Name: 交变磁场敏感的混合明胶微凝胶药物控释 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习利用明胶微凝胶与超顺磁性氧化铁纳米颗粒及温敏性PNIPAM共聚物制备磁热响应型药物控释平台的方法。该技术通过交变磁场实现可控释药，为按需给药系统提供新途径。

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本研究由Farris Family Innovation Award和美国国立卫生研究院（NIH）1R01NR015674-01项目资助，授予MK。作者感谢Josep Nayfach（Qteris, Inc）提供电磁发生器系统及其技术咨询。作者还感谢Huan Yan（LCI &amp;#38; 化学物理交叉学科项目，肯特州立大学）提供技术支持。

注意：明胶磁响应微凝胶的制备整体流程如图1A所示。
1. 溶液和悬液的制备
<ol>
	<li>通过将 20 mg 的交联剂京尼平（genipin）溶解于 2 ml 磷酸盐缓冲液（1× PBS；pH 7.4）中，配制 1%（w/v）的京尼平溶液。涡旋混合溶液，并置于 50 oC 水浴中 2 小时，以确保完全溶解。</li>
	<li>通过将 20 mg 聚（乙二醇）-聚（丙二醇）-聚（乙二醇）（Mw = 2,900 Da；简称 L64）溶解于 200 ml PBS 中，配制浓度为 100 ppm 的表面活性剂溶液。</li>
	<li>通过将 64.5 mg 明胶溶解于 0.43 ml PBS 中，配制 15%（w/v）的明胶溶液。涡旋混合溶液，并将其置于 37 oC 水浴中，直至溶液达到溶胶相（即溶液变为流动状态）。随后，涡旋混合明胶溶液 2 至 3 次，以确保样品均匀。</li>
	<li>p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 溶液与模型药物（BSA）的制备：
	<ol>
		<li>将 10.75 mg 亲水性磁性纳米颗粒（MNPs）分散于 0.43 ml PBS 中，然后将 12.9 mg p(NIPAM-co-AAm) 溶解于该 MNP 悬液中，使终浓度为 3%（w/v）。提高 p(NIPAM-co-AAm) 的浓度可增强微凝胶的去溶胀行为。</li>
		<li>使用德克萨斯红标记的牛血清白蛋白（TR-BSA；Mw ~66 kDa）作为模型药物。将 0.5 mg TR-BSA 溶解于 p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 混合物中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 混合物（0.43 ml）加入明胶溶液（0.43 ml）中，制备明胶/p(NIPAM-co-AAm)/MNPs/BSA 混合溶液（总体积 0.86 ml），并充分涡旋混合，以获得均匀溶液。因此，聚合物和 MNPs 在最终混合物中的浓度为初始浓度的一半。</li>
</ol>
2. 乳化
<ol>
	<li>将15 ml硅油[聚二甲基硅氧烷（黏度350 cSt）]倒入洁净无菌的烧杯中。</li>
	<li>立即加入预先配制的明胶/p(NIPAM-co-AAm)/磁性纳米颗粒/牛血清白蛋白水溶液（0.86 ml），倒入硅油中，并在30 oC下以900 rpm的转速用磁力搅拌子搅拌30分钟，使水相混合物在油相中乳化。</li>
</ol>
3. 微液滴的凝胶化及其向水溶液的转移
<ol>
	<li>将乳液（约16 ml）从烧杯转移至50 ml离心管中。</li>
	<li>在4 °C下冷却离心管10分钟，使油相中的微滴发生凝胶化。</li>
	<li>用预冷至4 oC的L64溶液将离心管加满至50 ml，并剧烈振荡离心管。部分L64表面活性剂可能进入微凝胶内部。</li>
	<li>在4 oC条件下，以2,300 × g离心20分钟。</li>
	<li>定期检查离心管壁是否有凝胶颗粒沉淀形成。若未观察到颗粒沉淀，需在&#160;相同转速和温度下继续离心20分钟。随后小心移除上清液，避免扰动管内壁形成的沉淀。</li>
	<li>重复步骤（3.3）至（3.5）一次。每次操作均应将样品转移至新的离心管中，以避免微凝胶悬浮液中混入油滴。此步骤完成后，应确保样品悬浮液中无表面活性剂或油滴残留。然而，重复的分离步骤可能导致初始材料的损失。</li>
</ol>
4. 微凝胶的共价交联
<ol>
	<li>向凝胶颗粒沉淀中加入 2 ml 京尼平溶液（按第 1 节制备），并通过涡旋振荡充分混匀。</li>
	<li>迅速将悬浮液转移至 23 oC 水浴中，以启动共价交联反应，并在所需的交联时间（例如，5 - 120 分钟）内完成反应。</li>
	<li>交联完成后，立即弃去多余的交联剂：移除京尼平溶液，用 PBS 重悬微凝胶，然后在 4 oC 条件下以 2,300 × g 离心 20 分钟。如有需要，可用移液器吸头小心打碎形成的沉淀。若溶液中仍有残留的京尼平，此洗涤步骤可重复最多 3 次。</li>
	<li>弃去上清液，并通过血细胞计数板计数后，用 PBS 将微凝胶重悬至所需浓度（例如，5 × 106 个微凝胶/ml）。</li>
	<li>进行显微观察时，将微凝胶悬浮液加样至载玻片与盖玻片之间的空间，并用环氧树脂密封盖玻片边缘。</li>
</ol>
5. 应用交变磁场触发药物释放
<ol>
	<li>将含有所需浓度微凝胶的试管放入磁线圈腔室中。如有必要，将光纤温度探头插入试管，以监测施加交变磁场（AMF）过程中介质的温度变化。</li>
	<li>施加高频（&#62;100 kHz）交变磁场，设定特定场强（&#62;5 kA/m）并持续一定时间。施加AMF后，将样品管在2,273 × g离心20分钟（4 oC），收集上清液，通过分光光度法测定从微凝胶释放到周围介质中的TR-BSA含量。德克萨斯红的激发波长和发射波长分别为584 nm和612 nm。</li>
</ol>

<ol><li>Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%3A+one+laboratory%27s+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in drug delivery and tissue engineering: one laboratory's experience.</a> Acc. Chem. Res. 33, 94-101 (2000).</li>
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<li>Kawaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+microhydrogels%3A+preparation%2C+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Int%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive microhydrogels: preparation, properties and applications.</a> Polym. Int. 63, 925-932 (2014).</li>
<li>Vinogradov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+microgels+in+drug+delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Colloidal microgels in drug delivery applications.</a> Curr. Pharm. Des. 12, 4703-4712 (2006).</li>
<li>Liechty, W. B., Kryscio, D. R., Slaughter, B. V., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Polymers for drug delivery systems.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 1, 149-173 (2010).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).</li>
<li>Shibayama, M., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+Phase-Transition+and+Related+Phenomena+of+Polymer+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Volume Phase-Transition and Related Phenomena of Polymer Gels.</a> Adv Polym Sci. 109, 1-62 (1993).</li>
<li>Sung, B., Kim, C., Kim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+colloidal+microgels+with+tunable+thermosensitive+volume+phase+transitions+for+controllable+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Biodegradable colloidal microgels with tunable thermosensitive volume phase transitions for controllable drug delivery.</a> J Colloid Interface Sci. 450, 26-33 (2015).</li>
<li>Kumar, C. S., Mohammad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanomaterials+for+hyperthermia-based+therapy+and+controlled+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 789-808 (2011).</li>
<li>Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+nanocarriers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery.</a> Nat. Mater. 12, 991-1003 (2013).</li>
<li>Kong, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+field+activated+lipid-polymer+hybrid+nanoparticles+for+stimuli-responsive+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Magnetic field activated lipid-polymer hybrid nanoparticles for stimuli-responsive drug release.</a> Acta biomaterialia. 9, 5447-5452 (2013).</li>
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<li>Suzuki, D., Kawaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-sensitive+core%2Fshell+template+particles+for+immobilizing+inorganic+nanoparticles+in+the+core%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Stimuli-sensitive core/shell template particles for immobilizing inorganic nanoparticles in the core.</a> Colloid Polym Sci. 284, 1443-1451 (2006).</li>
<li>Bhattacharya, S., Eckert, F., Boyko, V., Pich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-%2C+pH-%2C+and+magnetic-field-sensitive+hybrid+microgels%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Temperature-, pH-, and magnetic-field-sensitive hybrid microgels.</a> Small. 3, 650-657 (2007).</li>
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<li>Cooperstein, M. A., Canavan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cytotoxicity+of+%28N-isopropyl+acrylamide%29+and+poly%28N-isopropyl+acrylamide%29-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Assessment of cytotoxicity of (N-isopropyl acrylamide) and poly(N-isopropyl acrylamide)-coated surfaces.</a> Biointerphases. 8, 19(2013).</li>
<li>Jorgensen, L., Moeller, E. H., van de Weert, M., Nielsen, H. M., Frokjaer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+evaluating+delivery+systems+for+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparing and evaluating delivery systems for proteins.</a> Eur J Pharm Sci. 29, 174-182 (2006).</li>
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<li>Liang, H. C., Chang, W. H., Lin, K. J., Sung, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin-crosslinked+gelatin+microspheres+as+a+drug+carrier+for+intramuscular+administration%3A+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Genipin-crosslinked gelatin microspheres as a drug carrier for intramuscular administration: in vitro and in vivo studies.</a> J Biomed Mater Res. Part A. 65, 271-282 (2003).</li>
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<li>Ivkov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high+amplitude+alternating+magnetic+fields+for+heat+induction+of+nanoparticles+localized+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Application of high amplitude alternating magnetic fields for heat induction of nanoparticles localized in cancer.</a> Clin Cancer Res. 11, 7093s-7103s (2005).</li>
<li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> J Control Release. 142, 149-159 (2010).</li>
<li>Malafaya, P. B., Silva, G. A., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural-origin+polymers+as+carriers+and+scaffolds+for+biomolecules+and+cell+delivery+in+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 207-233 (2007).</li>
<li>Shah, R., Kim, J., Agresti, J., Weitz, D., Chu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+monodisperse+thermosensitive+microgels+and+gel+capsules+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Fabrication of monodisperse thermosensitive microgels and gel capsules in microfluidic devices.</a> Soft Matter. 4, 2303-2309 (2008).</li>
<li>Hoare, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+triggered+nanocomposite+membranes%3A+a+versatile+platform+for+triggered+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Magnetically triggered nanocomposite membranes: a versatile platform for triggered drug release.</a> Nano letters. 11, 1395-1400 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本文所述技术展示了利用纳米颗粒-微凝胶杂化材料实现磁热触发药物释放的概念验证。该目标通过将MNPs和p(NIPAM-co在由京尼平交联的微米级三维明胶网络中，-AAm）链能够响应远程施加的交变磁场（AMF），使磁响应平台在微凝胶内产生热量，进而触发模型药物牛血清白蛋白（BSA）的释放。
将磁性纳米颗粒（MNPs）和 p(NIPAM-co-AAm) 同时包埋的策略对于实现明胶微凝胶中理想的药物释放至关重要，因为在未引入 p(NIPAM-co-AAm) 的情况下，明胶/MNPs 微凝胶中牛血清白蛋白（BSA）的释放程度显著低于含有 p(NIPAM-co-AAm) 的微凝胶，尽管两种微凝胶在交变磁场（AMF）作用下的升温幅度相似（图 2C 和 2D）。我们证明，明胶/p(NIPAM-co-AAm) 微凝胶的去溶胀行为是由 p(NIPAM-co-AAm) 聚合物链在温度升高时发生收缩所引发的；此外，该去溶胀行为与微凝胶中药物释放的程度呈正相关<sup...

能够响应内源性或外源性刺激（例如，温度或pH）并实现精确控制药物释放的刺激响应型药物递送系统，已被广泛研究作为新型智能软体药物递送装置。微尺度水凝胶因其可调控且可持续的药物释放特性，以及可调节的化学和力学性能，已被广泛用作药物递送平台1-3。特别是，胶体微凝胶作为药物递送载体具有诸多优势，包括对外部刺激的快速响应性，以及以微创方式向局部组织注射的适宜性4。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）或其共聚物已被广泛用于合成温敏型微凝胶，通常通过将pNIPAM接枝到可生物降解/生物相容性聚合物（如明胶、壳聚糖、海藻酸或透明质酸）上实现5,6，其中pNIPAM在其低临界溶解温度（LCST）下的相变特性可作为药物释放的触发机制7。我们近期报道了一种可生物降解的、基于明胶的温敏型微凝胶的制备方法，即在三维明胶网络中引入聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺）[p(NIPAM-共-AAm)]链作为次要组分8。该明胶/p(NIPAM-共-AAm)微凝胶表现出对温度升高的可调控去溶胀行为，并与牛血清白蛋白（BSA）的释放呈正相关。
近年来，人们 increasingly 致力于开发一种磁响应性药物递送平台，该平台能够按需触发药物释放9,10磁响应性药物递送平台的合成基本原理是利用超顺磁性纳米颗粒（MNPs）在接收高频交变磁场（AMF）时产生热量的特性，从而触发温度敏感性药物释放。该系统有望应用于未来的临床实践，因其可实现深层组织靶向、无创且可远程控制的药物释放，并可与热疗及磁共振成像系统相结合。10-12此类平台包括：（1）MNPs/pNIPAM杂合微凝胶颗粒 13-15 以及（2）含有固定化磁性纳米颗粒（MNPs）的宏观水凝胶支架16-18基于 pNIPAM 的微凝胶平台表现出对磁热刺激精细可调的体积相变响应性。然而，其制备仍依赖复杂且精密的技术，且高含量的 pNIPAM 聚合物可能对细胞具有潜在的细胞毒性19，这可能会限制它们的 体内 应用方面，与胶体微凝胶相比，宏观支架对外部刺激的响应较慢，且需要通过侵入性外科手术进行移植。
水包油乳化法一直是制备亚毫米级或微米级凝胶颗粒的标准方法20。在乳液的水-油界面处，由于在机械剪切力作用下水相液滴的表面能最小化，微凝胶颗粒形成球形结构。该方法可通过简单的制备工艺大量生产水性球形凝胶液滴，已被成功应用于制备用于药物递送的明胶基微凝胶21-23。
在此，我们介绍一种简便的方法，通过水包油乳化法合成具有磁热响应性的明胶基微凝胶，用于药物递送。该方法通过物理包埋氧化铁磁性纳米粒子和p(NIPAM-co-AAm）链作为球形微米级明胶网络中的次要组分，该网络通过天然来源的交联剂京尼平进行共价交联，并结合高频交变磁场（AMF）施加系统。

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>G2500</td><td>A型明胶，猪皮来源</td></tr><tr><td>聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>738727</td><td>分子量 = 20,000，低临界溶解温度 = 34 - 38 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>硅油</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>378372</td><td>黏度 350 cSt</td></tr><tr><td>泊洛沙姆 L64</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>435449</td><td>聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)</td></tr><tr><td>京尼平</td><td>TimTec LLC, DE, USA</td><td>ST080860</td><td>分子量 = 226.23</td></tr><tr><td>磁性纳米颗粒 (MNPs)</td><td>Micromod Inc, Germany</td><td>79-00-102</td><td>nanomag-D-spio，100 nm</td></tr><tr><td>TR-BSA</td><td>Life Technologies, NY USA</td><td>A23017</td><td>牛血清白蛋白 (BSA)，德克萨斯红偶联物</td></tr></tbody></table>

响应交变磁场的杂化明胶微凝胶用于可控药物释放

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

可实现精确控制、按需释放药物的磁响应型纳米/微米级工程化生物材料已被开发为用于生物医学应用的新型智能软体器件。尽管已有多种磁响应型药物递送系统通过不同方式展示了其有效性，但 体外 概念验证研究或 体内 临床前应用中，其在临床环境中的使用仍受限于生物相容性或生物可降解性不足。此外，许多现有平台依赖复杂的制备技术。我们近期展示了通过物理包埋聚（N-异丙基丙烯酰胺-co在本研究中，我们展示了一种简便的方法，用于制备一种可生物降解的药物释放平台，该平台能够实现磁热触发的药物释放。该方法通过在明胶基胶体微凝胶中引入超顺磁性氧化铁纳米颗粒和热响应性聚合物，并结合交变磁场施加系统而实现。其中，聚（N-异丙基丙烯酰胺）链作为次要组分存在于三维明胶网络中。

当正确执行该方案时，所制备的微凝胶应表现出明确的球形形貌和胶体分散性，直径范围在 5 μm 至 20 μm 之间（图 1B 和 C）。可使用荧光标记的磁性纳米颗粒（MNPs）或荧光标记的牛血清白蛋白（BSA），以确认 MNPs 或药物（本研究中为 BSA）是否成功包封于微凝胶内部（图 1D）。所制备的微凝胶在无酶降解剂（如胶原酶）存在的条件下，可在 4 oC 稳定保存长达 4 周。在明胶微凝胶中引入 p(NIPAM-co-AAm) 可使其表现出温度依赖性的体积变化（图 2A），当介质温度从 22 oC 升高至 42 oC 时，含 p(NIPAM-co-AAm) 的明胶微凝胶体积收缩约 40%，而未含 p(NIPAM-co-AAm) 的明胶微凝胶体积变化仅约 10%（图 2B）。明胶/p(NIPAM-co...

我们提出一种简便的方法，用于制备一种可生物降解、基于明胶且具有磁热响应性的药物释放平台。该平台通过将超顺磁性氧化铁纳米颗粒和聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺）引入由京尼平交联的球形明胶微网络中，并结合交变磁场应用系统而实现。

可实现精确控制、按需释放药物的磁响应性纳米/微米工程生物材料已被开发为新型...

本实验方案的总体目标是介绍一种简便的方法，用于制备具有磁热响应特性的纳米颗粒-微凝胶杂化材料，并验证该杂化微凝胶在可控药物释放中的概念可行性。本方案的主要优势在于其过程相对简单，仅需将磁性纳米颗粒和温敏性PNIPAM共聚物包埋于明胶基质中，即可赋予微凝胶磁热响应特性。当纳米颗粒响应交变磁场而升温时，PNIPAM共聚物随之发生温度依赖性溶胀，从而实现药物在交变磁场刺激下的可控释放。该技术的应用前景包括开发按需药物递送系统，因为这种可调控的药物释放平台能够响应由无创外部刺激诱导的多次开启和关闭循环。制备磁场响应性明胶微凝胶的过程首先需要在悬浮液中配制溶液。基础溶液的配制方法在文本方案中有详细描述。配制明胶溶液时，将其置于水浴中直至达到流动相，然后用涡旋振荡器充分混匀。将所有溶液配制完成后，取等体积的明胶溶液与含有磁性纳米颗粒的PNIPAM共聚物溶液混合，并充分涡旋振荡混合物。下一步是将水相混合物在硅油中乳化，然后施加表面活性剂包衣。将15 ml硅油倒入无菌烧杯中，立即加入0.86 ml已制备的混合物。然后在30摄氏度下以900 rpm转速搅拌混合物30分钟。制备乳液后，将其转移至50 ml离心管中，并在4°C下冷却10分钟。此时微滴将在油相中形成。接下来，用Pluronic L-64表面活性剂溶液几乎充满该离心管，冷却至4°C，并剧烈振荡离心管，使L-64分子吸附到凝胶表面，从而稳定微凝胶悬浮液。然后在4°C条件下，以2300 ×g离心20分钟。20分钟后，检查管底是否有凝胶颗粒沉淀。重复离心步骤，直至观察到沉淀。然后小心移除上清液，并用预冷的 L-64 溶液将离心管补至 45 ml。剧烈振荡试管，使沉淀的微凝胶充分分散于表面活性剂中。随后将悬浮液转移至新的 50 ml 离心管中。然后重复离心过程，再次收集微凝胶沉淀。此时，为确保样品悬浮液中无任何表面活性剂或油滴残留，需彻底吸除上清液。接下来制备微凝胶的步骤是交联其明胶基质。首先，将沉淀重悬于2 ml已配制的京尼平溶液中，使用涡旋振荡器混匀。然后迅速将悬液转移至23摄氏度水浴中，以启动共价交联反应。反应可进行五分钟至两小时。反应完成后，去除过量交联剂。将样品于4°C、2300 G离心20分钟，操作同前。然后，吸出并弃去上清液。用 PBS 重复洗涤共三次，必要时用移液器枪头轻轻吹打重悬沉淀。彻底去除未反应的过量交联剂至关重要。最后一次洗涤后，用 PBS 将微凝胶重悬至所需密度。使用血细胞计数板测定其密度。若无胶原酶等降解剂存在，制备的微凝胶在 4 °C 条件下可稳定保存长达四周。通过显微镜表征微凝胶时，将其加载到载玻片上，并用环氧树脂在盖玻片下密封。该实验步骤的最后一步是测定微凝胶的药物释放。将含有所需浓度微凝胶的试管放入磁线圈腔室中。然后，插入光纤温度探头以监测施加交变磁场过程中的温度变化。现在，在设定的场强下施加高频交变磁场，并持续特定时间。处理结束后，将离心管在4摄氏度、2300 G的条件下离心20分钟。收集上清液，以定量测定从微凝胶中释放的药物量。本实验中，使用分光光度法检测德克萨斯红。所制备的微凝胶应表现出明确的球形形貌和胶体分散性，直径在5至20微米之间。可使用荧光超顺磁性纳米颗粒或荧光标记的牛血清白蛋白（BSA）来验证其在微凝胶内的正确包封。PNIPAM 共聚物被包埋在明胶微凝胶基质中，使其能够表现出温度依赖性的体积变化。当培养环境温度从 22 升高至 42 摄氏度时，含 PNIPAM 共聚物的明胶微凝胶体积收缩约 40%；相比之下，不含 PNIPAM 共聚物的明胶微凝胶仅观察到 10% 的体积收缩。当将超顺磁性纳米颗粒掺入明胶-PNIPAM共聚物微凝胶时，微凝胶在暴露于适当的交变磁场后温度升高。从这些微凝胶中测得的TRBSA释放量约为35%。若未将共聚物掺入微凝胶中，则TRBSA的释放量显著降低，仅约为10%。因此，BSA在交变磁场作用下的释放很可能是由于微凝胶内部PNIPAM共聚物链收缩引起的去溶胀所致。观看本视频后，您应能充分理解如何利用简单的水包油乳化法来制备可生物降解且对磁场响应的纳米颗粒微凝胶杂化材料，从而实现可控药物释放。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三小时内完成。本方案还可进一步改进，用于制备对其他刺激（如近红外光）响应的微凝胶杂化材料。通过将响应近红外的金纳米颗粒简单地掺入明胶基质中。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

交变磁场敏感的混合明胶微凝胶药物控释

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合成具有各向异性热响应性及亲油/亲水负载能力的聚(N-异丙基丙烯酰胺) Janus 微凝胶

我们介绍一种用于细胞和药物递送装置的RGD功能化水凝胶的合成方案。该方法涉及炔基修饰的聚丙烯酸（PAA）与RGD-叠氮衍生物之间通过铜催化炔-叠氮环加成反应（CuAAC）进行反应。水凝胶通过微波辅助缩聚反应形成，并对其理化性质进行研究。...

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通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

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