Name: 影像学检查HT能纤维在小鼠脊髓使用CLARITY / CUBIC技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓进行透明化处理，实现五羟色胺能纤维的三维成像。该方法可揭示传统组织学无法观察的神经纤维分布特征，为研究疼痛感知机制提供新的神经解剖学视角。

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本研究由澳大利亚研究理事会脑功能整合卓越中心（ARC 中心资助项目 CE140100007）和澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助（#1086643）支持。George Paxinos 教授由澳大利亚国家健康与医学研究委员会高级首席研究员资助（#1043626）支持。

伦理声明：所有涉及动物受试者的实验程序均遵循新南威尔士大学动物护理与伦理委员会（ACEC）的指导方针（批准的ACEC编号为14/94A）。
1. 透明化小鼠脊髓的制备
<ol>
	<li>冰上预冷水凝胶溶液的制备
	<ol>
		<li>16% 多聚甲醛溶液（PFA）的制备
		<ol>
			<li>将16 g多聚甲醛粉末加入70 ml预热的蒸馏水（50–55 °C）中，在加热磁力搅拌器上搅拌至多聚甲醛完全溶解。注意：溶液温度不得超过55 °C，且需注意多聚甲醛具有毒性。</li>
			<li>将多聚甲醛溶液转移至量筒中，并用蒸馏水定容至100 ml。将溶液置于4 °C冰箱中冷却。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将125 mg VA-044引发剂溶于26.25 ml蒸馏水中，并将溶液置于4 °C冰箱中冷却。</li>
		<li>将5 ml丙烯酰胺溶液（40%）、1.25 ml Bis溶液（2%）（注意：Bis和丙烯酰胺溶液具有毒性，可能引起遗传缺陷或致癌）、5 ml 10x PBS、12.5 ml 16% PFA溶液以及VA-044引发剂溶液置于冰上冷却。</li>
		<li>在冰上混合上述溶液。 
		注意：总体积为50 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脊髓的灌注与采集
	<ol>
		<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg），用0.9%生理盐水稀释后注射。小鼠的剂量可低于大鼠。</li>
		<li>在通风橱内的合适塑料表面上，当小鼠对足部皮肤夹捏无反应时，将其四肢固定于身体两侧（胶带固定效果良好）。</li>
		<li>用剪刀剪开小鼠胸部皮肤，再剪开胸骨以暴露心脏。</li>
		<li>使用蠕动泵，将连接在管路末端的25 G针头插入心脏左心室，剪开右心房以形成血液流出通道，随后以约10 ml/min的速度用40 ml 0.9%生理盐水进行灌注清洗。</li>
		<li>清洗完成后，用35 ml冰上预冷的水凝胶溶液对小鼠进行灌注。 
		注意：灌注速度应控制在10 ml/min，以避免神经组织肿胀。</li>
		<li>用刀片切开背部皮肤，去除脊柱周围的肌肉组织。在一侧剪开椎弓并将其翻向另一侧，用精细剪刀取出脊髓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脊髓的透明化处理
	<ol>
		<li>将脊髓置于15 ml水凝胶溶液中，在4 °C条件下孵育过夜。</li>
		<li>移除10 ml水凝胶溶液，将剩余溶液连同脊髓节段转移至5 ml离心管中，并加满水凝胶溶液至完全充满。</li>
		<li>用一小片封口膜覆盖5 ml离心管管口，再用封口膜包裹管口颈部。注意：确保封口膜与水凝胶溶液接触，且水凝胶溶液与封口膜之间无气泡。</li>
		<li>将5 ml离心管置于37&#160;°C烘箱中过夜。观察水凝胶溶液直至其完全凝胶化。</li>
		<li>从烘箱中取出5 ml离心管，用扳手（如铲形1 ml移液器吸头）将凝胶从管中取出。通过将粗糙组织粘附于凝胶上，再将组织移除，从而将凝胶从脊髓组织上剥离（凝胶会粘附于组织上，因此随组织一同被移除）。</li>
		<li>将凝胶从脊髓组织上移除后，在摇床上用1x PBS（pH 7.4）清洗脊髓组织，每次24小时，共清洗4次。</li>
		<li>通过将3.85 g尿素和3.85 g N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺溶于5.38 ml蒸馏水中，配制CUBIC透明化溶液。 
		注意：使用加热搅拌器。待溶液澄清并冷却至室温后，加入2.31 g聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100。 
		注意：上述三种化学试剂每种10 g适用于一只小鼠。</li>
		<li>用剃须刀片将小鼠脊髓冠状切成2–3 mm长的节段，放入5 ml上述CUBIC透明化溶液中。置于37&#160;°C烘箱内的摇床上孵育3天。</li>
		<li>3天后，更换为新鲜的透明化溶液。注意：上述溶液需在使用前新鲜配制。</li>
		<li>更换CUBIC透明化溶液后2至3天，将组织置于8号字体的纸张前检查其透明度。若组织透明，可透过组织清晰看到纸上的文字。此时移除透明化溶液，加入4 ml PBST（0.1% Triton-X100），每天清洗4次（每6小时一次）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>将脊髓节段放入一抗溶液（兔抗血清素抗体，用PBST按1:100稀释）中，在37 °C培养箱内的摇床上孵育3天。</li>
	<li>移除一抗溶液，加入4 ml PBST（含0.1% Triton-X100），在37 °C培养箱内的摇床上每天洗涤脊髓节段4次（每6小时一次）。</li>
	<li>移除PBST溶液，加入二抗溶液（594标记的山羊抗兔IgG，用PBST按1:100稀释），在37 °C培养箱内的摇床上孵育组织3天。</li>
	<li>移除二抗溶液，加入4 ml PBST，在37 °C培养箱内的摇床上每天洗涤脊髓节段4次（每6小时一次）。次日，组织即可用于成像。</li>
</ol>
3. 成像
<ol>
	<li>移除 PBST 溶液，并加入 4 ml 的 85% 甘油，以使组织的折射率均匀。</li>
	<li>检查组织的透明度。约 1 小时后当组织变得透明时，将其置于一块适合多光子荧光显微镜固定框的大而薄的玻璃载片上。</li>
	<li>在脊髓组织旁滴加数滴 85% 甘油，并用 22 × 50 mm2 的盖玻片封片。 
	注意：脊髓的方向决定了图像的呈现方式。</li>
	<li>将载玻片放入多光子荧光显微镜的固定框中，并将组织移至光路中。</li>
	<li>选择氦氖激光器 594 nm 激光线，并通过观察实时图像中阳性信号的亮度，将激光强度调节至最佳水平。</li>
	<li>使用 20X 物镜（水镜，NA 0.7）选择脊髓组织的扫描区域，准备进行 z 轴层扫，每步深度设为 3 µm。</li>
	<li>先使用 20X 物镜，再使用 63X 物镜（油镜，NA 1.4）从 z 轴顶部到底部扫描组织（步长为 1 µm）。使用三维软件28重建三维视频。</li>
</ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
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<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
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<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
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<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
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<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
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<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了如何结合CLARITY和CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像。与Cheung et al.14 和Tomer et al.15开发的被动透明化方案相比，该方法具有更快的透明速度，并可在透明过程中利用水凝胶对脊髓组织提供良好的支撑。
根据 Cheung 等14 以及 Tomer 等15 的报道，固定小鼠脊髓过程中的一个重要步骤是将所有溶液置于冰上保持低温，以防止化学试剂发生聚合。另一个关键步骤是以缓慢的速度用水凝胶溶液灌注小鼠，以避免神经组织肿胀。为了使水凝胶溶液形成凝胶，通常需要进行脱气处理。作为替代方法，我们使用封口膜覆盖试管顶部，并确保水凝胶溶液与封口膜之间不留任何气泡。该方法效果良好，水凝胶溶液在数小时后即形成凝胶。尽管凝胶中仍发现少量气泡，但这些气泡并未干扰后续实验，这一点已通过脊髓组织中无气泡的现象得到证实。透明化是最关键的步骤，需要多种试剂联合使用。含有氨基醇的透明化溶液清除脊髓组织脂...

上脊髓投射负责调控多种行为，例如痛觉感知。其中传递伤害性信息的投射包含源自后脑缝际核及其邻近网状核的5-羟色胺能纤维1,2。生理学和药理学研究表明，电刺激后脑缝际核后，脊髓背角中5-羟色胺的释放增加3-5。在大鼠和负鼠中，5-羟色胺能缝际脊髓纤维具有密集的终末，不仅分布于脊髓背角6-8，还存在于中间带7,9,10、腹角7,11，甚至第10层12,13。目前尚无类似的小鼠研究。本研究旨在利用近期发表的CLARITY14方法及其改良技术CUBIC15，绘制小鼠脊髓中源自后脑缝际核及其邻近网状核的5-羟色胺能纤维终止分布图谱。
传统的脊髓荧光或过氧化物酶免疫组织化学方法可清晰显示在30-40 µm厚的横切面上，脊髓灰质中5-羟色胺能纤维的分布情况。然而，该方法无法显示白质中5-羟色胺能纤维束的连续性及其在灰质中的侧支。尽管组织学切片的三维重建已推动了对纤维束的研究进展，但由于切片过程中组织产生的微小形变，组织学家和解剖学家仍难以追踪单根纤维束。为克服这一障碍，许多研究人员已开发出多种使整个组织结构透明化的方案，从而可在单个视频文件中获取未受扰动组织的完整图像17-21。迄今为止，Deisseroth团队开发的清晰化、脂质交换、丙烯酰胺杂交刚性、适用于成像/免疫染色的组织水凝胶技术（CLARITY）14,15，以及Susaki等人开发的CUBIC技术16，是最为成功的两种方法。自这些方案发表以来，众多研究人员已开始采用这些技术研究各种生物组织的多个方面，不仅包括脑组织22-25，还包括心脏、肾脏、肠道和肺组织26,27。
通过使用水凝胶溶液（CLARITY）固定小鼠脊髓，并利用CUBIC试剂进行透明化处理（该方法比原始CLARITY方案14,15快得多），一段长2-3 mm的脊髓组织块在两周内完成透明化，且在八天内完成了5-羟色胺的免疫荧光染色。仅通过化学试剂的组合，即可利用常规免疫组织化学方法，在约一个月内获得单个纤维束的三维视频图像。

<table><tbody><tr><td>光引发剂 VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-&lt;br/&gt;879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四(2-羟丙基)乙二胺</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&amp;reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>5-羟色胺抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor&amp;reg; 594 标记</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

利用clarity/cubic技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

长距离下行纤维投射至脊髓，对运动、痛觉感知及其他行为至关重要。目前尚未在任何物种中全面研究大多数此类纤维系统的脊髓终末分布模式。投射至脊髓的5-羟色胺能纤维已在大鼠和负鼠中通过组织学切片进行研究，并基于其在脊髓内的纤维终末分布模式推断其功能意义。随着CLARITY和CUBIC技术的发展，现在有可能系统地研究该纤维系统及其在脊髓中的分布，这有望揭示5-羟色胺能上脊髓通路此前未知的特征。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，结合使用CLARITY和CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像。该方法包括用羟乙基丙烯酸甲酯溶液灌注小鼠，并利用多种透明化试剂组合对组织进行透明处理。脊髓组织的透明化过程耗时略少于两周，随后针对5-羟色胺的免疫荧光染色在十天内完成。使用多光子荧光显微镜对组织进行扫描，并通过Osirix软件重建三维图像。

本部分展示了利用CLARITY与CUBIC技术联合处理的透明化小鼠脊髓中5-羟色胺抗体染色的结果。结果显示，5-羟色胺能纤维存在于脊髓的各个板层中，且主要集中在前角的腹侧区域（图1，另见视频1）。对照组织中未见阳性纤维（结果未显示）。在前角中，5-羟色胺能纤维在腹内侧区域密集分布，并向腹侧角的外侧区域延伸（图2，另见视频2）。部分免疫阳性纤维还从前角延伸至后角或中央管。后角的所有板层中均可见免疫阳性纤维，但在板层2与板层4之间的阳性纤维存在微小间隙，尤其在后角的外侧部分更为明显。后角中的大多数5-羟色胺能纤维直径较小，仅少数为大直径纤维（视频1）。在水平切面上，观察到前角中密集排列的5-羟色胺能纤维沿脊髓长轴走行，并形成一条粗大的纤维束。最引人注目的发现是，该粗大纤维束沿长轴方向规律地发出分支，这些分支与主纤维束呈垂直走向。这些分支在通往前角外侧区域的路径上进一步产生侧支。与这些分支相比，伸向中线方向的分...

上脊髓投射对痛觉感知及其他行为具有重要作用，其中5-羟色胺能纤维是这类纤维系统之一。本研究重点探讨将CLARITY/CUBIC联合技术应用于小鼠脊髓，以研究这些5-羟色胺能纤维的终止分布。

利用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像

向脊髓发出的长下行纤维对于运动、痛觉感知及其他行为至关重要。这些纤维在脊髓中的终止模式……

本项CLARITY/CUBIC实验的总体目标是揭示小鼠脊髓中5-羟色胺能纤维的三维结构特征，这些特征无法通过传统组织学方法观察到。该方法有助于回答神经解剖学领域的关键问题，例如5-羟色胺能纤维在脊髓中的分布方式如何？该技术的主要优势在于能够原位观察5-羟色胺能纤维，同时识别出传统组织学方法无法观测到的信号通路。尽管该方法可用于研究中枢神经系统的结构，但也适用于其他系统，例如心血管系统。当我们在使用传统示踪方法分析小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维时遇到局限性，便首次尝试采用该方法。首先，在通风橱内将麻醉小鼠的四肢固定在塑料解剖台上。确认对脚趾夹捏无反应后，使用剪刀剪开胸部皮肤。接着打开胸腔以暴露心脏，并将连接至蠕动泵管路的25号针头插入左心室。剪开右心房以形成血液流出通道。然后，以大约每分钟 10 毫升的速度，用 40 毫升 9% 的生理盐水冲洗心脏。当血液完全被冲洗干净后，以相同的灌注速率，灌注 35 毫升新鲜配制的冰冻水凝胶。接着，切开小鼠背部的皮肤，并解剖椎旁的肌肉。在一侧切断椎弓并将其翻转至另一侧后，用精细剪刀从椎骨中切除脊髓。收获后立即把脊髓放入15毫升新鲜配制的水凝胶溶液中，在4摄氏度下过夜。第二天，移除10毫升水凝胶溶液，将剩余溶液和脊髓倒入一个5毫升的离心管中。加入新鲜的水凝胶溶液直至试管装满，然后在试管口覆盖一小片封口膜，注意确保封口膜与水凝胶接触，并且溶液与膜之间无气泡。去除试管中的空气是最困难的步骤。为确保无气泡产生，需缓慢地将水凝胶溶液注入试管，然后小心地将封口膜覆盖在试管口，避免凝胶溢出。现在，用第二片封口膜包裹管子的颈部，并将脊髓在37摄氏度的培养箱中孵育过夜。当水凝胶溶液变为凝胶状后，使用扳手将凝胶和神经组织从管子中取出。为去除脊髓上的水凝胶，可用粗糙的纸巾轻轻按压凝胶表面。凝胶在取出时会粘附于组织。当脊髓组织清理干净后，将其置于PBS中，在摇床上进行四到六次、每次数小时的洗涤。24小时后，使用刀片将脊髓组织冠状切分为2至3毫米长的节段，并将组织片段转移至5毫升新配制的CUBIC透明化溶液中。将组织块置于37摄氏度的培养箱中振荡72小时，随后更换已使用三天的透明化溶液，换用新配制的透明化溶液。再经过两到三天后，使用印有8号字体字母的纸张检测组织的透明度。当能够透过透明化的组织观察到字母时，将CUBIC透明化溶液更换为4毫升新鲜的PBST溶液，进行四次、每次六小时的洗涤。为了对脊髓节段进行荧光成像染色，将组织置于适当的初级抗体溶液中，在37摄氏度的摇床培养箱中孵育三天。初级抗体染色结束后，在37摄氏度的培养箱中用四毫升PBST溶液进行四次洗涤，每次六小时。随后，在37摄氏度的摇床培养箱中，将PBST替换为适当的次级抗体溶液，继续孵育三天。第四天，用 PBST 洗去未结合的二抗，方法如上所述。为成像样本片段，将最后一次 PBST 洗涤替换为 4 毫升 85% 甘油，以使组织的折射率更加均匀。约一小时后，检查组织的透明度。当组织变得透明后，将脊髓节段转移至一块大而薄的玻璃载片上。接着，在脊髓组织旁滴加数滴85%甘油，并用22 × 50毫米的玻璃盖玻片覆盖组织。将载片放入显微镜的持片架中，并将组织移入光路中。然后，选择氦氖激光器，并通过观察实时图像中阳性信号的亮度来调节激光强度。将激光调整至最佳强度后，使用20倍物镜选择脊髓组织的扫描区域。随后，设置仪器以生成z轴层叠图像，每层深度为3微米。最后，先使用20倍物镜对组织进行从z轴堆栈顶部到底部的扫描，随后使用63倍物镜进行z轴堆栈扫描。然后可利用3D软件重建相应的三维视频。此处可观察到脊髓各层均存在5-羟色胺能纤维，且以前角腹侧部分为主。在腹角，腹内侧区域可见密集排列的5-羟色胺能纤维，这些纤维向腹角外侧延伸，部分免疫阳性纤维还从腹角向背角或中央管方向延伸。背角各层均存在免疫阳性纤维，但在第二层与第四层的阳性纤维之间存在一个较小的间隙，尤其在背角外侧部分更为明显。在水平切面上，沿脊髓纵轴走行的腹角内密集排列的5-羟色胺能纤维，可观察到其沿垂直于纤维束的轴线规律性地发出分支。这些分支在其走行过程中进一步向腹角外侧部分发出分支。与这些分支相比，延伸至中线区域的分支则更为不规则且纤细。在63倍物镜下可见，背角中的5-羟色胺能纤维沿脊髓长轴走行，并在纤维束路径上的不同位置终止，其中较粗的纤维零星分布于细纤维之间。一旦掌握，若操作得当，该技术可在不到三周的时间内完成。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如使用胆碱乙酰转移酶抗体进行双重标记，以探究胆碱能纤维是否终止于运动神经元，从而回答更多相关问题。该技术建立后，为生物医学成像领域的研究人员探索动物标本或人类组织中不同细胞类型之间的复杂空间关系开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在免疫荧光染色后对小鼠脊髓组织进行透明化处理，以进行三维成像。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

影像学检查HT能纤维在小鼠脊髓使用CLARITY / CUBIC技术

一种微创方案，用于稳定小鼠脊柱并进行重复性操作 体内...

体内 使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

来源： Pekarek, B. T., et. al., 通过CLARITY组织透明化技术对完整神经元树突进行成像与定量分析。J. Vis. Exp.

完整小鼠脑组织中树突分支及树突棘形态的共聚焦显微成像

为了获得大组织内荧光标记细胞的高分辨率图像，理想情况下应无需切片即可对生物样本进行成像。3DISCO...

通过3DISCO技术在细胞水平上对完整生物系统进行成像

在本视频中，我们介绍了一种在活体小鼠背侧脊髓上方植入慢性光学成像窗口的操作流程。将对该成像窗口的结构、手术步骤以及慢性成像过程进行综述并演示。...

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双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

光学透明化技术正在彻底改变组织成像的方式。在本报告中，我们描述了对原始的“清除脂质-丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶”（CLARITY）方案所进行的改进，这些改进可获得更一致且成本更低的结果。...

小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

本文介绍了一种将CLARITY方法应用于全层视网膜组织的实验方案，旨在提升视网膜神经元及其亚细胞结构的标准免疫组织化学染色质量和高分辨率成像效果。...

采用CLARITY组织透明化方法对整体视网膜进行免疫染色

神经元树突的形态通常与其功能相关。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程均表现为形态学表型。本方案描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突分支及其相关的树突棘。...

通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。...

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

微创技术与简易实验装置通过减少对实验动物的手术损伤并维持解剖形态，提高了脊髓损伤模型的可重复性。该方法具有重要价值，因为可靠的结果和可重复的操作流程有助于深入研究疾病修复的机制。...

基于微创技术建立小鼠挫伤性脊髓损伤模型

学习使用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓进行透明化处理，实现五羟色胺能纤维的三维成像。该方法可揭示传统组织学无法观察的神经纤维分布特征，为研究疼痛感知机制提供新的神经解剖学视角。

利用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像

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