Name: 分离和胶质瘤浸润外周血单个核细胞的流式细胞仪分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学习使用流式细胞术分离和分析胶质瘤浸润外周血单个核细胞的方法。该技术可定量评估免疫细胞数量及活化状态，为脑肿瘤免疫学研究提供时间依赖性数据。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 &amp;#38; 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R01-NS074387、R01-NS057711 和 R21-NS091555 至 M.G.C.；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS061107、R01-NS076991、R01-NS082311 和 R21-NS084275 至 P.R.L.；Leah’s Happy Hearts 及密歇根大学综合癌症中心资助项目至 M.G.C. 和 P.R.L.；密歇根大学医学院神经外科系；密歇根临床与健康研究研究所，由 NIH 资助项目 2UL1-TR000433 支持；密歇根大学癌症生物学培训项目，由 NIH/NCI（国家癌症研究所）资助项目 T32-CA009676 支持；密歇根大学临床与基础神经科学培训项目，由 NIH/NINDS 资助项目 T32-NS007222 支持；密歇根大学医学科学家培训项目，由 NIH/NIGMS（国家普通医学科学研究所）资助项目 T32-GM007863 支持。作者感谢 Karin Muraszko 博士及神经外科系提供的学术领导与支持；感谢 M. Dahlgren、D. Tomford 和 S. Napolitan 提供卓越的行政支持；感谢 M. Dzaman 提供出色的技术协助；感谢 Phil F. Jenkins 为购置蔡司 3D 扫描电子显微镜提供的慷慨支持。我们还感谢哈佛医学院 Kuchroo 实验室，本研究中用于分离脑单核细胞的改良密度梯度离心介质法即源于该实验室。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种稳定且可重复的方法，用于分离和通过流式细胞术分析浸润早期小鼠脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞（PBMCs）。实验人员将胶质瘤细胞悬液配制至特定浓度后，通过立体定位法将其移植至小鼠脑纹状体。随后，根据实验设计预设的时间点对小鼠实施安乐死，取出其脑组织并进行处理，以分离出浸润胶质瘤的PBMCs，并使用多种荧光染料标记的一抗对其进行免疫标记；之后通过流式细胞术对免疫标记的细胞进行定量分析。尽管本文演示的重点是早期时间点，但可在肿瘤移植后任意时间点（直至小鼠濒死前）对浸润胶质瘤的PBMCs进行评估。该方法具有高度模块化特点，可使用任意数量的不同抗体组合来检测感兴趣的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。需注意，本方案已针对8至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行了优化。超出此年龄范围的小鼠其循环PBMCs的比例可能发生变化，从而导致在相同时间点的细胞计数与本文所展示的数据不具代表性。若使用其他肿瘤模型或非B6遗传背景的小鼠，可能需要额外进行表征实验，因为不同品系的PBMC谱可能存在差异（Jaxpheno6；小鼠表型数据库；杰克逊实验室）。性别和环境条件也可能导致PBMC频率和比例的差异。
<p cl...

胶质瘤是一类起源于中枢神经系统（CNS）内转化胶质细胞的神经上皮性脑癌。在所有胶质瘤中，世界卫生组织（WHO）4级胶质瘤，即胶质母细胞瘤（GBM），是最常见且致死性最高的类型1。GBM对目前的标准治疗方案高度耐受，该方案包括尽可能地进行肿瘤切除，随后辅以放疗以及同步和辅助的替莫唑胺化疗2。这类致命性肿瘤的预后极差，从初次诊断起中位生存期仅为15至18个月，仅有5%的患者在5年后仍能存活3。
血脑屏障（BBB）的存在、缺乏专业的抗原呈递细胞（APCs），以及此前未被确认的大脑内真正淋巴结构的存在4，曾导致人们认为胶质母细胞瘤（GBM）具有免疫豁免特性。然而，大量研究表明，这类脑肿瘤实际上会招募主要来源于髓系的外周免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）5。GBM还会促使脑内常驻的小胶质细胞转变为促进肿瘤发生的表型6,7。淋巴细胞如CD8+ T细胞8和CD56+&#160;natural killer&#160;细胞9也存在于肿瘤微环境中，但数量较少，这被认为是由胶质瘤来源因子诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）产生免疫抑制功能所致10。CD4+ T细胞在GBM中同样存在，但其中大部分还表达CD25和FoxP3，这是具有免疫抑制功能的调节性T（Treg）细胞的标志物11。GBM整体所呈现的免疫抑制状态最终导致免疫逃逸和肿瘤进展12。
深入了解胶质母细胞瘤（GBM）免疫抑制的机制，对于开发旨在激活免疫系统以对抗肿瘤的有效免疫治疗策略至关重要。在过去的15年中，我们的实验室一直致力于克服脑肿瘤免疫抑制的机制，以开发出有效的新型抗GBM免疫治疗药物13-19。这项工作的最终成果现已推动了一项临床试验的开展，旨在评估一种联合使用细胞毒性与免疫刺激疗法对新诊断GBM患者的效果（ClinicalTrials.gov标识符：NCT01811992）。
我们最近的研究表明，小鼠GL26和大鼠CNS-1胶质母细胞瘤（GBM）细胞通过大量产生β-半乳糖苷结合凝集素galectin-1（gal-1）来阻断抗肿瘤的自然杀伤（NK）细胞免疫监视作用20。该结论通过使用shRNA介导的基因敲低技术抑制胶质瘤细胞中gal-1的表达得以证实。体外实验显示，gal-1缺陷型胶质瘤细胞在培养中增殖正常，但在移植到同系C57BL/6J或RAG1-/-小鼠颅内后迅速被排斥，从而证明此类肿瘤排斥作用不依赖于T细胞或B细胞。使用抗去唾液酸GM1抗血清或单克隆NK1.1抗体对NK细胞进行免疫耗竭后，颅内gal-1缺陷型胶质瘤的生长完全恢复，进一步确立了NK细胞在gal-1缺陷型胶质瘤排斥中的关键作用。我们现在发现，即使存在NK细胞，对Gr-1+/CD11b+髓系细胞进行免疫耗竭也足以阻止gal-1缺陷型胶质瘤的排斥反应，揭示了髓系细胞在辅助NK细胞介导的gal-1缺陷型肿瘤溶解中具有不可或缺的辅助作用（未发表数据）。这一意外发现促使我们开发了一套全面的实验方案，用于分离和分析在颅内移植后早期浸润至脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞（PBMCs），以便更深入地表征决定gal-1缺陷型胶质瘤排斥的免疫细胞浸润事件。
本方法以稳定表达mCitrine荧光蛋白的小鼠GL26胶质瘤细胞（称为GL26-Cit）为例进行演示，该细胞系可通过荧光显微镜直接观察肿瘤细胞21将这些细胞通过立体定位法移植到同系C57BL/6J小鼠脑内，允许其生长24、48或72小时后对小鼠实施安乐死。随后分离胶质瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMCs），并使用抗-CD45、-Gr-1、-CD11b和-NK1.1细胞表面抗体进行免疫标记，同时结合颗粒酶B（GzmB）的细胞内免疫标记。该特异性抗体组合可用于鉴定肿瘤浸润的Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和NK1.1+，NK细胞，我们研究的细胞类型&#160;已发现与半乳糖凝集素-1（gal-1）缺陷型肿瘤排斥反应相关。随后，将gal-1缺陷型GL26-Cit胶质瘤（本文称为GL26-Cit-gal1i）的免疫浸润特征与表达正常水平gal-1的胶质瘤（称为GL26-Cit-NT，含有非靶向对照shRNA发夹结构）进行比较。本实验方案首先描述了GL26-Cit胶质瘤细胞的培养方法 体外，随后详细说明如何将这些细胞正位移植到同基因型C57BL/6J小鼠的纹状体中。接着列举了分离及免疫标记胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMCs）以进行流式细胞术分析的各个步骤。该实验方案最后阐述了标准的数据分析方法及图形化表示方式。
该实验表明，在肿瘤植入后48小时内，Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和NK1.1+ 自然杀伤细胞优先在半乳糖凝集素-1（gal-1）缺陷型脑肿瘤微环境中聚集，这一结果有助于解释为何这些肿瘤在移植约1周后会迅速发生完全溶解20。该方法可轻松适用于多种需要获取免疫细胞随时间动态浸润脑组织数据的体内实验设计。单名实验人员从脑组织采集到对胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMCs）进行流式细胞术分析，大约需要4–6小时，具体时间取决于待分析样本的数量。该方法还可与旨在表征荷瘤小鼠循环PBMCs特征的实验相结合，以便与浸润至脑组织的细胞进行比较，从而识别出肿瘤微环境特异性诱导的免疫抑制表型。此类方法及其类似技术的应用将有助于更深入地理解外周免疫细胞向脑肿瘤微环境迁移过程中所涉及的关键因素。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 修改的伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES 和酚红&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&amp;nbsp;</td><td>不含氯化钙或氯化镁</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml 青霉素；10,000 &amp;mu;g/ml 链霉素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418硫酸盐&amp;nbsp;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>来自 Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase 非哺乳动物胰蛋白酶替代液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SV30030.01</td><td>在含EDTA的DPBS中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>相差显微镜血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0.1 mm 深</td></tr><tr><td>台盼蓝染色</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>无菌0.9%氯化钠注射液，USP</td><td>Hospira</td><td>NDC：0409-4888</td><td>10 ml 小瓶</td></tr><tr><td>0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>盐酸阿替美唑注射液</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC：52483-6298</td><td>5 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>福特·多德</td><td>NDC：0409-2051</td><td>100 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>盐酸右美托咪定注射液</td><td>硕腾</td><td>NDC：54771-2805</td><td>0.5 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪注射液</td><td>劳埃德</td><td>NDC：61311-481</td><td>100 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>卡洛芬注射液</td><td>辉瑞</td><td>NDC：61106-8501</td><td>50 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC：12496-0757</td><td>0.3 mg/ml 安瓿瓶</td></tr><tr><td>1 ml 结核菌素注射器&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &amp;frac12; (0.45 mm × 13 mm) 注射器针头&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC：52380-1905</td></tr><tr><td>无菌凡士林眼膏&amp;nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC：17033-211</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇消毒垫</td><td>肯德尔</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>无纺布，4&quot; × 4&quot;，4层&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.7 ml 锥形聚丙烯微量离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪</td><td>斯托尔廷</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>手术灯</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II 可调光斑照明系统</td></tr><tr><td>弯头解剖镊</td><td>Ted Pella 公司</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>科利布里拉钩&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>无线精密电钻</td><td>Dremel&amp;nbsp;</td><td>1100-01</td><td>触控笔型号；7.2伏锂离子电池，带底座充电站</td></tr><tr><td>雕刻刀</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32&quot; 或0.8 mm钻头直径</td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Hamilton 微量注射器 700 系列；5 &amp;mu;l 体积</td></tr><tr><td>微升注射器针头</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33G，小鲁尔接头RN针头，1.5英寸，3型针尖，6支/包</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 黑色单丝尼龙缝线&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7.9 毫米直径 × 50 毫米长度（5/16）&quot; 直径 × 2&quot; 长度</td></tr><tr><td>1 L 玻璃螺口储存瓶</td><td>康宁</td><td>1395</td><td>1型A级硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>肝素钠&amp;nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC：25021-400</td><td>1,000 U/ml 溶液</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole Parmer仪器集团</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II 控制台驱动器</td></tr><tr><td>压缩碳合气（95% O₂，5% CO₂）&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;/ 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>可从本地供应商处获取</td><td>N/A</td><td>A型大圆柱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20 G × 1 &amp;frac12;&quot; 铝制针座钝头针</td><td>肯德尔</td><td>8881202363</td><td>0.9 mm x 38.1 mm</td></tr><tr><td>聚氨酯冰桶</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>容量：0.152 盎司（4.5 L）</td></tr><tr><td>胶原酶（I-S型）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>来自艰难梭菌（Clostridium histolyticum）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS002007</td><td>&gt;每毫克干重2,000 Kunitz单位</td></tr><tr><td>抗静电聚苯乙烯六角称量皿</td><td>Ted Pella 公司</td><td>20157-3</td><td>顶部内径 115 mm，底部内径 85 mm，容积 203 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不锈钢单刃剃须刀片&amp;nbsp;</td><td>加维</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>骨剪</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>大型解剖剪</td><td>Ted Pella 公司</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>小型解剖剪</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>钝端镊子</td><td>Ted Pella 公司</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 玻璃Dounce组织研磨器</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 密度梯度离心介质&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>一次性使用；无菌</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 无菌尼龙筛网细胞过滤器&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体（克隆号：30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的小鼠抗小鼠NK1.1（克隆：PK136）</td><td>eBiosciences&amp;nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的抗小鼠Gr-1大鼠单克隆抗体（克隆号：RB6-8C5）</td><td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD11b 抗体（克隆号：M1/70）&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 标记的大鼠 IgG2b &amp;kappa; （克隆：RTK4530）同型对照&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的小鼠IgG2a &amp;kappa; （克隆：eBM2a）同型对照&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的鼠IgG2b &amp;kappa; （克隆：eB149/10H5）同型对照&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 标记的大鼠 IgG2b &amp;kappa; （克隆：RTK4530）同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>太平洋蓝染料标记的小鼠抗小鼠颗粒酶B抗体（克隆：GB11）&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>太平洋蓝染料标记的小鼠 IgG1 &amp;kappa; （克隆：MOPC-21）同型对照&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>锥形底部&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>锥形底部</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 圆底聚丙烯FACS管&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 特殊订单研究产品 流式细胞仪/细胞分选仪</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>650033</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>型号：SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

我们实验室最近证明，如果恶性胶质瘤细胞的β-半乳糖苷结合凝集素galectin-1（gal-1）表达缺失，则自然杀伤（NK）细胞能够在颅内移植后迅速清除原位植入的小鼠GL26和大鼠CNS-1恶性胶质瘤。最近的研究进一步表明，Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞亚群在这一效应中起关键作用。为了更深入地理解NK细胞与髓系细胞协同介导gal-1缺失型肿瘤排斥反应的机制，我们建立了一套完整的方案，用于分离和分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMC）。本方法通过比较PBMC在表达gal-1的GL26胶质瘤与通过shRNA敲低实现gal-1缺失的GL26胶质瘤肿瘤微环境中的浸润情况加以演示。该方案首先描述了&#160;如何培养并制备GL26细胞，以便接种至同系C57BL/6J小鼠脑内。随后详细说明了从早期脑肿瘤微环境中分离胶质瘤浸润PBMC并进行流式细胞术分析的具体步骤。该方法可适用于多种需要获取脑内免疫细胞浸润时间动态数据的体内实验设计。本方法具有高灵敏度和高度可重复性，可在肿瘤移植后24小时即从颅内肿瘤中分离出胶质瘤浸润的PBMC，并且在独立实验中不同时间点匹配的肿瘤样本间可观察到相似的细胞数量。单个实验人员从脑组织采集到完成胶质瘤浸润PBMC的流式细胞术分析，大约需要4–6小时，具体时间取决于待分析样本的数量。实验人员也可根据需要选用其他胶质瘤模型和/或细胞特异性检测抗体，以评估其他多种感兴趣免疫细胞类型的浸润情况，而无需对整体操作流程进行修改。

典型的实验采用以下设门策略：FSC-A 对 SSC-A → SSC-H 对 SSC-W → FSC-H 对 FSC-W → CD45 对 count → Gr-1 对 CD11b → NK1.1 对 count。在 Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和 NK1.1+ NK 细胞上设门后，进一步根据 GzmB 的表达情况进行分层分析 （图 5A）。将实验中鉴定为 NK1.1+ NK 细胞和 Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞的群体回设至 FSC-A 对 SSC-A 图中，可证实 NK 细胞具有较小的淋巴细胞形态，而髓系细胞则相对较大 （图 5B）。原始数据文件（即，fcs 文件）可使用商业化的流式细胞术数据分析软件（如 Flowjo）进行分析。
共使用18只C57BL/6J小鼠来演示该方法。其中9只小鼠接种了GL26-Cit-NT细胞，另外9只小鼠在同一天接种了等量细胞...

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。

我们的实验室最近证实，自然杀伤（NK）细胞能够清除原位移植的小鼠GL26和大鼠CNS-1肿瘤。

本实验的总体目标是表征并定量已浸润早期脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞数量。该方法有助于通过鉴定外周免疫细胞迁移至脑肿瘤微环境的关键因素，解答脑肿瘤免疫学领域的重要科学问题。该技术的主要优势在于，能够获得随时间变化的定量数据，反映进入中枢神经系统（CNS）的白细胞数量及其活化状态。将麻醉后的小鼠放入立体定位仪中，使用手术刀片从额骨至枕骨沿颅骨中线做一条两厘米长的切口。然后使用 Collibra 牵开器将切口处的皮肤牵开。随后，将装有33号针头的微升注射器下降至 bma 正上方。调整针头位置以到达肿瘤植入的目标位点。然后使用带有26号针头的1毫升结核菌素注射器，在该位置轻轻刮擦骨膜以标记此部位。在目标位点使用0.8毫米钻头钻孔穿透颅骨，直至到达下方的硬脑膜。施加间歇性压力，随后迅速将钻头从颅骨表面移开，以避免产生过多热量和施加过大压力。接下来，用0.9%氯化钠溶液冲洗微量注射器，并将液体排入1.7毫升锥形聚丙烯微量离心管中，以确保针头未被堵塞。轻轻弹击含有肿瘤细胞的0.6毫升锥形聚丙烯微量离心管数次，充分重悬细胞。然后用微升注射器吸取两微升细胞，确保注射器内无气泡。将一微升细胞滴加到70%异丙醇消毒垫上，使注射器中恰好剩余一微升肿瘤细胞。之后，将针头下移，直至接触硬脑膜。然后将针头向下插入脑内3.5毫米，并随后缓慢平稳地回撤0.5毫米。在1至2分钟内推动注射器活塞，注入细胞。对深度麻醉的小鼠进行心脏灌注。将钝针插入心脏的左心室。使用小型解剖剪剪开右心房，以促进放血，用台氏液灌注小鼠循环系统数分钟，直至肝脏和肺部因血液完全排出而变得苍白。确保右心房不再有大量血液流出。在从左心室移除20号铝制针座钝头针之前。移除针头后，将小鼠从挤出的聚苯乙烯泡沫块上取下，并将小鼠腹侧朝下放置。使用一把较大的解剖剪，将头部与身体其余部分分离。然后使用小型解剖剪刀从枕骨向吻部沿中线剪开头皮，以暴露颅骨。随后将颅骨两侧的皮肤向外牵开，并牢固固定头骨。使用骨用URS剪刀从枕骨处开始小心地凿开颅骨，并向前操作，完全暴露大脑的背侧和外侧表面。从小鼠颅骨中取出脑组织而不对其造成损伤，最初可能具有一定难度。不熟悉该技术的操作者可在正式实验前进行多次练习。去除颅骨后，将小鼠头部翻转至腹侧朝上。在脑基底部切断颅神经，以使脑组织脱离颅骨。在此步骤中，使用洁净的单刃剃须刀片，在脑正中做矢状切口，分离出包含肿瘤的脑区。为解剖分离两侧半球，将同侧半球内侧面朝下放置，于小脑处做一冠状切口，在嗅球处做另一切口，以分离出含有肿瘤植入物的目标组织。接下来，将目标组织放入已标记的玻璃组织研磨器中，加入一毫升 DPBS。将推杆完全推到底部并旋转七次，以破碎组织。随后，提起推杆，使液体重新沉降至组织研磨器底部。重复此步骤三次。但在接下来的两次重复中仅旋转活塞四次，在最后一次重复中旋转三次，以避免过度研磨脑组织。随后，将三份各一毫升的冰冻 DPBS 加入研杵壁面，以冲洗残留的脑组织进入组织研磨器中。然后通过反复吹打重悬 TRID 脑组织，并将其转移至预贴标签的 15 毫升离心管中，置于冰上。再用额外的一毫升冰冻 DPBS 冲洗组织研磨器壁面，并将冲洗液加入同一支 15 毫升离心管中。将所有含有TRID脑组织的离心管置于冰上，直至所有样品处理完毕。然后在4°C条件下，以740 ×g离心15毫升离心管中的TRID脑组织20分钟。接着弃去上清液，并将沉淀的脑组织重悬于1毫升预先配制的胶原酶和DNA酶I消化酶混合液中。将15毫升离心管放入试管架中，并将试管架置于37度细胞培养水浴中孵育15分钟。在孵育期间，轻轻弹动管壁两次，以促进组织解离。随后，向每根管中加入6毫升预冷的DPBS，以稀释消化酶。将液体反复吹打以重悬细胞，并通过无菌的70微米尼龙滤网过滤全部体积，收集至预先标记并置于冰上的新15毫升离心管中。随后，在4摄氏度条件下，以740 × g离心20分钟，使脑细胞悬液沉淀形成单细胞团。离心结束后，从离心机中取出15毫升离心管，立即放回冰上。然后将离心机的温度设置升高至约 21 摄氏度，为下一步操作做准备。接着，完全取出细胞沉淀，并使用 P1000 微量移液器将细胞沉淀团块初步重悬于 1 毫升 70% 密度的离心介质中。随后，向每根离心管中再加入 4 毫升 70% 密度的离心介质。将管盖拧紧，轻轻翻转离心管数次以充分混匀细胞悬液，随后将含有重悬于70%密度离心介质中的脑细胞的15毫升离心管从冰上逐个转移至室温下的试管架中。小心地将2毫升37%密度的离心介质溶液叠加到5毫升70%密度的离心介质上方，形成两层密度离心介质之间清晰的界面。然后用细头标记笔标记两层之间的界面位置，以便在离心后界面区分变得不明显时仍能轻松识别。将15毫升离心管在室温下以740 ×g离心20分钟，无刹车。为避免后续破坏密度梯度离心介质层之间的界面，通过将P200微量移液器插入离心管中，收集聚集在两层密度梯度离心介质界面处的外周血单个核细胞（PBMC）。在PBMC层水平处小心绕过脂质层，缓慢从70%密度梯度离心介质层表面吸取200微升液体，转移至预置冰上的相应标记的聚丙烯离心管中。重复此步骤一次，使每份样品总体积达到400微升。实验操作者在两种密度梯度离心介质层之间形成清晰界面的能力，对于可重复地分离PBMCs至关重要。应将37%密度的离心介质缓慢倒入离心管中，同时将离心管倾斜20至30度，使其高于实验台面。该图展示了典型实验的设门策略：在第五步中，设门于GR1阳性、CD11b阳性的髓系细胞；在第六步中，设门于NK1.1阳性的自然杀伤细胞；随后在第五步'和第六步'中，分别根据GZMB的表达水平对上述细胞进行分层分析。在此图中，通过FSCA与SSCA分析CD11b阳性髓系细胞和NK1.1阳性自然杀伤细胞的后门控结果，显示出自然杀伤细胞的淋巴样体积较小，而髓系细胞群体相对较大，从而进一步证实了这两种外周血单个核细胞亚群的身份。本图数据显示，将GL261-sitAl1胶质瘤细胞植入同系C57BL/6J小鼠脑内后，可迅速诱导CD45阳性外周血单个核细胞的募集；GL26-sitAl1曲线上各数据点所标注的数值表示肿瘤浸润性外周血单个核细胞数量相对于对照组的诱导倍数。GGL 26 坐标 NT 肿瘤在肿瘤植入后指定小时（HPI），依据所用特定抗体混合物进行检测。在示范中，GR1阳性、CD11b阳性髓系细胞以及NK1.1阳性自然杀伤细胞被证实可在肿瘤移植后48小时内特异性进入GAL1缺陷的肿瘤微环境。然而，浸润胶质瘤的髓系细胞总数远超过自然杀伤细胞。一旦掌握该方法，其流程将从脑组织采集到流式分析进行详细阐述。一名实验人员可在大约六小时内完成流式细胞分析。为了公平比较胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMC）的总数，必须将每个PBMC样本的全部体积通过流式细胞仪进行分析，以实现互补实验。可通过此类免疫组织化学分析获取免疫细胞浸润的空间分布数据，并在与本实验流程相对应的时间点测量整体肿瘤大小及显微解剖结构。该技术可应用于多种脑肿瘤模型的研究，包括利用编码癌基因的质粒DNA从头构建的模型，且无需对整体实验流程进行显著修改。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备胶质瘤细胞悬液以进行小鼠脑部的立体定位注射和移植，如何对携带弥漫性肿瘤的小鼠进行灌注，以及如何分离并利用流式细胞术分析浸润至外周血的单个核细胞。

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

分离和胶质瘤浸润外周血单个核细胞的流式细胞仪分析

本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。...

使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

本视频方案演示了如何应用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）根据细胞分裂频率来鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的不同细胞亚群。...

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

该视频展示了利用机械解离和酶消化法从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性外周血单个核细胞的过程。随后通过密度梯度离心收集免疫细胞，以用于后续分析。...

从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性免疫细胞

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

本方案旨在利用显色免疫组织化学法和ImageJ软件，对胶质母细胞瘤患者切除组织中的肿瘤微环境组分进行定量鉴定。...

患者胶质母细胞瘤切除组织中细胞微环境的定量免疫组织化学分析

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的...

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

我们介绍一种用于模拟胶质瘤侵袭前沿肿瘤微环境并包含间质液流的方法。该模型采用透明质酸-胶原蛋白I水凝胶，并置于组织培养插入式装置中，可施加流体压力。该系统可用于定量分析细胞侵袭行为，并可对细胞进行分离或裂解。...

一种具有间质流的光聚合透明质酸-胶原侵袭性胶质瘤微环境模型

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。...

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。...

微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

学习使用流式细胞术分离和分析胶质瘤浸润外周血单个核细胞的方法。该技术可定量评估免疫细胞数量及活化状态，为脑肿瘤免疫学研究提供时间依赖性数据。

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

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