启动永生化多能耳源性祖细胞的分化

本实验的总体目标是将永生化的多能耳源性祖细胞分化为内耳细胞类型。因此，该方法可帮助我们解决听觉再生领域的一些关键问题，例如耳源性祖细胞如何转变为耳蜗毛细胞或听觉神经元。重要的是，该技术提供了一种体外细胞系统，可与体内哺乳动物动物模型系统平行使用。

今天由我实验室的博士后研究员 Azadeh Jadali，以及实验室的两名研究生 Zhichao Song 和 Alejandra Laureano 演示该实验步骤。按照文本方案中所述配制培养基后，取三毫升该液体，将一乘以十的六次方个永生化多能祖细胞（IMOP 细胞）接种至一个 60 毫米的组织培养皿中。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 5 至 7 天。

每隔一天，通过添加新鲜培养基使培养液的体积增加一倍。传代细胞时，首先将细胞从培养皿转移至15毫升锥形管中，然后将锥形管置于37摄氏度环境中5到10分钟。

在此期间，预计耳球样克隆将通过重力沉降聚集在锥形管底部。接下来，吸除上清液，注意不要扰动沉淀。通过加入0.5毫升预先配制并预热的、含1毫摩尔EDTA的平衡盐溶液（HBSS），轻轻吹打2至3次，重新悬浮耳球样克隆。

为了促进耳球体解离为单个细胞，将锥形管置于37摄氏度的培养箱中。定期轻轻摇动溶液，当观察到管底无沉淀的耳球体时，将其转移至室温。随后向细胞中加入2毫升培养基以中和EDTA。

在室温下以200 ×g离心5分钟。然后吸除稀释的EDTA溶液，并用5 mL的1×PBS洗涤细胞。使用相同条件离心细胞后，吸除1×PBS。

接下来，向锥形管中加入 0.5 毫升培养基，并重悬细胞沉淀。进行细胞计数时，将 IMOP 细胞用培养基按 1:100 比例稀释。

然后取75 µL该溶液加入微流控颗粒计数器中的小盒内，测定细胞数量。随后，按先前所述方法，将1×10⁶个IMOP细胞接种于60 mm组织培养皿中，并每5至7天重复一次传代操作。接种后3天，利用重力沉降法收集耳球体，操作方法同前。

继续吸除上清液，然后在2 mL感觉上皮分化培养基中轻轻重悬细胞。接着使用10 mL大孔移液管将耳球转移至新的60 mm培养皿中。

将耳球培养物分化十天，每隔一天向培养物中添加两毫升新鲜分化培养基。随后，再次通过重力沉降法收集耳球培养物。

吸除用过的培养基。接着，在室温下用含4%多聚甲醛的1×PBS固定耳球15分钟。然后去除甲醛溶液，并用含0.1% Triton X-100的1×PBS洗涤细胞。

用含10%山羊血清和0.1% Triton X-100的1×PBS对耳球进行封闭。封闭1小时后，弃去封闭液，加入含有适当稀释比例的Cdkn1b或CDH1抗体的封闭液。随后将细胞在4°C条件下与一抗孵育过夜。

第二天，按照其他部分所述方法，使用荧光标记的二抗、鬼笔环肽（Phalloidin）和 Hoechst 继续进行免疫染色。为成像做准备时，先在玻璃载玻片上滴加封片剂，然后将染色后的耳球体放入封片介质中。

接下来，将盖玻片覆盖在样品上。在4°C条件下让封片剂过夜干燥后，将玻片置于配备16位CCD相机的倒置显微镜载物台上。使用20倍0.75数值孔径的平场物镜，通过采集蓝色、绿色、红色和红外通道的信号，获取落射荧光图像。

首先，将圆形玻璃盖玻片放入无菌的100毫米培养皿中，并用70%乙醇浸没，以进行清洁。轻轻振荡盖玻片，确保其充分接触乙醇，并在室温下放置10分钟。随后，用无菌1×PBS冲洗盖玻片3次，再用无菌水冲洗1次。

然后将盖玻片置于生物安全柜中，暴露于紫外光下15分钟使其干燥。如需立即使用，将一片无菌盖玻片放入24孔板的每个孔中，并轻轻振荡培养板，确保所有盖玻片平铺于孔底。

然后通过向每个孔中加入含有每毫升10微克聚D-赖氨酸的0.25毫升1×PBS溶液来包被盖玻片。将培养板在37摄氏度孵育1小时后，移除聚D-赖氨酸溶液，并用无菌1×PBS洗涤各孔3次。最后一次洗涤液吸除后，向24个孔中的每个孔加入含有每毫升10微克层粘连蛋白的0.25毫升1×PBS溶液。

在37摄氏度下孵育平板过夜后，吸除Laminin溶液，然后用1毫升1×PBS洗涤每个孔三次，但最后一次洗涤后将PBS保留在孔中，直至细胞准备接种。开始神经元分化时，按照先前所述方法计数解离的耳球细胞，并将其重悬于预热的神经元分化培养基中。

将每孔含有包被盖玻片的培养板接种一至一点五乘以十的五次方个IMOP细胞。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育培养板，每隔一天更换一次神经元分化培养基。

七天后，吸去培养基，向每孔中加入4%多聚甲醛，固定已贴附在盖玻片上的细胞，室温孵育15分钟。然后去除多聚甲醛，用含0.1% Triton X-100的1×PBS洗涤细胞一次。

接下来，移除洗涤缓冲液，并向每孔中加入封闭缓冲液，封闭缓冲液由含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的1×PBS组成。将细胞在室温下孵育1小时。

然后吸去液体，并加入含有适当稀释比例的 Cdkn1b 或 Tubb3 抗体的封闭缓冲液。在 4°C 下孵育过夜后，用含 1% Triton X-100 的 1× PBS 洗涤细胞一次。随后按照先前所述方法进行免疫染色。

染色完成后，通过向孔中加入1× PBS进行最后一次洗涤。为准备分析，将附着有染色细胞的盖玻片从24孔板中取出，并将其放置在载玻片的封片剂上。

在4°C条件下让封片剂过夜干燥后，按照先前所述方法采集落射荧光图像。在耳上皮分化培养基中培养10天的耳球体相较于未分化细胞，显示出Cdkn1b表达增加，Cdkn1b是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂，也是内耳分化的标志物。图中Hoechst染色标记了细胞核。

这些细胞还表现出肌动蛋白丝的形态学变化以及细胞间黏附区域的变化，这些特征与上皮细胞相似。这一现象可通过Phalloidin染色以及Cdh1在细胞周边的标记显现。耳球还可被诱导分化为神经元。

这幅明场图像显示，在神经元分化培养基中培养七天后，IMOP 细胞出现神经突。使用神经元标记物 Tubb3 对这些细胞进行免疫染色，证实了其分化特征。此外，这些细胞还强烈表达 Cdkn1b。

这表明 Tubb3 和 Cdkn1b 的双重信号可作为 IMOP 细胞神经元分化的指标。通过计算 Cdkn1b 荧光信号与 Hoechst 信号的比值，对已分化和未分化细胞的 Cdkn1b 荧光进行归一化处理，从而获得定量结果。此处展示了该数据的直方图。

这些图表展示了归一化 Cdkn1b 水平超过预设阈值的未分化和已分化 IMOP 细胞所占的百分比。两种已分化的细胞群体中表达 Cdkn1b 的细胞百分比均较未分化的对照组显著增加，证实了免疫荧光所提示的分化结果。一旦掌握操作要点，若操作得当，IMOP 细胞的常规培养与分化可在 30 分钟内完成。

观看本视频后，您应该能够充分了解如何启动 IMOP 细胞的分化。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。