胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

本实验的总体目标是表征并定量已浸润早期脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞数量。该方法有助于通过鉴定外周免疫细胞迁移至脑肿瘤微环境的关键因素，解答脑肿瘤免疫学领域的重要科学问题。该技术的主要优势在于，能够获得随时间变化的定量数据，反映进入中枢神经系统（CNS）的白细胞数量及其活化状态。

将麻醉后的小鼠放入立体定位仪中，使用手术刀片从额骨至枕骨沿颅骨中线做一条两厘米长的切口。然后使用 Collibra 牵开器将切口处的皮肤牵开。随后，将装有33号针头的微升注射器下降至 bma 正上方。

调整针头位置以到达肿瘤植入的目标位点。然后使用带有26号针头的1毫升结核菌素注射器，在该位置轻轻刮擦骨膜以标记此部位。在目标位点使用0.8毫米钻头钻孔穿透颅骨，直至到达下方的硬脑膜。

施加间歇性压力，随后迅速将钻头从颅骨表面移开，以避免产生过多热量和施加过大压力。接下来，用0.9%氯化钠溶液冲洗微量注射器，并将液体排入1.7毫升锥形聚丙烯微量离心管中，以确保针头未被堵塞。轻轻弹击含有肿瘤细胞的0.6毫升锥形聚丙烯微量离心管数次，充分重悬细胞。

然后用微升注射器吸取两微升细胞，确保注射器内无气泡。将一微升细胞滴加到70%异丙醇消毒垫上，使注射器中恰好剩余一微升肿瘤细胞。之后，将针头下移，直至接触硬脑膜。

然后将针头向下插入脑内3.5毫米，并随后缓慢平稳地回撤0.5毫米。在1至2分钟内推动注射器活塞，注入细胞。对深度麻醉的小鼠进行心脏灌注。

将钝针插入心脏的左心室。使用小型解剖剪剪开右心房，以促进放血，用台氏液灌注小鼠循环系统数分钟，直至肝脏和肺部因血液完全排出而变得苍白。确保右心房不再有大量血液流出。

在从左心室移除20号铝制针座钝头针之前。移除针头后，将小鼠从挤出的聚苯乙烯泡沫块上取下，并将小鼠腹侧朝下放置。使用一把较大的解剖剪，将头部与身体其余部分分离。

然后使用小型解剖剪刀从枕骨向吻部沿中线剪开头皮，以暴露颅骨。随后将颅骨两侧的皮肤向外牵开，并牢固固定头骨。使用骨用URS剪刀从枕骨处开始小心地凿开颅骨，并向前操作，完全暴露大脑的背侧和外侧表面。

从小鼠颅骨中取出脑组织而不对其造成损伤，最初可能具有一定难度。不熟悉该技术的操作者可在正式实验前进行多次练习。去除颅骨后，将小鼠头部翻转至腹侧朝上。

在脑基底部切断颅神经，以使脑组织脱离颅骨。在此步骤中，使用洁净的单刃剃须刀片，在脑正中做矢状切口，分离出包含肿瘤的脑区。为解剖分离两侧半球，将同侧半球内侧面朝下放置，于小脑处做一冠状切口，在嗅球处做另一切口，以分离出含有肿瘤植入物的目标组织。

接下来，将目标组织放入已标记的玻璃组织研磨器中，加入一毫升 DPBS。将推杆完全推到底部并旋转七次，以破碎组织。随后，提起推杆，使液体重新沉降至组织研磨器底部。

重复此步骤三次。但在接下来的两次重复中仅旋转活塞四次，在最后一次重复中旋转三次，以避免过度研磨脑组织。

随后，将三份各一毫升的冰冻 DPBS 加入研杵壁面，以冲洗残留的脑组织进入组织研磨器中。然后通过反复吹打重悬 TRID 脑组织，并将其转移至预贴标签的 15 毫升离心管中，置于冰上。再用额外的一毫升冰冻 DPBS 冲洗组织研磨器壁面，并将冲洗液加入同一支 15 毫升离心管中。

将所有含有TRID脑组织的离心管置于冰上，直至所有样品处理完毕。然后在4°C条件下，以740 ×g离心15毫升离心管中的TRID脑组织20分钟。接着弃去上清液，并将沉淀的脑组织重悬于1毫升预先配制的胶原酶和DNA酶I消化酶混合液中。

将15毫升离心管放入试管架中，并将试管架置于37度细胞培养水浴中孵育15分钟。在孵育期间，轻轻弹动管壁两次，以促进组织解离。随后，向每根管中加入6毫升预冷的DPBS，以稀释消化酶。

将液体反复吹打以重悬细胞，并通过无菌的70微米尼龙滤网过滤全部体积，收集至预先标记并置于冰上的新15毫升离心管中。随后，在4摄氏度条件下，以740 × g离心20分钟，使脑细胞悬液沉淀形成单细胞团。离心结束后，从离心机中取出15毫升离心管，立即放回冰上。

然后将离心机的温度设置升高至约 21 摄氏度，为下一步操作做准备。接着，完全取出细胞沉淀，并使用 P1000 微量移液器将细胞沉淀团块初步重悬于 1 毫升 70% 密度的离心介质中。随后，向每根离心管中再加入 4 毫升 70% 密度的离心介质。

将管盖拧紧，轻轻翻转离心管数次以充分混匀细胞悬液，随后将含有重悬于70%密度离心介质中的脑细胞的15毫升离心管从冰上逐个转移至室温下的试管架中。小心地将2毫升37%密度的离心介质溶液叠加到5毫升70%密度的离心介质上方，形成两层密度离心介质之间清晰的界面。

然后用细头标记笔标记两层之间的界面位置，以便在离心后界面区分变得不明显时仍能轻松识别。将15毫升离心管在室温下以740 ×g离心20分钟，无刹车。为避免后续破坏密度梯度离心介质层之间的界面，通过将P200微量移液器插入离心管中，收集聚集在两层密度梯度离心介质界面处的外周血单个核细胞（PBMC）。

在PBMC层水平处小心绕过脂质层，缓慢从70%密度梯度离心介质层表面吸取200微升液体，转移至预置冰上的相应标记的聚丙烯离心管中。重复此步骤一次，使每份样品总体积达到400微升。实验操作者在两种密度梯度离心介质层之间形成清晰界面的能力，对于可重复地分离PBMCs至关重要。

应将37%密度的离心介质缓慢倒入离心管中，同时将离心管倾斜20至30度，使其高于实验台面。该图展示了典型实验的设门策略：在第五步中，设门于GR1阳性、CD11b阳性的髓系细胞；在第六步中，设门于NK1.1阳性的自然杀伤细胞；随后在第五步'和第六步'中，分别根据GZMB的表达水平对上述细胞进行分层分析。

在此图中，通过FSCA与SSCA分析CD11b阳性髓系细胞和NK1.1阳性自然杀伤细胞的后门控结果，显示出自然杀伤细胞的淋巴样体积较小，而髓系细胞群体相对较大，从而进一步证实了这两种外周血单个核细胞亚群的身份。本图数据显示，将GL261-sitAl1胶质瘤细胞植入同系C57BL/6J小鼠脑内后，可迅速诱导CD45阳性外周血单个核细胞的募集；GL26-sitAl1曲线上各数据点所标注的数值表示肿瘤浸润性外周血单个核细胞数量相对于对照组的诱导倍数。

GGL 26 坐标 NT 肿瘤在肿瘤植入后指定小时（HPI），依据所用特定抗体混合物进行检测。在示范中，GR1阳性、CD11b阳性髓系细胞以及NK1.1阳性自然杀伤细胞被证实可在肿瘤移植后48小时内特异性进入GAL1缺陷的肿瘤微环境。然而，浸润胶质瘤的髓系细胞总数远超过自然杀伤细胞。一旦掌握该方法，其流程将从脑组织采集到流式分析进行详细阐述。

一名实验人员可在大约六小时内完成流式细胞分析。为了公平比较胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMC）的总数，必须将每个PBMC样本的全部体积通过流式细胞仪进行分析，以实现互补实验。可通过此类免疫组织化学分析获取免疫细胞浸润的空间分布数据，并在与本实验流程相对应的时间点测量整体肿瘤大小及显微解剖结构。

该技术可应用于多种脑肿瘤模型的研究，包括利用编码癌基因的质粒DNA从头构建的模型，且无需对整体实验流程进行显著修改。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备胶质瘤细胞悬液以进行小鼠脑部的立体定位注射和移植，如何对携带弥漫性肿瘤的小鼠进行灌注，以及如何分离并利用流式细胞术分析浸润至外周血的单个核细胞。