标位置后，暂停一分钟。然后以每分钟0.25微升的速度注射3微升AAV。注射后，将针头留置原位5分钟，以防止针道回流，再缓慢拔出针头。使用编号的编织聚酯线3.0缝合头皮，并用1%碘溶液和70%异丙醇消毒皮肤。松开鼻部和口腔杆，然后松开两个耳杆，轻柔地将动物从立体定位仪中取出。此时给予镇痛剂，如有需要，可给予麻醉逆转剂。随后将大鼠置于设置为38摄氏度的加热板上的清洁笼具中，并密切监测直至其苏醒。手术后，可通过行为学测试和PET成像在整体动物水平研究神经退行性变的动力学过程，牺牲动物后则可采用免疫组织化学技术进行研究。为评估前肢的自发使用情况，我们在向黑质注射表达A53T突变型α-突触核蛋白的重组AAV后不同时间点进行了圆筒实验。自注射后三周起，接受中等剂量的实验大鼠即表现出显著的运动功能障碍。注射后四周，观察到同侧前肢自发使用率下降了50%。而对照组注射eGFP的动物未表现出前肢使用上的不对称性。接受较高剂量重组AAV2/7-A53T α-突触核蛋白的大鼠在注射后29天表现出更明显的前肢使用功能障碍。为了证实所观察到的运动障碍具有多巴胺依赖性，给予动物单次剂量的L-dopa。在L-dopa处理后45分钟重复进行圆筒实验，结果显示，接受重组AAV 2/7A53T α-突触核蛋白注射的动物前肢使用功能完全恢复。为了在个体动物中无创地长期追踪黑质纹状体多巴胺能神经变性的动力学过程，采用小动物正电子发射断层扫描（PET），以¹⁸F-FECT作为放射性配体，定量检测多巴胺转运体的结合情况。在注射重组 AAV 2/7A53T α-突触核蛋白的大鼠中，随着时间推移，同侧尾状核的 DAT 结合显著减少。32 天后，观察到 DAT 结合减少高达 85%。作为阳性对照，在黑质注射神经毒素 6-OHDA 可在 7 天内诱导 DAT 结合丧失达 90%。随时间推移，对经微量注射重组 AAV 2/7A53T α-突触核蛋白的大鼠脑切片进行酪氨酸羟化酶免疫染色，后者是多巴胺能神经元的标志物。该图展示了微量注射后 29 天内多巴胺能神经元进行性丢失的情况。一旦掌握，该技术可在 45 分钟内完成。在进行该操作时，使用高质量的最终载体匹配至关重要。完成该操作后，可进一步采用其他技术，如无创性正电子发射断层扫描（PET）成像、行为学分析以及免疫组织化学分析，以评估神经退行性变和神经病理学的程度。观看本视频后，您应能够充分掌握如何向黑质注射病毒载体，从而建立基于病毒载体的帕金森病动物模型。请注意，使用病毒载体可能存在危险，因此在进行本操作时，应始终采取预防措施，例如在层流罩下操作以及对废弃物进行适当的去污染处理。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

通过重组腺相关病毒载体注射立体的α-突触核蛋白基于大鼠模型为帕金森氏病的发展

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

本视频演示了通过向大鼠脑内注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）来建立帕金森病动物模型的操作步骤。将神经毒素注入内侧前脑束（MFB）可特异性地靶向控制运动功能的多巴胺能神经元，导致这些神经元被破坏，从而模拟帕金森病的症状。...

建立帕金森病的6-羟基多巴胺大鼠模型

本视频演示了将病毒载体注射到大鼠黑质以建立帕金森病模型的过程。内容概述了大鼠的术前准备、病毒载体向黑质的微量注射步骤以及术后恢复程序。...

向大鼠黑质注射病毒载体以建立神经退行性疾病模型

介绍了在大鼠中实现中枢神经系统大范围基因递送的方法。本示例的目的是模拟一种影响整个脊髓的疾病。通过广泛的转导，可实现仅通过一次外周给药，便将治疗性蛋白递送至中枢神经系统。...

腺相关病毒大鼠静脉注射方法及中枢神经系统转导效果评估的方法与技巧

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成...

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

本文的目的是概述由单体α-突触核蛋白生成纤维、后续质量控制以及在体内使用预先形成的纤维的步骤。...

由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

本文中，我们发现腺相关病毒3型（AAV3）是靶向人肝癌细胞效率最高的载体。...

高效转导肝癌细胞的重组腺相关病毒3型载体

本文描述了一种在小鼠中进行单侧内侧前脑束6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的实验方案。该方法死亡率较低（13.3%），存活小鼠中有89%表现出纹状体多巴胺含量减少&gt;95%，且对侧旋转偏差达90.63±4.02%，偏向损毁侧。...

帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

了解通过立体定向注射重组腺相关病毒载体在大鼠黑质区域建立帕金森病动物模型的方法。该技术可实现靶向基因表达，用于临床前药物测试及神经退行性疾病机制研究。

基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

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