小鼠海马星形胶质细胞的性别差异 体外 缺血

该技术的总体目标是从新生小鼠中制备富集的性别特异性海马星形胶质细胞培养物，用于研究在氧糖剥夺及再复氧条件下星形胶质细胞的性别特异性作用，从而在细胞培养环境中模拟体内缺氧缺血情况。该方法有助于解答与发育中的雄性和雌性大脑在缺氧缺血后海马星形胶质细胞的性别特异性作用相关的关键机制性和转化性问题。使用小剪刀从新生小鼠头部进行解剖，沿皮肤做一条从后至前的正中切口，暴露颅骨。

从颈部到鼻部沿中线小心切开颅骨。使用无菌平头镊子剥离颅骨。借助弯头镊子去除脑干，并将剩余的脑组织放入解剖皿中。

用弯头镊子将脑组织翻转，使腹面朝上，然后用锋利且无菌的手术刀分离两侧半球。用扁平的弯头镊子向后剥离大脑半球，小心去除隆起的中脑和丘脑组织，以暴露海马体——位于内侧颞叶的一个微小的海马状结构。取出两侧海马叶，并用精细镊子轻轻牵拉，仔细清除海马叶表面的脑膜和成纤维细胞。

将单只小鼠的两个海马叶转移至另一个含有约5毫升HBSS的培养皿中，并置于冰上。使用锋利的无菌手术刀片将海马叶切碎约4次。用1毫升无菌移液器将HBSS和组织转移至一个50毫升无菌锥形管中，然后以300 × g离心5分钟。

离心后，吸除上清液。加入3毫升0.25%的胰蛋白酶，混匀，并在37°C下轻轻振荡孵育组织20分钟。孵育结束后，将试管在300 × g下离心5分钟。

离心后，使用无菌玻璃移液管小心吸除上清液，然后加入10毫升预热的星形胶质细胞接种培养基。用火焰抛光的玻璃移液管吹打20至30次。再次在300 × g条件下离心5分钟，吸除上清液后加入2毫升星形胶质细胞接种培养基。

将细胞悬液通过70微米孔径的滤网过滤至新的50毫升锥形管中。将全部细胞悬液加入已包被的无菌T-25培养瓶中，培养瓶内含3毫升星形胶质细胞接种培养基。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育。

第二天，在光学显微镜下观察星形胶质细胞融合程度的进展，吸除培养基，并加入2毫升新鲜的星形胶质细胞接种培养基。体外培养约11天时，吸除培养基，收获融合的星形胶质细胞，然后加入2毫升0.25%胰蛋白酶。轻轻旋转培养瓶数次，再用无菌玻璃移液管吸除胰蛋白酶。

再加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶，将培养瓶置于室温下静置 4–5 分钟。去除胰蛋白酶后，将培养瓶放入 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。孵育结束后，加入 5 毫升星形胶质细胞铺板培养基，通过轻敲培养瓶 3 至 4 次使星形胶质细胞层脱落。

轻轻吹打烧瓶底部的细胞悬液，以实现细胞完全脱落，随后将星形胶质细胞收集至15毫升锥形管中。以300 × g离心5分钟。吸除上清液，然后加入1毫升新鲜的星形胶质细胞接种培养基。

取10微升细胞悬液加入血细胞计数板，使用配备10倍物镜的倒置相差显微镜对中央大网格区域内的细胞进行计数。将细胞用星形胶质细胞接种培养基稀释至每2毫升约含1×10⁵个细胞。用移液器将2毫升细胞悬液滴加到24孔培养板孔内经多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。

在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育。开始氧糖剥夺时，吸除含有贴壁星形胶质细胞的盖玻片上的培养基，用1毫升等渗OGD溶液冲洗一次。向孔中加入0.2毫升OGD溶液，并将孔板置于缺氧培养箱中。

在缺氧的前30分钟内，使用设定为50 rpm的旋转摇床轻轻混匀。对于复氧，将OGD溶液替换为2毫升星形胶质细胞接种培养基，并在5%二氧化碳和大气空气条件下于37摄氏度孵育5小时。该免疫荧光图像显示了原代小鼠海马星形胶质细胞培养的纯度。

星形胶质细胞培养物经过免疫染色，以红色显示神经元树突标志物 MAP2，绿色显示小胶质细胞标志物 IBA1。细胞核经 DAPI 染色呈蓝色。箭头指示小胶质细胞污染。

这是一张在常氧条件下培养的海马星形胶质细胞的代表性免疫荧光图像，显示GFAP免疫反应性为红色，HIF1-α标记为绿色。细胞核用DAPI染色，呈蓝色。箭头指示HIF1-α表达水平较低。

经过2小时的缺氧缺糖处理及5小时的复氧后，培养的海马星形胶质细胞中HIF1-alpha表达增加，箭头所示为HIF1-alpha核表达升高。在雄性小鼠的海马星形胶质细胞培养物中，氧糖剥夺与复氧后GFAP表达和S100b表达均上调。在雌性小鼠来源的星形胶质细胞中也观察到S100b和GFAP的上调。

采用该方案后，还可进行定量PCR、蛋白质印迹、siRNA以及免疫组织化学染色等其他方法，以回答更多科学问题，例如体外缺血后特定基因和蛋白质表达的性别特异性变化。该技术建立后，可为神经科学领域的研究人员探索中风对海马区星形胶质细胞的影响及其后果提供重要途径。