Name: 大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习使用免疫荧光染色和高分辨率显微镜技术对大鼠皮层神经元中的F-肌动蛋白泪点进行定量分析。该方法可评估突触完整性和可塑性变化，适用于研究神经毒性损伤及神经保护药物对突触结构的影响。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DA013137、DA031604 和 HD043680。部分支持来自 NIH T32 生物医学-行为科学培训项目资助。

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（保证编号：A3049-01）。
1. 低密度胚胎神经元培养
<ol>
	<li>原代皮层神经元培养的准备工作
	<ol>
		<li>溶液：
		<ol>
			<li>将5 mg聚-L-赖氨酸溶解于10 ml硼酸盐缓冲液中，配制聚-L-赖氨酸储存液。</li>
			<li>通过将1 ml聚-L-赖氨酸储存液加入49 ml硼酸盐缓冲液中，配制工作液。</li>
			<li>制备硼酸盐缓冲液，pH 8.4：取395 ml去离子水2加入所有成分（1.24 g 硼酸 + 1.9 g 硼砂）。用 1 M NaOH 调节 pH 至 8.4。定容至 400 ml，并在通风橱中用 0.2 µm 尼龙膜滤器过滤。</li>
			<li>准备 HBSS 溶液，起始使用 445 ml dH₂O，调节 pH 至 7.22O，并加入其余成分（50 ml 10X HBSS 储存液 + 1.2 g HEPES）。用1 N HCl调节pH至7.2，定容至500 ml，在通风橱中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。</li>
			<li>制备铺板培养基：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。在超净台中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。</li>
			<li>配制完全培养基：向50 ml Neurobasal培养基中加入以下补充成分（500 µl GlutaMax（100倍浓缩液）+ 500 µl 葡萄糖 + 1 ml B-27（50倍浓缩液）+ 500 µl 抗生素-抗真菌溶液（100倍浓缩液）+ 100 µl 7.5% 碳酸氢钠）。在超净台中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养前两天：
		<ol>
			<li>在十二个35 mm玻璃底培养皿中各加入2 ml聚-L-赖氨酸工作液，于通风橱中孵育过夜。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养前一天：
		<ol>
			<li>从培养皿中移除包被液，并用 ddH₂O 冲洗2O. 将培养皿置于通风橱内干燥一小时。</li>
			<li>制备铺板培养基（DMEM/F12 加 10% 胎牛血清（占总体积的 10%））。每皿加入 2 ml 培养基，37℃ 过夜培养 oC，5% CO2. 
			注意： 培养过程中应避免使用塑料培养皿。建议使用玻璃底培养皿（适用于倒置显微镜）或玻璃盖玻片（适用于正置显微镜），以获得清晰锐利的图像。与塑料底培养皿相比，玻璃底培养皿可避免荧光显微镜观察时产生不必要的色偏或眩光。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养方案：
	<ol>
		<li>将冷藏的HBSS缓冲液（100–150 ml）、100 mm培养皿、镊子、剪刀、50 ml离心管和15 ml离心管置于生物安全柜内的紫外灯下照射。</li>
		<li>在培养室外的通风橱内，通过吸入致死剂量的5%七氟烷处死怀孕大鼠。</li>
		<li>用70%乙醇消毒，用镊子提起下腹部皮肤，从尾侧向头侧沿腹腔中线剪开。用剪刀打开子宫以暴露胎盘。</li>
		<li>取出8-10个E18胎鼠，将8-10个胎鼠置于含有HBSS溶液的培养皿中。</li>
		<li>用镊子夹住胎鼠头部背面，然后用剪刀将头部与身体分离。将头部放入另一含有5-7 ml HBSS的培养皿中。将培养皿转移至超净台。</li>
		<li>用冷的HBSS填充另外两个100 mm的培养皿。</li>
		<li>剥离颅骨，将脑组织舀入盛有HBSS的新培养皿中。</li>
		<li>使用锋利的弯头镊子分离小脑和脑干与大脑，然后将大脑转移至含有冷HBSS的新培养皿中。</li>
		<li>用镊子固定，用弯头镊子分离半球。去除软脑膜，分离额叶皮层，并将组织块转移至已标记的15 ml离心管中。</li>
		<li>向15 ml离心管中加入2 ml新鲜HBSS，并向每个15 ml离心管中加入20 µl胰蛋白酶EDTA（10倍浓缩液，含0.5%胰蛋白酶和5.3 mM EDTA）。</li>
		<li>室温孵育10–15分钟，每隔几分钟轻轻摇动管子，避免沉淀。</li>
		<li>孵育10–15分钟后，用玻璃移液管吸除旧的HBSS，再用新的HBSS冲洗两次。</li>
		<li>加入胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml，2 mg 胰蛋白酶抑制剂溶于 2 ml HBSS 中），充分混匀，静置 5 分钟。用新鲜 HBSS 洗涤两次。</li>
		<li>使用带橡胶吸头的玻璃移液管，将脑组织块缓慢吹打10–15次，注意避免产生气泡。随后使用校准移液管和无菌小口径吸头，再次缓慢吹打至均匀。</li>
		<li>将解离后的细胞以所需密度（50个细胞/mm²）接种至预先包被的培养皿中。于37℃孵育过夜。 oC，5% CO2。</li>
		<li>24小时后，将DMEM/F12培养基更换为新鲜配制的完全生长无血清Neurobasal培养基。</li>
		<li>始终将细胞置于5% CO₂环境中培养2在实验前，将细胞置于含95%空气的加湿培养箱中培养至少12–14天。每5–6天更换一次新鲜的Neurobasal培养基，替换约50%的旧培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 荧光标记与免疫细胞化学
注意：原代皮层细胞培养物的免疫荧光标记在玻璃底35 mm细胞培养皿中进行，工作体积为1 ml。
<ol>
	<li>用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗玻璃底培养皿两次。</li>
	<li>用 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗细胞两次，然后用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 透化处理 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用 F-肌动蛋白特异性染料 AlexaFluor 488 Phalloidin（1:40，25 µl Phalloidin 溶于 1 ml PBS）处理细胞 20 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗细胞两次，然后在室温下用 10% 正常山羊血清封闭 1–2 小时。</li>
	<li>将鸡多克隆抗 MAP2 抗体（1:2,500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释，4 oC 孵育过夜。</li>
	<li>孵育结束后，用 PBS 冲洗两次。</li>
	<li>将二抗（Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG，1:500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释，在室温下孵育 2 小时。</li>
	<li>用 PBS 冲洗后，每皿加入 10 µl Hoescht 染料。</li>
	<li>室温孵育 3 分钟，再用 PBS 清洗两次。 
	注意：标记后的细胞现已准备好进行步骤 3（F-肌动蛋白斑点计数）。</li>
	<li>用 100 µl 抗荧光淬灭试剂作为封片剂保存细胞样本，并在 4 oC 避光条件下长期保存。 
	注意： Phalloidin 在避光、4 °C 的 PBS 中相对稳定，可维持荧光达 1 周，且使用抗荧光淬灭封片试剂可进一步延长荧光保存时间。然而，最佳成像效果通常在染色后 1–3 天内获得，因为长期储存可能导致 Phalloidin 开始扩散。</li>
</ol>
3. F-肌动蛋白点状结构计数
<ol>
	<li>打开荧光显微镜，切换至20×物镜。启动显微镜软件，设置程序参数为1280×960像素的图像尺寸，1×缩放倍数下的图像分辨率为0.17 µm/像素。</li>
	<li>在绿色（495 nm）/红色（613 nm）荧光通道下采集共标记F-actin/MAP2神经元的图像。</li>
	<li>选择5张绿色（F-actin）/红色（MAP2）免疫荧光标记/蓝色（Hoescht）染色的单个神经元图像，要求树突分支结构清晰可辨。</li>
	<li>在二级树突片段（长度范围为25–75 µm）中识别富含F-actin的结构，且该片段需具有连续的MAP2免疫荧光信号。</li>
	<li>将所选图像区域旋转至水平方向，复制并粘贴为新图像。</li>
	<li>对图像进行背景扣除，每个培养皿使用一致的调整参数。</li>
	<li>由经过培训的独立观察者手动计数明亮的绿色F-actin斑点，并追踪所选树突片段的长度。将数据导出至电子表格文件。</li>
	<li>通过将F-actin标记的斑点总数（N）除以MAP2标记树突的长度（L），计算其密度。结果以每10 µm树突长度上的F-actin斑点数量表示。 
	注意：纳入分析的F-actin荧光斑点（大小≤1.5 µm）需满足其峰值强度至少高于树突主干平均染色强度的50%。</li>
</ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突需要声明。

在本实验方案中，我们描述了在35 mm玻璃底培养皿中以低密度培养大鼠皮层神经元的方法，该方法可使我们识别单个神经元的树突。接着，我们使用鬼笔环肽（Phalloidin）和微管相关蛋白2（MAP2）染色来检测树突的形态变化。随后，我们利用专业软件对F-肌动蛋白（F-actin）斑点的变化进行定量分析。
为了确定F-actin斑点的变化，必须清晰显示单个神经元的整个神经网络，以便从单个神经元中选择合适的二级树突区段。低密度接种至关重要，既有助于清晰观察单个神经元，又能最大限度减少胶质细胞的存在。星形胶质细胞也含有F-actin，若无神经元特异性标记物，可能会干扰对F-actin阳性斑点的分析。低密度培养结合使用Neurobasal培养基，有助于减少细胞培养中星形胶质细胞的增殖。然而，鉴于F-actin蛋白并非神经元特有，应将Phalloidin与特异性神经元蛋白标记物（如MAP2）联合使用。此外，也可将其他蛋白抗体与Phalloidin共用，例如酪氨酸羟化酶（TH），用于鉴定培养物中特定的神经元群体。
研究突触及其形态的一种常用技...

本研究的主要目标是建立一种可靠的方法，用于测量（评估）神经元树突网络的突触完整性。本文描述了利用鬼笔环肽染色与树突的免疫细胞化学（ICC）检测相结合，对原代培养的大鼠神经元中的F-肌动蛋白（F-actin）斑点进行定量分析，并随后使用专业的NIS-Elements软件进行图像分析。
标记的鬼笔环肽对粗细肌动蛋白丝（F-actin）具有相似的亲和力，但与单体球状肌动蛋白（G-actin）不结合，这一点与某些肌动蛋白抗体不同1。鬼笔环肽的非特异性结合可忽略不计，因此在细胞成像过程中背景信号极低。鬼笔环肽的分子远小于通常用于荧光显微镜标记细胞蛋白的抗体，因而可实现对F-actin更强烈的标记。因此，利用标记的鬼笔环肽可以获得神经元中F-actin定位的详细图像。
神经元树突的鬼笔环肽（F-肌动蛋白）染色会产生离散的&#34;热点&#34;或明亮的&#34;点状结构&#34;，这些结构代表多种树突结构，包括成熟的树突棘、非棘状突触2以及未成熟的树突棘。未成熟的树突棘包括细长的丝状伪足及某些形态的斑块结构，可能代表树突棘形成的起始阶段3。未成熟的树突棘和非棘状斑块缺乏PSD954。F-肌动蛋白生成的变化不仅会导致树突棘的后续改变，还会影响其他树突结构，因此鬼笔环肽成为研究突触-树突完整性的关键工具5-7。通常，鬼笔环肽阳性（F-肌动蛋白）点状结构的数量反映了活性突触（兴奋性和抑制性突触）、肌动蛋白动态以及突触稳定性之间的平衡8。
尽管研究特定类型的突触非常重要即，兴奋性树突棘），当治疗靶点未知时，有必要首先评估多种树突结构的一般完整性。由于F-actin是树突棘及其他结构（包括抑制性突触）的主要组成成分，F-actin斑点数量的改变可能提示突触病变。随后可进一步探究该突触病变是否存在更特异性的改变。我们用于检测多种突触类型/结构的定量方法，可在不同实验处理后对树突突触的总体改变（增加或减少）提供评估。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>鸡多克隆抗 MAP2 抗体</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 活细胞染色试剂 ReadyProbes（Hoescht 33342）</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 软件包</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 倒置荧光计算机控制显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Nalgene 尼龙膜过滤器</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（f-actin）斑点的定量分析

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。树突中富含F-actin的结构变化提示突触完整性与连接性的改变。本文提供了一种培养原代大鼠皮层神经元、对F-actin斑点进行鬼笔环肽染色以及后续定量分析的详细实验方案。首先，分离E18大鼠胚胎的额叶皮层组织，制备成低密度细胞培养物，随后培养神经元 体外 至少培养12-14天。实验处理后，皮层神经元使用AlexaFluor 488 Phalloidin染色（用于标记树突F-actin斑点）以及微管相关蛋白2（MAP2；用于验证神经元细胞及树突完整性）。最后，采用专业软件对随机选取的神经元树突进行分析与定量。富含F-actin的结构被识别于具有连续MAP2免疫荧光信号的二级树突分支上（长度范围为25-75 µm）。本方案将为研究实验处理后树突突触结构的变化提供一种有效的方法。

在本方法中，我们首先将大鼠皮层神经元以低密度培养于35 mm玻璃底培养皿中，以便识别单个神经元的树突。在图1中，微分干涉差（DIC）图像显示了体外培养的大鼠胎儿皮层神经元在第4、6、10、14、21和27天的形态学变化。体外培养的大鼠原代神经元随着成熟，其树突长度和数量均增加。实验所用神经元需培养至少14天以上方可使用。
为了检测树突和突触的变化，我们将Phalloidin标记F-肌动蛋白与MAP2抗体标记树突的方法相结合。由于Phalloidin对F-肌动蛋白的标记非常迅速（20–30分钟），因此可以在进行免疫细胞化学抗体标记之前，直观评估突触-树突网络的完整性（图2）。MAP2可标记完整的树突，并与Phalloidin染色区域重叠，从而确认F-肌动蛋白斑点位于神经元树突上，而非定位于其他细胞（如星形胶质细胞）。
<p class="jove_content...

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。因此，对F-actin斑点进行定量是研究突触结构完整性的有效工具。本实验方案描述了在低密度原代皮层神经元培养物中，利用鬼笔环肽标记F-actin斑点并进行定量的实验步骤。

大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）斑点的定量分析

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。树突中富含F-actin的结构发生改变……

本研究旨在建立一种用于量化培养神经元中丝状肌动蛋白（F-actin） puncta 的方法，以评估突触结构的完整性和认知功能。该方法有助于解决神经科学领域中关于突触生成、突触可塑性及突触稳定性的关键问题。该技术的主要优势在于提供了一套详细的原代神经元培养方案，并涵盖后续的 F-actin puncta 鉴定与定量分析流程。当尚不明确研究目标时，有必要对大鼠胃底组织的基本完整性进行评估。我们最初是在研究可卡因等滥用药物以及HIV毒性蛋白（如tat和JP 120）诱导的神经元损伤时，提出了该方法的构想。在建立培养前两天，用2毫升聚-L-赖氨酸工作液对12个35毫米玻璃底培养皿进行包被，并将培养皿置于超净台中过夜，以保持其无菌状态。第二天，弃去包被剂，用双蒸水冲洗培养皿。将培养皿置于超净台中干燥一小时。然后向每个培养皿中加入两毫升铺板培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将培养皿孵育过夜。在培养当天，将收获的脑组织置于含有冷HBSS的培养皿中。然后用镊子固定脑组织，使用弯头镊分离半球并去除脑膜。分离额叶皮层，并将组织块转移至无菌的15毫升离心管中。向管中加入2毫升新鲜HBSS和20微升胰蛋白酶EDTA，在室温下孵育神经组织10至15分钟，每隔几分钟轻轻摇晃一次。孵育结束后，使用玻璃移液管吸除所有旧的HBSS，并用新鲜HBSS冲洗皮层组织两次。第二次洗涤后，将组织浸入胰蛋白酶抑制剂中。充分混匀，室温静置5分钟。随后用新鲜的HBSS洗涤组织两次。接着使用带橡胶吸头的玻璃移液管，缓慢吹打脑组织碎片10至15次。然后，使用带有无菌细口吸头的校准移液器，极其缓慢地再次吹打组织匀浆液。当溶液呈均一状态后，将细胞以适当的密度接种于预先包被的培养皿中，在细胞培养孵箱中过夜培养。24小时后，将接种培养基更换为新配制的完全生长型无血清窄基础培养基。将细胞放回细胞培养孵育箱中，至少培养 12 至 14 天。低密度接种对于观察单个神经元至关重要。神经元基础培养基在最大程度减少细胞培养中星形胶质细胞穿孔方面起着关键作用。进行免疫细胞化学染色时，首先用 PBS 将玻璃底细胞培养皿洗涤两次。然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，随后再用 PBS 洗涤两次。接下来，用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 5 分钟以进行透化，然后在室温下用特异性标记 F-肌动蛋白的染料对细胞进行染色。20 分钟后，用 PBS 洗涤细胞两次，并用 10% 正常山羊血清封闭任何非特异性细胞表面染色。孵育结束后，在 4°C 条件下用鸡多克隆抗 MAP2 抗体对细胞进行过夜标记。第二天早晨，用 PBS 清洗细胞两次，并加入适当的二抗进行标记。室温孵育两小时后，再次用 PBS 清洗细胞，然后加入 10 µL huxs，在室温下标记三分钟。随后用 PBS 最终清洗两次，并加入 100 µL 抗荧光淬灭剂保存细胞。染色后三天内，打开荧光显微镜并选择20倍物镜。接着，在显微镜软件中将像素图像尺寸设置为1600 × 1200，图像分辨率为每像素0.17微米，放大倍数设为1倍。将细胞培养皿转移至显微镜载物台上。在绿色和红色荧光通道下采集共标记的F-actin与map 2神经元的图像。当所有图像采集完成后，从绿色、红色和蓝色通道中各选择五张具有清晰树突分支结构的单个神经元图像，并利用连续map 2免疫荧光染色法鉴定二级树突节段中富含F-actin的结构。水平旋转选定的图像区域，并将该区域复制粘贴为新图像。随后扣除图像背景荧光，利用软件计数亮绿色F-actin点状结构的数量。使用经过培训的独立观察者测量所选树突节段的长度，然后将突触斑点数量和树突节段长度数据导出至电子表格文件。观察者需确保在每个选定节段中，包含树突干染色平均荧光强度至少高出50%的粉红色荧光强度的F-肌动蛋白形态突触斑点。最后，根据公式计算密度，将数据表示为每十微米树突长度上的F-actin puncta数量。此处，微分干涉相差成像展示了体外培养的胎鼠皮层神经元在培养第4至27天发育过程中所观察到的形态学变化。注意随着原代培养的大鼠神经元成熟，树突的长度和数量均有所增加。由于鬼笔环肽对F-actin的标记非常迅速，因此可以在进行免疫细胞化学抗体标记之前，先通过显微观察直观评估突触-树突网络的完整性。Map2可标记完整的树突，从而证实F-actin点状结构位于神经元树突上，而非定位于星形胶质细胞等其他细胞。在高分辨率图像中，可观察到富含F-actin的结构，包括丝状伪足、树突棘突起以及F-actin斑块。在本项评估HIV-1 tat诱导突触-树突损伤的实验中，Map2染色显示，经HIV-1 tat处理后，大鼠皮层神经元的树突分支减少，F-actin表达降低。实际上，F-actin puncta的数量会随实验处理而增加或减少。例如，在本实验中，当培养的神经元经非竞争性NMDA受体拮抗剂美金刚处理后，F-actin阳性puncta的密度显著增加。相比之下，使用甲基苯丙胺联合 HIV1 tat 处理会导致 F-肌动蛋白点状结构显著减少。在获取标记了 F-肌动蛋白和 Map2 神经元的高分辨率图像后，需由两名经过培训的观察者选取二级树突片段，用于分析点状结构的密度。该技术一经建立，便为神经科学研究领域的研究人员开辟了新的研究途径。不仅可用于急性突触病变的监测，还可用于突触恢复及实验性神经修复过程的研究。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立一种可靠的方法来评估神经树突网络的突触完整性。

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