大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）斑点的定量分析
2016年2月10日
丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。因此，对F-actin斑点进行定量是研究突触结构完整性的有效工具。本实验方案描述了在低密度原代皮层神经元培养物中，利用鬼笔环肽标记F-actin斑点并进行定量的实验步骤。
本研究旨在建立一种用于量化培养神经元中丝状肌动蛋白（F-actin） puncta 的方法，以评估突触结构的完整性和认知功能。该方法有助于解决神经科学领域中关于突触生成、突触可塑性及突触稳定性的关键问题。该技术的主要优势在于提供了一套详细的原代神经元培养方案，并涵盖后续的 F-actin puncta 鉴定与定量分析流程。
当尚不明确研究目标时，有必要对大鼠胃底组织的基本完整性进行评估。我们最初是在研究可卡因等滥用药物以及HIV毒性蛋白（如tat和JP 120）诱导的神经元损伤时，提出了该方法的构想。在建立培养前两天，用2毫升聚-L-赖氨酸工作液对12个35毫米玻璃底培养皿进行包被，并将培养皿置于超净台中过夜，以保持其无菌状态。
第二天，弃去包被剂，用双蒸水冲洗培养皿。将培养皿置于超净台中干燥一小时。然后向每个培养皿中加入两毫升铺板培养基。
在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将培养皿孵育过夜。在培养当天，将收获的脑组织置于含有冷HBSS的培养皿中。然后用镊子固定脑组织，使用弯头镊分离半球并去除脑膜。
分离额叶皮层，并将组织块转移至无菌的15毫升离心管中。向管中加入2毫升新鲜HBSS和20微升胰蛋白酶EDTA，在室温下孵育神经组织10至15分钟，每隔几分钟轻轻摇晃一次。
孵育结束后，使用玻璃移液管吸除所有旧的HBSS，并用新鲜HBSS冲洗皮层组织两次。第二次洗涤后，将组织浸入胰蛋白酶抑制剂中。
充分混匀，室温静置5分钟。随后用新鲜的HBSS洗涤组织两次。接着使用带橡胶吸头的玻璃移液管，缓慢吹打脑组织碎片10至15次。
然后，使用带有无菌细口吸头的校准移液器，极其缓慢地再次吹打组织匀浆液。当溶液呈均一状态后，将细胞以适当的密度接种于预先包被的培养皿中，在细胞培养孵箱中过夜培养。24小时后，将接种培养基更换为新配制的完全生长型无血清窄基础培养基。
将细胞放回细胞培养孵育箱中，至少培养 12 至 14 天。低密度接种对于观察单个神经元至关重要。神经元基础培养基在最大程度减少细胞培养中星形胶质细胞穿孔方面起着关键作用。
进行免疫细胞化学染色时，首先用 PBS 将玻璃底细胞培养皿洗涤两次。然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，随后再用 PBS 洗涤两次。
接下来，用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 5 分钟以进行透化，然后在室温下用特异性标记 F-肌动蛋白的染料对细胞进行染色。20 分钟后，用 PBS 洗涤细胞两次，并用 10% 正常山羊血清封闭任何非特异性细胞表面染色。孵育结束后，在 4°C 条件下用鸡多克隆抗 MAP2 抗体对细胞进行过夜标记。
第二天早晨，用 PBS 清洗细胞两次，并加入适当的二抗进行标记。室温孵育两小时后，再次用 PBS 清洗细胞，然后加入 10 µL huxs，在室温下标记三分钟。随后用 PBS 最终清洗两次，并加入 100 µL 抗荧光淬灭剂保存细胞。
染色后三天内，打开荧光显微镜并选择20倍物镜。接着，在显微镜软件中将像素图像尺寸设置为1600 × 1200，图像分辨率为每像素0.17微米，放大倍数设为1倍。将细胞培养皿转移至显微镜载物台上。
在绿色和红色荧光通道下采集共标记的F-actin与map 2神经元的图像。当所有图像采集完成后，从绿色、红色和蓝色通道中各选择五张具有清晰树突分支结构的单个神经元图像，并利用连续map 2免疫荧光染色法鉴定二级树突节段中富含F-actin的结构。
水平旋转选定的图像区域，并将该区域复制粘贴为新图像。随后扣除图像背景荧光，利用软件计数亮绿色F-actin点状结构的数量。
使用经过培训的独立观察者测量所选树突节段的长度，然后将突触斑点数量和树突节段长度数据导出至电子表格文件。观察者需确保在每个选定节段中，包含树突干染色平均荧光强度至少高出50%的粉红色荧光强度的F-肌动蛋白形态突触斑点。
最后，根据公式计算密度，将数据表示为每十微米树突长度上的F-actin puncta数量。此处，微分干涉相差成像展示了体外培养的胎鼠皮层神经元在培养第4至27天发育过程中所观察到的形态学变化。注意随着原代培养的大鼠神经元成熟，树突的长度和数量均有所增加。
由于鬼笔环肽对F-actin的标记非常迅速，因此可以在进行免疫细胞化学抗体标记之前，先通过显微观察直观评估突触-树突网络的完整性。Map2可标记完整的树突，从而证实F-actin点状结构位于神经元树突上，而非定位于星形胶质细胞等其他细胞。在高分辨率图像中，可观察到富含F-actin的结构，包括丝状伪足、树突棘突起以及F-actin斑块。
在本项评估HIV-1 tat诱导突触-树突损伤的实验中，Map2染色显示，经HIV-1 tat处理后，大鼠皮层神经元的树突分支减少，F-actin表达降低。实际上，F-actin puncta的数量会随实验处理而增加或减少。例如，在本实验中，当培养的神经元经非竞争性NMDA受体拮抗剂美金刚处理后，F-actin阳性puncta的密度显著增加。
相比之下，使用甲基苯丙胺联合 HIV1 tat 处理会导致 F-肌动蛋白点状结构显著减少。在获取标记了 F-肌动蛋白和 Map2 神经元的高分辨率图像后，需由两名经过培训的观察者选取二级树突片段，用于分析点状结构的密度。该技术一经建立，便为神经科学研究领域的研究人员开辟了新的研究途径。
不仅可用于急性突触病变的监测，还可用于突触恢复及实验性神经修复过程的研究。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立一种可靠的方法来评估神经树突网络的突触完整性。
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概述
本文介绍了一种定量培养的大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）点状结构的详细实验方案。该方法结合了原代神经元培养、免疫细胞化学染色和基于图像的定量分析，用于评估突触完整性和可塑性。该技术适用于研究实验处理（如暴露于神经毒性物质或神经保护药物）后树突突触结构的变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫细胞化学
背景
- F-肌动蛋白对树突棘生成、突触可塑性和突触稳定性至关重要。
- 树突中F-肌动蛋白结构的改变反映了突触连接性和完整性的变化。
- 对F-肌动蛋白斑点进行可靠定量，对于研究不同处理条件下突触变化具有重要意义。
- 既往研究已将F-肌动蛋白的动力学变化与滥用药物及HIV蛋白引起的神经元损伤联系起来。
研究目的
- 提供一种可重复的原代大鼠皮层神经元培养及F-actin puncta定量的实验方案。
- 实现在不同实验条件下对突触完整性和可塑性的评估。
- 促进体外突触病变及突触修复相关研究的开展。
使用的方法
- 使用多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）制备并包被玻璃底培养皿。
- 低密度接种E18大鼠额叶皮层神经元并进行解离培养。
- 在无血清培养基中体外培养12–14天，以促进神经元生长并抑制星形胶质细胞增殖。
- 使用AlexaFluor 488标记的鬼笔环肽（Phalloidin）对F-肌动蛋白进行免疫细胞化学染色，并用MAP2抗体验证树突结构。
- 进行高分辨率荧光显微镜观察及图像采集。
- 利用专用软件及独立观察者，对二级树突分支上的F-肌动蛋白斑点密度进行定量分析。
主要结果
- 该方案可实现对富含F-actin的结构（包括丝状伪足、树突棘突起和F-actin斑块）的可视化与定量分析。
- 实验处理因素（如HIV-1 Tat蛋白或甲基苯丙胺）可降低F-actin斑点密度及树突分支程度。
- 神经保护剂（如美金刚）可增加F-actin斑点密度。
- 该方法可用于可靠评估突触变化及树突网络的完整性。
结论
- 本方案为测量培养神经元中的突触完整性提供了一种可靠的方法。
- 该方法适用于研究急性突触病变以及突触恢复过程。
- 该技术可支持神经元损伤与修复机制的相关研究。
常见问题
行业重要性概述
对大鼠皮层神经元中F-肌动蛋白（F-actin）点状结构的定量分析，为评估实验干预条件下突触完整性和可塑性提供了可靠的平台。该工作流程可帮助早期研发团队探究神经毒性与神经保护背后的突触机制，从而提升靶点验证的预测可信度，并支持机制层面的风险评估。该方法具有良好的可重复性及定量输出能力，适用于项目筛选和转化神经科学研究，是一项极具价值的技术手段。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在化合物处理或基因扰动后，检测突触结构的变化。
- 通过量化与突触完整性相关的树突F-肌动蛋白改变，支持作用机制的去风险化分析。
- 通过直接测量突触网络的功能性反应，实现功能靶点的有效性验证。
- 为推进神经活性候选分子的研发提供预测性信心。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的神经元系统，用于下游化合物筛选。
- 提供标准化、可重复的F-actin puncta密度定量分析。
- 支持高内涵成像工作流程，实现突触调节剂的可扩展筛选。
- 支持对神经毒性及神经保护效应进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 将体外突触完整性测量与疾病相关终点相一致。
- 为神经活性物质从发现到临床前验证提供连续性支持。
- 基于定量突触读数实现风险调整后的推进决策。
- 支持突触病变及恢复的转化生物标志物开发。
流程与工作流整合
该定量方法可融入从发现到临床前研究的连续过程中，架起早期机制研究与突触健康转化研究之间的桥梁。
- 发现生物学：支持在神经元模型中进行突触机制的假设检验及通路解析。
- 筛选：提供即用型、可重复的F-肌动蛋白点状结构定量分析，用于化合物评估。
- 分析：提供定量输出结果——每段树突的点状结构密度，以实现可靠的统计学比较。
- 转化研究：将体外突触变化与疾病相关表型及生物标志物策略相联系。
- 企业级复用：提供可重复使用、标准化的工作流程，适用于多种神经生物学和神经毒性研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高突触靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强突触定量分析的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过降低早期神经活性项目的风险，为决策提供依据，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的神经治疗候选药物的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备原代神经元培养和免疫细胞化学方面的专业知识。
- 需要具备高分辨率荧光显微镜及图像分析软件的使用条件。
- 要求跨团队在基于观察者的定量分析和数据完整性方面实现标准化。
- 可适用于多种实验处理和神经元模型系统。
- 依赖于严格的图像筛选和统计分析，以获得可重复的结果。
