高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

本解剖学横切样本制备的总体目标是在细胞分辨率水平上定量分析拟南芥初生根中不同组织内晶体与纤维素的相对积累情况，从而实现不同组织间的直接比较。该方法有助于回答植物生理学与发育领域中的关键问题，例如特定细胞类型的细胞组成如何影响整个器官的生长。根据文本方案对拟南芥种子进行灭菌后，将无菌种子均匀铺在含有0.8%植物琼脂和0.5XM培养基的培养皿上。

用封口膜包裹培养皿，并用铝箔覆盖。将培养皿置于 4 摄氏度条件下保存 1 至 4 天，以促进种子均匀萌发。随后将培养皿转移至适合拟南芥幼苗生长的培养室中，将培养皿垂直放置，以确保根系在琼脂培养基表面正常生长。根据文本方案配制 Richardson 溶液，使用注射器驱动的 0.22 微米 PVD 滤器在使用前过滤。

接下来在化学通风橱中，通过将38 ml的0.5 M卡考基酸钠与2.5 ml戊二醛混合，配制50毫升固定液。然后向固定液中加入100 µL Richardson溶液，制成最终固定液。使用预先标记的培养板，将2至3 ml最终固定液加入孔中，确保液体完全覆盖幼苗。

使用塑料镊子小心地将最多10株幼苗转移至每个孔中。用封口膜密封培养板，然后在4摄氏度黑暗条件下保存至少一晚，最多可保存一周。为了脱水固定后的幼苗，用镊子夹取植株，并将其转移至新的已标记六孔板的孔中，六孔板中依次含有浓度递增的乙醇，处理时间如上所列。

在小玻璃瓶中，将一袋Historesin活化剂与50 ml基础树脂液混合，配制浸润介质。放入磁力搅拌子，在搅拌仪上搅拌溶液20分钟。向六孔板中已标记的孔内分别加入2至3 ml浸润介质。

然后，当幼苗完全脱水后，用镊子将其从95%乙醇溶液中转移至浸润介质中，确保幼苗完全被介质覆盖。将样品在4°C下保存至少四天，以确保介质充分渗透到植物组织中。准备包埋块时，将用铅笔标记了样品名称的小标签放入每个包埋模具的孔内。

通过将1 ml 固化剂加入15 ml 浸透介质中来制备包埋介质。用约200微升的包埋介质填充模具中每个孔的一半。并在模具上方覆盖一层薄膜，两侧各留出额外的1 ml。

将模具在室温下孵育至少两小时，以使部分聚合。接下来，制备额外的一批包埋介质，并将其置于冰上以防止聚合，同时将根尖在模具中排列。将包埋介质加入一个小培养皿中，并将一株幼苗放入介质中。

在解剖镜下，使用解剖刀切割每个根尖，然后小心地将其置于模具中，距离模具边缘约 2 至 3 mm，若制作横切面则垂直放置，若制作纵切面则水平放置。组织摆放完毕后，用包埋介质完全填充模具，并覆盖透明封膜。随后在室温下孵育至少两小时。将组织块放入含有干燥硅胶的干燥器中，在室温下过夜干燥。

使用配备金刚石刻划工具的制刀机制备玻璃刀，先将玻璃棒切割成方形，再沿对角线将方形切割，得到两把玻璃刀。检查两把玻璃刀是否均具有锋利的刃口。将样品块安装到样品座中。

然后使用单刃工业刀片，将根尖周围多余的包埋块材料削去，保留距根尖约1 mm，使其呈金字塔形状。将修整好的包埋块切成2至3微米宽的切片，并将切片转移至标记好的玻璃载片上。随后在切片上滴加水滴。

制备宽度均匀的切片对于减少分析数据的变异性至关重要。将载玻片置于低温加热块上，直至水分完全蒸发。为在偏光显微镜下观察而制备玻片时，将Richardson染液稀释至原浓度的2%，并取约1 ml覆盖组织切片。

然后将样品置于加热块上加热5秒，并用蒸馏水清洗。在加热板上干燥载玻片后，使用解剖显微镜观察切片，并用记号笔在载玻片背面标记出感兴趣切片的位置。加盖盖玻片前，加入100 µL封片介质。

根据文本方案进行成像与分析。图中显示的是拟南芥主根的横切面，其组成细胞和组织呈辐射状排列，包括非毛细胞、毛细胞和皮层。该共聚焦图像显示，在BRI1突变体背景下，BRI1-GFP在非毛细胞中的表达抑制了邻近细胞的单向扩展以及整个根的生长。

如图所示，从野生型以及在非毛细胞中表达BRI1的株系所获得的根部纵切面显示，纤维素微纤丝的取向相似，在分生区细胞中角度变异较大，而过渡区细胞中的变异较小。这使得可以比较两种遗传背景下相应分生区细胞和伸长区细胞中纤维素晶体的相对积累情况，如图中横切面所示，并揭示了非毛细胞中BRI1的表达与纤维素中晶体局部高积累之间的相关性。通常情况下，初次使用本方法的实验人员在视频观察中会遇到困难，因为在包埋过程中难以获得取向良好的根样本。

因此，应准备多个样品块进行切片。一旦熟练掌握，单个样品块的切片可在2至3小时内完成。在进行该操作时，需注意：如果细胞的纤维素微纤丝取向相似，则其纤维素晶体的积累程度在不同细胞间具有可比性，这一点由纵向切片结果确定。

观看本视频后，您应能充分掌握拟南芥幼苗的固定方法，以及如何将其包埋成块，并进一步制备根部的纵向和横向切片。您还应深入了解利用偏振光显微镜所能获得的数据信息。