用于测量小鼠睡眠的多导生理记录操作流程
2016年1月25日
在自由活动的小鼠中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）是将行为与睡眠和觉醒的生理状态相关联的关键步骤。本文所述的实验方案提供了一种基于电缆的系统，用于在小鼠中获取脑电图和肌电图记录。
该多导生理记录方法的总体目标是确定小鼠的警觉状态，并测量其处于清醒、快速眼动睡眠或非快速眼动睡眠的时间。该方法有助于回答神经科学几乎所有领域中的关键问题，即在行为动物中将行为和生理活动与皮层神经元的活动相关联。该技术的主要优势在于，它能够记录多个神经信号节点、脑电图和肌电图，并可与其他脑内植入装置（如光纤和输注导管）结合使用。
该方法的可视化演示非常重要，因为电极的植入必须正确操作，且电极的质量对于判断生理状态极为关键。本次操作将由我实验室的博士后Yohko Takata进行演示。开始之前，请使用热珠灭菌器对所有手术器械进行灭菌处理。
通过脚趾夹捏确认小鼠已麻醉后，剃除其头部和颈部的毛发。接着，将小鼠固定于立体定位仪上，并用两侧耳杆固定头部。然后，向眼睛涂抹眼膏以防止角膜干燥。
使用酒精和含碘消毒剂清洁已剃毛的皮肤。然后，用手术刀沿中线切开皮肤以暴露颅骨，并用夹子将皮肤固定于两侧，以保持手术区域开放。使用0.8毫米钻头的碳化钨钻头，在颅骨上钻两个孔。
在额叶皮层区域上方钻一个孔，第二个孔置于右侧半球的顶叶区域上方。接着，使用钟表匠螺丝刀将不锈钢脑电记录螺钉旋入孔中。
将螺钉旋入两到两圈半，以确保其在大脑皮层上方达到硬膜外定位。螺钉插入后不应晃动。这一点非常重要。
现在，将电极组件固定在颅骨上，针脚朝上。电极必须垂直贴附。使用棉签辅助固定电极位置，先用氰基丙烯酸酯胶水粘合电极，再用牙科水泥加固。
接下来，在斜方肌上制作小孔，并将肌电图电极插入这些孔中。然后，使用直径为0.1毫米的丝线缝合皮肤。现在，将小鼠从立体定位仪上取下，并放置在加热垫上。
给小鼠腹腔注射氨苄青霉素和美洛昔康，并监测小鼠直至其恢复胸卧位。随后将小鼠单独饲养。植入电极一周后，将小鼠转移至隔音记录室内的实验笼中。
将小鼠的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）电极组件固定，并连接至与滑环相连的记录电缆。将模数转换器（AD转换器）电缆连接至与滑环相连的EEG/EMG信号滤波放大器。使用AD转换器将信号转换为128赫兹的数字信号，最后将信号记录到计算机中。
将小鼠在记录室中适应2至3天。如果脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录过程中涉及药物给药，则在每次给药当天均需轻柔地抓握处理小鼠。随后，启动脑电图/肌电图记录软件。
首先，点击“数据文件信息”选项卡，然后勾选“文件名”旁边的复选框。输入文件名后点击“保存”。接着，在“记录条件”选项卡中，选择所有需要记录的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）通道。
此外，在此选项卡下选择采样频率。现在，在通道信息选项卡中，检查所选通道是否正确显示。确认无误后，首先选择定时设置选项卡，然后开始记录。
然后，单击“监控”以显示脑电图（EEG）和肌电图（EMG）。如果信号显示正确，在主计时器区域设置记录开始和结束的时钟时间。接着，单击“监控”按钮以开始记录。
现在，在基线条件和不同处理条件下，连续数天记录信号。实验结束后，使用戊巴比妥处死小鼠。启动脑电图/肌电图分析软件。
打开EEG/EMG原始数据（KCD文件）。点击“Sleep”标签页，将Epoch时间设置为10秒。然后选择“Multi-screening”，系统将根据EEG和EMG信号的振幅以及EEG的功率谱分析，自动将每10秒的片段分为三个阶段。
接下来，单击 EEG 选项卡中的 FFT 条件。在其中设置功率谱分析的参数：每 2 秒 EEG 数据使用 256 个数据点，采用汉宁窗函数，并对每个时间段取五个谱的平均值。
然后点击“确定”。接着，点击“开始筛选”以启动自动筛选。随后，打开以 RAF 文件格式保存的存储数据，并检查自动筛选的结果。如有必要，若结果不符合标准标准，则进行修正。
要进行校正，请在评分错误的时段时间段上按住鼠标左键，然后将光标拖动至一系列评分错误的时段时间段上。松开鼠标左键后，在弹出窗口中选择正确的行为状态。在基线条件下，小鼠表现出与其夜行性特征一致的清晰昼夜节律性睡眠-觉醒节律。
在12小时光照期间，小鼠平均经历了6.7小时的非快速眼动（NREM）睡眠和0.9小时的快速眼动（REM）睡眠。而在其12小时黑暗期间，觉醒状态占主导。其他测量指标也被记录下来。
这些指标包括睡眠时相的分布、各时相的平均持续时间，以及每个警觉状态之间的转换。NREM 和 REM 睡眠的脑电图（EEG）功率谱显示，NREM 睡眠在 0.5 至 4 赫兹频率范围内的脑电功率密度显著高于 REM 睡眠在 6 至 10 赫兹频率范围内的功率密度。为了评估咖啡因对睡眠的影响，C57 black 6 小鼠在第一天接受溶剂处理，第二天则接受咖啡因处理。
在光照周期的早期给予咖啡因腹腔注射。正如预期，记录结果显示咖啡因增加了小鼠的觉醒时间。注射后三小时内，觉醒时间增加了三倍。
一旦掌握，电极植入手术可在20分钟内完成。对24小时的脑电图数据进行评分和校正大约需要30分钟。观看本视频后，您应能充分了解如何在小鼠中建立脑电图和肌电图记录，以及如何评估动物是否处于清醒状态及其清醒或睡眠的持续时间。
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概述
本文详细介绍了一种通过脑电图（EEG）和肌电图（EMG）测量来评估自由活动小鼠警觉状态的多导生理记录方法。该方法使研究人员能够将行为与生理活动同睡眠状态相关联，从而深入了解皮层神经元的活动情况。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 行为分析
背景
- 脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录对于研究睡眠与清醒状态至关重要。
- 该技术可与其他脑部植入装置结合使用，以实现全面的数据采集。
- 正确的电极植入对于获得准确测量结果至关重要。
- 可视化演示有助于加深对手术操作步骤的理解。
研究目的
- 确定小鼠的清醒状态。
- 测量小鼠在不同睡眠状态下的持续时间。
- 将生理数据与行为学观察结果进行关联分析。
使用的方法
- 小鼠脑电图和肌电图的多导生理记录。
- 使用基于电缆的系统进行数据采集。
- 在无菌条件下进行电极的手术植入。
- 植入操作的可视化演示。
主要结果
- 成功记录多种生理信号。
- 能够评估自由活动小鼠的睡眠与清醒状态。
- 可与其他实验装置整合。
- 电极放置的质量显著影响数据的准确性。
结论
- 该方法对于理解行为与生理之间的关系至关重要。
- 它为未来在各个神经科学领域的研究提供了框架。
- 正确的技术和设备对于获得可靠结果至关重要。
常见问题
行业重要性概述
在临床前模型中准确评估睡眠-觉醒状态对于将行为表型与潜在神经活动相关联，从而降低靶向中枢神经系统药物候选物的风险至关重要。该多导生理记录方法可对自由活动小鼠的警觉状态进行定量、纵向监测，支持睡眠调节类化合物的作用机制验证。该技术实现了从靶点结合到功能输出的转化连续性，为早期发现阶段的决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将由脑电图（EEG）/肌电图（EMG）定义的睡眠状态与药理学或遗传学干预相关联，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过客观、可量化的警觉状态测量，支持功能靶点的验证，从而降低机制上的不确定性。
- 预测价值：生成剂量-反应和时间进程数据，增强对靶点结合及通路调节的信心。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成标准化、高保真的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）信号，适用于基于频谱分析和幅度阈值的自动化评分流程。
- 定量输出：提供基于时间段的清醒、非快速眼动睡眠（NREM）和快速眼动睡眠（REM）分类结果，支持可重复的组间比较。
- 可扩展性：兼容慢性记录装置，可用于在不同处理条件和昼夜节律周期中进行长期纵向评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过可量化的非快速眼动（NREM）和快速眼动（REM）睡眠指标模拟人类睡眠结构，支持睡眠障碍及神经精神疾病的研究。
- 转化生物标志物一致性：脑电图（EEG）功率谱变化（NREM期为0.5–4 Hz的δ波，REM期为6–10 Hz的θ波）可作为睡眠状态转换的可量化生物标志物。
- 风险校正后的进展评估：睡眠-觉醒分布数据有助于临床前安全性及有效性评估，尤其适用于影响觉醒或镇静作用的中枢神经系统活性化合物。
流程与工作流整合
该方法可融入从假设验证到先导化合物优化的整个发现流程，提供生理学读数，从而在神经精神药物研发中架起分子干预与行为输出之间的桥梁。
- 发现生物学：通过细胞类型特异性的操控结合生理学读出，促进对调控觉醒及睡眠-觉醒转换的神经环路进行假设驱动型研究。
- 筛选：提供即用型、可重复的警觉状态监测方法，用于评估化合物在24小时周期内对睡眠结构的影响。
- 分析：功率谱分析和自动分段评分可提供定量、可比较的读数，用于评估药物诱导的睡眠时长和睡眠片段化变化。
- 转化研究：在遗传可操控的系统中模拟人类睡眠脑电图表型和昼夜节律调控，支持向临床前验证的顺利过渡。
- 企业级复用：可重复使用的手术与记录基础设施支持跨多个项目的纵向研究，降低每个研究项目的设置负担。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少分子效应与睡眠-觉醒功能结果之间的不确定性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化的电极植入和信号采集流程增强了不同实验室及实验批次间的可重复性。
- 战略价值：能够更早识别脱靶的中枢神经系统效应，提高资金使用效率，并减少因未预期的睡眠干扰导致的后期研发失败。
- 项目组合影响：基于化合物的睡眠-觉醒风险特征支持进行风险调整后的优先级排序，使推进决策与治疗指数考量保持一致。
实施注意事项
- 需要具备立体定位手术、脑电图（EEG）/肌电图（EMG）信号采集以及用于睡眠分期的频谱分析方面的专业知识。
- 依赖于稳定的记录系统，包括滑环、放大器以及能够进行基于快速傅里叶变换（FFT）的脑电图分析和自动状态分类的软件。
- 需要跨团队统一电极放置位置、滤波参数和评分标准，以确保数据的可比性。
- 适应性考虑因素包括针对不同小鼠品系、年龄或共病模型进行调整，这些因素可能改变基础睡眠结构或信号质量。
- 实际限制包括手术恢复时间、束缚带来的行为限制，以及需要让动物适应记录舱以尽量减少应激引起的睡眠片段化。
