Name: 管理和检测蛋白标记的节肢动物的扩散研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习蛋白质标记节肢动物的方法，用于研究昆虫扩散与迁移行为。本演示介绍间接ELISA和夹心ELISA检测技术，可在自然生境中直接标记动物，操作简单且成本低廉，适合高通量生态学研究。

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本研究由美国农业部CRIS项目5347-22620-021-00D资助，部分由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划竞争性拨款2011-67009-30141资助。我们感谢Johanna Nassif提供的技术支持。同时感谢Paul Baker、David Horton、Diego Nieto和Frances Sivakoff提供用于图3的部分图片。

1. 内部标记、保留与检测流程
<ol>
	<li>内部标记步骤
	<ol>
		<li>从人工饲料饲养的实验室种群或野外采集目标昆虫（n ≈ 100 只），并将其分为两份，分别放入两个洁净的饲养容器中。</li>
		<li>将一份常规的 20 ml 饲料包（未标记的阴性对照处理）放入其中一个容器中；在另一份 20 ml 人工饲料包中加入 1.0 ml 浓度为 1.0 mg/ml 的鸡 IgG/IgY 溶液，充分混匀后放入另一个容器中。 
		注意：若目标昆虫无适用的人工饲料，可将标记物添加至其常规食物中（例如，绿豆、蛾卵、水、糖、蜂蜜）。</li>
		<li>让昆虫继续取食 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内部标记保留步骤
	<ol>
		<li>从每个容器中取出饲料包，并为昆虫提供另一种食物来源以维持实验期间的生存（例如，绿豆）。</li>
		<li>每天（或按所需时间间隔）从每种处理组中采集一批昆虫（n = 20），立即于 -20 °C 冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>夹心 ELISA 步骤
	<ol>
		<li>将兔抗鸡 IgY 一抗用 Tris 缓冲盐水（TBS）按 1:500 稀释后，每孔加入 50 µl 至洁净的 ELISA 微孔板中，室温孵育至少 1 小时（注意：微孔板也可在 4 °C 过夜孵育）。</li>
		<li>弃去孔内抗体溶液，每孔加入 300 µl 1.0% 脱脂奶粉溶液封闭 30 分钟。</li>
		<li>在等待前一步孵育的同时，将冷冻昆虫分别放入 1.6 ml 微离心管中，每管加入 1.0 ml TBS。</li>
		<li>用洁净研杵逐个研磨昆虫至完全匀浆，然后将每份样品取 100 µl 加入 ELISA 板的独立孔中，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>在每块 ELISA 板的第一列孔中加入 100 µl 阴性对照（仅 TBS）和阳性对照（含于 TBS 中的蛋清）；同时，在每块板的最后一列 8 个孔中加入 100 µl 未标记昆虫的阴性对照样品（图 1）。对照样品室温孵育 1 小时。注意：图 1 提供的模板是我们标准化检测所使用的模板，样品在孔中的排布可根据研究人员的判断进行调整。</li>
		<li>用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-tween）洗板三次，然后每孔加入 50 µl 用 1% 奶粉溶液按 1:10,000 稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡 IgG/IgY 二抗，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>用 PBS-tween 洗板三次，每孔加入 50 µl 四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。</li>
		<li>10 分钟后，使用酶标仪在 650 nm 波长下读取各孔吸光值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="ELISA 检测的微孔板布局；样本、对照；数据分析、免疫测定结果评估。" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 显示典型 96 孔 ELISA 微孔板所用标准化孔位设计的示意图。 每块板包含 7 个用于 Tris 缓冲盐水阴性对照（TBS）的孔、1 个用于阳性蛋白对照（Pos Ctrl）的孔、80 个用于重新捕获昆虫（样本 1…80）的独立孔，以及 8 个用于无标记（阴性）昆虫对照（Neg Ctrl 1…8）的孔。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 外部标记、保留与检测步骤
<ol>
	<li>外部标记操作步骤
	<ol>
		<li>从实验室种群或野外采集目标昆虫（n ≈ 100 只），分别放入两个 1.0 L 的塑料容器中，每个容器侧壁打一个直径为 2.5 cm 的孔。</li>
		<li>使用医用雾化器，向第一个容器中的昆虫喷洒 1.0 ml 的 dH2O（阴性对照处理）；向第二个容器中的昆虫喷洒 1.0 ml 含 5.0% 鸡蛋清的溶液。</li>
		<li>将雾化器的软管连接至标准实验室气源，然后将雾化器喷嘴插入容器的 2.5 cm 孔中。缓慢打开气源，直至雾化器产生雾状气溶胶。</li>
		<li>持续喷洒（标记）直至鸡蛋清溶液完全喷出（约 2–5 分钟）。</li>
		<li>移除雾化器，并用软木塞封住塑料容器上的孔。将昆虫置于室温下静置，直至溶液完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外部标记保留操作步骤
	<ol>
		<li>将经不同处理的干燥昆虫分别转移至各自洁净的饲养容器中，以避免进一步接触标记物。</li>
		<li>向洁净容器中添加食物和水，以维持昆虫在整个实验期间的生存。</li>
		<li>每天从每组处理中随机取样一批昆虫（n = 20），立即于 -20 °C 冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>间接 ELISA 操作步骤
	<ol>
		<li>将冷冻昆虫逐个放入 1.6 ml 微离心管中，每管加入 1.0 ml TBS。</li>
		<li>将样品置于转速为 120 rpm 的摇床中浸泡 1 小时。</li>
		<li>设置阴性与阳性对照，具体方法见步骤 1.3.5。</li>
		<li>浸泡完成后，用移液器吸取每份样品 100 µl，加入新 96 孔 ELISA 板上指定的 80 个样品孔中（如图 1所示）。在室温下孵育 1 小时（注：微孔板也可在 4 °C 过夜孵育）。</li>
		<li>用 PBS-吐温溶液洗涤各孔三次，然后每孔加入 300 µl 含 1% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS-BSA）。</li>
		<li>室温孵育 30 分钟后，用 PBS-吐温溶液洗涤两次。</li>
		<li>每孔加入 50 µl 兔抗卵白蛋白一抗，用 PBS-BSA-Silwet（0.05%）按 1:8,000 比例稀释，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>每孔洗涤三次后，加入 50 µl 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗，用 PBS-BSA-Silwet（0.05%）按 1:2,000 比例稀释，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>每孔再洗涤三次，然后每孔加入 50 µl TMB 底物溶液。</li>
		<li>10 分钟后，使用酶标仪在 650 nm 波长下读取各孔吸光值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>计算每块ELISA板上8个阴性对照昆虫的平均吸光度值，然后根据同一研究中所有ELISA板的合并阴性对照数据计算标准差12。</li>
	<li>将合并后的标准差乘以6，再加到每块ELISA板所得的平均值上，以此确定ELISA阳性阈值。任何吸光度值等于或高于该阈值的昆虫样本均被判定为含有该蛋白标记物。</li>
</ol>

本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

节肢动物蛋白质免疫标记技术首次描述于近二十五年前9自那时起，该方法已被改进，用于研究多种节肢动物的扩散模式，通过体内和体外施用IgG/IgY进行标记。这些蛋白质已被证实可作为迄今测试的多种昆虫物种的稳定标记物。然而，如上所述，使用IgG/IgY的主要局限在于其成本极为昂贵。因此，IgG/IgY仅适用于大量昆虫可在小范围内集中标记的重捕标记回收（MRR）或自标记类研究，或可将标记物掺入饲料或诱饵中的实验。本文提供了一个简单示例，展示如何通过喂食添加了鸡源IgG/IgY的人工饲料，将内部标记物施用于目标昆虫。随后，采用夹心ELISA法检测昆虫体内的IgG/IgY。对于已使用含鸡蛋成分饲料的研究者而言，该体系可能尤为有利，因为该检测方法可自然识别鸡蛋中存在的IgG/IgY。此外，可使用上述医用雾化器将少量IgG/IgY蛋白通过体表方式施用于昆虫图 3A。首先使用雾化器将兔IgG用于大量标记非常微小且脆弱的寄生蜂，以进行MRR类型研究3此后，其他方法也被用于向节肢动物施加IgG/IgY标记，以开展扩散研究。例如，已有研究使用香水喷雾器将IgG/IgY标记应用于其他寄生...

追踪节肢动物害虫、天敌（寄生性天敌和捕食性天敌）以及传粉昆虫在自然环境中的移动，对于深入理解如何提升生态系统服务功能至关重要。大多数扩散研究的关键在于具备一种可靠的标记目标节肢动物的方法。已有多种材料（例如：油漆、染料、彩色粉尘、标签、稀有元素、蛋白质）被用于标记节肢动物，以评估其种群动态、扩散能力、取食行为及其他生态相互作用1,2。
用于特定扩散研究的标记物是否合适，取决于所进行研究的类型。节肢动物标记方法大致可分为三类：（1）标记-释放-再捕法（MRR），（2）标记-捕获法，（3）自标记-捕获法。在标记-释放-再捕研究中，研究者通常在实验室中对节肢动物进行集中标记，然后在野外某一中心位置将其释放。随后，在不同的空间和时间间隔内，利用多种采集装置对这些节肢动物进行再捕获例如扫网、真空吸虫器、粘虫 trap3,4,5重新捕获的标本随后将被检查特定标记，以区分放归个体与本地个体。在标记-重捕研究中，研究者通常在野外使用喷雾设备直接对标本进行标记。例如，背负式喷雾器，喷杆和喷嘴喷雾器）。用于标记-重捕研究的最佳标记物应价格低廉且易于施用于节肢动物栖息环境。在自标记-重捕研究中，研究者通常将标记物施加于节肢动物诱饵上6,7 或巢穴入口8节肢动物通过摄食标记过的诱饵在体内留下标记，或通过体外附着来标记自身 &#34;刷洗&#34; 当它离开巢穴时紧贴标记处。
如上所述，已有多种类型的标记物被用于标记多种节肢动物物种。然而，极少有标记物适用于上述三种扩散研究类别的全部。蛋白质免疫标记技术的开发是昆虫标记领域的一项重大突破。免疫标记通过在节肢动物体内或体表施加一种蛋白质标签，随后利用针对该蛋白质的特异性酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行检测。最早使用的此类蛋白质标记物为兔免疫球蛋白（IgG）和鸡免疫球蛋白（IgG/IgY）9,10。这些标记物已被证明在释放-再捕获（MRR）和自标记-捕获研究中非常有效（见讨论部分）。遗憾的是，IgG/IgY 蛋白质成本较高，因此在标记-捕获研究以及大多数类型的自标记-捕获研究中并不实用。随后，研究人员开发了第二代蛋白质检测 ELISA 方法，用于检测鸡蛋清中的蛋白质（卵白蛋白）、牛奶中的蛋白质（酪蛋白）以及豆奶中的蛋白质（胰蛋白酶抑制剂蛋白）。这些检测方法均具有高度敏感性和特异性，更重要的是，所用蛋白质的成本远低于 IgG/IgY 蛋白质11。这些蛋白质已被证实适用于释放-再捕获、标记-捕获以及自标记-捕获研究（见讨论部分）。
本文中，我们描述并演示如何开展蛋白质标记的实验室滞留研究。此类研究是开展任何类型野外扩散研究之前所需的第一阶段研究工作。具体而言，在开展野外扩散研究之前，研究人员必须明确标记物在目标节肢动物物种上能够保留的时间长度。本文中，我们描述并演示如何对昆虫进行体内和体外标记，以用于标记-重捕（MRR）、标记-捕获以及自标记-捕获等类型的野外研究。随后，我们演示如何通过间接ELISA和夹心ELISA方法检测标记的存在。

<table><tbody><tr><td>昆虫饲养用食品储存容器</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>不同尺寸</td><td>不同制造商 &amp;和供应商。网眼织物被粘贴在窗口处</td></tr><tr><td>小容量雾化器（Micro Mist）</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>可在网上和医疗用品商店购买。其他品牌也可使用。</td></tr><tr><td>1.6 ml 带盖微型离心管</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>任何类似类型均可使用。我们更倾向于选择盖子易于开启的品牌。</td></tr><tr><td>用于微量离心管的泡沫塑料储存盒（5×20网格）</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>这种设计的优点在于不会使试管过于拥挤。</td></tr><tr><td>分配器，重复加样器</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>类似的操作将有助于加快分液速度。</td></tr><tr><td>研钵，塑料一次性组织研磨器，1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>可从不同供应商处获取。研杵可清洗并经高压灭菌后重复使用。</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA 板，96 孔（平底）</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 移液器，手动式（20-200） &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 或 1070-0200</td><td>任何类似类型均可使用。该型号符合人体工学设计。</td></tr><tr><td>储液器，无菌试剂</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>类似的东西均可使用。</td></tr><tr><td>电子移液器，8通道（50-1,200 &amp;micro;（Biohit eLine）</td><td>赛多利斯</td><td>730391</td><td>如果你必须选择一种电子模型，这种尺寸最为实用。</td></tr><tr><td>电子移液器，8通道（10-300 &amp;micro;l)（Biohit eLine）</td><td>赛多利斯</td><td>730361</td><td>类似的东西均可使用。</td></tr><tr><td>多通道多孔板洗板机（8通道，直头）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>类似的手动洗板操作均可采用此方法。</td></tr><tr><td>具有吸光度检测功能的微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>类似的方法均可适用。</td></tr><tr><td>鸡 IgG/IgY</td><td>美国生物公司</td><td>I1903-15R</td><td>也可从其他来源获取</td></tr><tr><td>蛋清</td><td>杂货店</td><td>&amp;ldquo;所有白人&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;等等。&lt;/em&gt;</td><td>将5 ml与95 ml dH混合&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;5% 溶液的 O</td></tr><tr><td>Tris（Trizma Base）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L 以配制 TBS</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 克/升以配制 TBS 和 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;PBS 的 L</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L PBS</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L PBS</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L PBS</td></tr><tr><td>Tween 20，EIA 级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>每升 PBS 在盐溶解后加入 0.5 ml。</td></tr><tr><td>含1% BSA的PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>将1包溶于1 L dH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>兔抗鸡IgY（IgG）（全分子）抗体（1:500）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>混合 100 &amp;micro;50 ml TBS 中</td></tr><tr><td>脱脂牛奶、奶粉或鲜牛奶（1%）</td><td>杂货店</td><td></td><td>将10 g与1 L dH₂O混合&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;1% 溶液的 O</td></tr><tr><td>抗鸡IgY（IgG）（全分子）-辣根过氧化物酶抗体，兔源（1:10,000）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>混合 100 &amp;micro;1 升 1% 脱脂牛奶中的升</td></tr><tr><td>兔抗鸡卵白蛋白抗体（1:8,000）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>稀释 125 &amp;micro;l 在 1 L PBS-BSA 中</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:2,000）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>将0.5 ml稀释于1 L PBS-BSA中，然后加入1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff（Silwet L-77）硅氧烷-聚醚共聚物</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>最后加入该成分</td></tr><tr><td>TMB 微孔板单组分过氧化物酶底物</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

用于节肢动物扩散研究的蛋白质标记施加与检测

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

监测节肢动物的移动对于更好地理解其相关的种群动态、扩散模式、寄主植物偏好以及其他生态相互作用通常十分必要。在自然环境中，通常通过为节肢动物标记独特的标识，然后在不同时间和空间重新采集个体，以确定其扩散能力。除了使用彩色粉尘或染料等物理标记外，多种蛋白质已被证明在生态学研究中对节肢动物标记非常有效。蛋白质可通过体内和/或体外方式施加。随后可通过针对特定蛋白质的酶联免疫吸附测定法（ELISA）在重新捕获的节肢动物上检测这些蛋白质标记。本文描述了对节肢动物进行体外和体内蛋白质标记的操作方案。文中展示了两个简单的实验示例：（1）通过提供富含蛋白质的食物，将蛋白质标记引入昆虫体内；（2）使用医用雾化器将蛋白质标记直接喷洒于昆虫体表。随后，我们详细介绍了用于检测昆虫体表蛋白质标记的夹心法ELISA和间接法ELISA的逐步操作流程。本演示中讨论了在标记-释放-重捕、标记-捕获以及自标记-捕获等类型研究中，节肢动物蛋白质标记的获取与检测的各个方面，同时介绍了免疫标记技术如何被广泛调整以适应多种不同的研究目标。

内部标记：
内部标记保留试验的结果如图2A所示。计算得到的ELISA临界阈值为0.054。总体而言（合并四个取样日期的数据），未饲喂蛋白质的昆虫ELISA值 consistently 较低（x̄ = 0.038 ± 0.002，n = 80）。相反，所有饲喂富含蛋白质饲料的昆虫均表现出 consistently 较高的ELISA值（x̄ = 0.475 ± 0.221，n = 80）。
外部标记：
外部标记保留试验的结果如图2B所示。计算得到的...

蛋白质常被用于标记节肢动物以开展扩散研究。本文展示了对节肢动物施加内源性和外源性蛋白质标记的方法，同时也介绍了通过间接或夹心式酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测蛋白质标记的技术。

监测节肢动物的移动通常对于更好地理解其相关的种群动态、扩散模式、寄主植物偏好以及其他生态学特征至关重要。

本演示的总体目标是介绍如何利用蛋白质标记昆虫，以开展昆虫扩散或迁徙研究。本演示还包括通过夹心法或间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测标记物的方法。该方法有助于回答昆虫扩散研究领域中的一些关键科学问题。该技术可用于研究昆虫的迁徙模式、昆虫对寄主植物的偏好以及入侵物种的扩散情况。该方法的优点在于检测手段简单且成本低廉，适用于高通量研究，且动物可在其自然栖息地中被便捷地直接标记。通常，初次接触该方法的人会感到困难，因为这种方法看似比实际更复杂，而大多数野外研究人员并未具备使用这一简单技术的经验。我于1989年首次提出该方法的想法。当时我们正在利用人工饲料饲养大眼蝽捕食性天敌。我们担心这些捕食性昆虫在人工饲养条件下长期以非自然食物饲养后，对牧草盲蝽（Lygus bug）害虫的捕食能力会下降。换句话说，它们可能已经“驯化”。因此，我们需要一种安全、有效且低成本的方法，在将其释放到田间后，能够将其与本地种群区分开来。目前所有的标记方法均不符合这些标准。我此前曾使用ELISA方法检测捕食性天敌肠道内是否含有盲蝽特异性蛋白残留，这一经历启发我考虑将外源蛋白标记应用于实验室饲养的捕食性天敌。随后，我们可对野外采集的草蛉进行分析，检测其是否含有盲蝽残留物以及外源蛋白残留物。首先，从实验室种群或野外采集约100只目标昆虫，并将其分装至两个洁净的饲养容器中。其中一个容器加入常规的20毫升饲料包，作为阴性对照；另一个容器则在饲料包中添加1毫克鸡IgG-IgY。加入一毫升溶液并充分混匀。如有需要，可用昆虫平时食用的食物替代试剂包中的内容物。将昆虫在这些饲料包上饲养24小时后，为两组昆虫均提供正常的未标记食物。在预定的时间间隔，从每个队列中收集 20 只个体昆虫。将它们在 -20 摄氏度下冷冻，直至实验所需的所有队列样本均收集完毕。为准备用于 ELISA 的 96 孔板，向每个孔中加入 50 µL 用 Tris 缓冲盐水（TBS）按 1:500 稀释的兔抗鸡 IgY 一抗。将加样后的酶标板在室温下孵育至少一小时，或在4°C下过夜。随后，弃去各孔中的液体，每孔加入300 µL封闭液。该封闭液为1%脱脂奶粉溶液。将平板在室温下孵育30分钟。在封闭孵育期间，将单个冷冻昆虫转移至含有1毫升TBS的微量离心管中。然后，使用洁净的研杵将每只昆虫充分匀浆。当培养板准备就绪后，向每个孔中加入 100 µL 均质化的昆虫样品。每块 96 孔板可容纳 80 个样本。首列和末列孔留空，用于设置对照。在第一列中，加入七份单独的100微升TBS样品，另在其中一个孔中加入含蛋清阳性对照的100微升TBS。在最后一列中，加入八份未标记昆虫样品的各100微升。将样品在室温下孵育至少一小时。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液吐温（PBS-Tween）小心洗涤各孔三次。根据我们的经验，大多数操作误差都发生在洗涤步骤中。溅出可能导致假阳性反应大量出现，因此需格外小心。洗涤后，每孔加入50微升兔抗鸡IgG-IgY-辣根过氧化物酶偶联物，用1%脱脂奶粉溶液按1:10,000比例稀释。室温下孵育至少1小时。随后，用PBS-Tween溶液洗涤酶标板三次，操作同前。然后，每孔加入 50 µL TMB 底物。您可能会立即观察到颜色变化。将酶标板避光孵育 10 分钟，随后使用酶标仪读取吸光度。在650纳米波长下读取酶标板并记录数值。为对外部标记昆虫进行处理，准备带有通气孔的1升塑料瓶，并将100只昆虫均分为两组放入两个瓶中。然后，向其中一个容器中的昆虫喷洒1毫升蒸馏水，作为阴性对照。接下来，将医用雾化器连接至气源出口，并调节气流使雾化器产生蒸汽。用1毫升5%的鸡蛋白溶液喷洒其他昆虫。喷洒过程应持续2至5分钟以完成。然后，用瓶塞封住孔洞，并在室温下让溶液完全干燥。干燥后，将昆虫转移回其正常的饲养容器中，提供标准食物，并按常规条件继续饲养。随后，在预定的时间间隔采集昆虫进行检测。为检测外部标记保留情况，采用与检测内部标记保留的ELISA实验相同的操作流程，仅作少量修改。将昆虫转移至含有TBS的微量离心管后，不进行匀浆处理，而是将其置于120 RPM的摇床中浸泡1小时。浸泡完成后，用移液器吸取100微升溶液加入到酶标板孔中，并使酶标板孵育至少1小时。清洗昆虫样品后，向每个孔中加入含1% BSA的300微升PBS。室温孵育30分钟后，用PBS-Tween洗涤孔两次。然后，向每个孔中加入50微升兔抗卵白蛋白一抗，用PBS-BSA按1:8000比例稀释。将酶标板孵育至少1小时，然后按之前方法洗涤各孔。随后，向每孔中加入50 µL用PBS-BSA稀释液按1:2000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。室温下孵育至少1小时，然后按照先前所述步骤继续进行实验。在四个时间点检测了内标标记的保留情况。总体而言，未饲喂蛋白质的昆虫组ELISA值 consistently 较低；而所有饲喂蛋白质强化饲料的昆虫组均表现出稳定且较强的ELISA值。外部标记也在四个时间点进行了检测。用蛋清进行表面标记的昆虫始终产生较强的信号值。可预见的是，喷水的阴性对照组ELISA值非常低。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对昆虫进行标记，并检测其是否带有标记。若操作得当，熟练掌握该技术后可在4小时30分钟内完成。在一天之内，可处理16块检测平板，样本量远超1000个个体。在进行该实验操作时，必须牢记该检测方法极为敏感。因此，所有表面、容器和设备都必须避免蛋白质污染。该技术建立后，为研究人员探索昆虫在农业、城市、森林及其他自然生境中的局部和大范围扩散模式奠定了基础。我们在此展示的是小规模示例，但该技术已通过商用喷雾设备在更大范围内应用于昆虫的自然栖息地直接标记。我们对合作者所提出的创造性应用感到十分惊叹。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

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我们介绍一种高效收集小型节肢动物可量化血淋巴的方法，用于后续分析。...

一种用于采集小型节肢动物血淋巴的精确且可量化的技术

描述了研究刺探和摄食行为的步骤 Culex...

交流-直流电穿透图技术用于研究刺探与取食行为 Culex tarsalis 人手上的蚊子

本文介绍了一种高效且节省试剂的成虫盘解剖与抗体染色方案，便于对少量成虫盘进行操作和处理。...

果蝇（Drosophila melanogaster）眼部-触角及翅成虫盘的小规模解剖与抗体染色

学习蛋白质标记节肢动物的方法，用于研究昆虫扩散与迁移行为。本演示介绍间接ELISA和夹心ELISA检测技术，可在自然生境中直接标记动物，操作简单且成本低廉，适合高通量生态学研究。

用于节肢动物扩散研究的蛋白质标记施加与检测

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