结晶纤维素积累高分辨率的量化拟南芥根监视特定组织细胞壁修改
May 10th, 2016
结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成部分。然而，它在细胞分辨率下的定量在技术上具有挑战性。 在这里，我们报告了使用偏振光技术和根横截面在时空分辨率下获得细胞壁组成的信息。
这种解剖横截面制备的总体目标是在细胞分辨率下量化相对晶体和纤维素积累，从而能够直接比较原代拟南芥根中不同组织之间的比较。这种方法可以帮助回答植物生理学和发育领域的关键问题，例如给定细胞类型的细胞组成如何影响整个器官的生长。根据文本方案对拟南芥种子进行消毒后，将无菌种子铺在含有 0.8% 植物琼脂和 0.5XM 培养基的平板上。
用封口膜包裹板并用铝箔覆盖。将板在 4 摄氏度下存放 1 到 4 天，以促进均匀发芽。然后将板转移到适合种植拟南芥幼苗的生长室中，垂直定向板以保持根系在琼脂培养基顶部生长根据文本方案准备 Richardson 溶液：使用前通过注射器驱动的 0.22 微米 PVD 过滤器单元过滤。
接下来，在化学罩下，通过将 38 ml 0.5M 二甲胂酸钠与 2.5 ml 戊二醛混合来制备 50 毫升固定剂。然后将 100 微升 Richardson 溶液添加到固定溶液中，以生成最终的固定溶液。使用预先标记的板，然后将 2 至 3 ml 最终固定溶液放入孔中，使溶液完全覆盖幼苗。
使用塑料镊子小心地将最多 10 个幼苗转移到每个孔中。使用封口膜密封板，然后在 4 摄氏度的黑暗中存放至少一晚至一周。为了脱水固定的幼苗，使用镊子通过镊子将它们夹起植物，然后将它们转移到新标记的六孔板的孔中，这些孔板含有在此处列出的时间增加的乙醇浓度。
通过将一袋 Historesin Activator 的内容物与 50ml 碱性树脂液混合，在一个小玻璃瓶中制备渗透培养基。插入磁铁，将搅拌板上的溶液搅拌 20 分钟。用 2 至 3 ml 浸润培养基填充六孔板的标记孔。
然后，当幼苗完全脱水时，使用镊子将它们从 95% 乙醇溶液转移到渗透介质中，确保它们被培养基完全覆盖。将样品在 4 摄氏度下储存至少四天，以确保最大限度地渗透到植物组织中。为了准备块，在每个嵌入模具的孔中放置标有样品名称的小标签铅笔。
通过在 15ml 浸润介质中加入 1ml 固化剂来制备包埋介质。用大约 200 微升的包埋介质填充模具中每个孔的一半。并使用一块架空的薄膜覆盖模具，每侧多出 1 毫升。
将模具在室温下孵育至少两个小时，以允许部分聚合。接下来，准备另一批包埋介质并保持良好状态，以避免在模具中排列根尖时发生聚合。将包埋培养基加入一个小板中，并将一棵幼苗放入培养基中。
在解剖镜下，用手术刀切开每个根尖，然后非常小心地将其放置在距离模具周边约 2 至 3 毫米的模具中，垂直用于转移切片，水平用于纵向切片。整理好生活用纸后，使用包埋介质完全填充模具，并用架空薄膜覆盖。然后在室温下孵育至少两个小时要干燥块，请将它们放入装有干燥硅胶的干燥器中，并在室温下放置过夜。
使用配备金刚石刻痕工具的刀具机，从玻璃棒中制备玻璃刀，将玻璃路切成正方形，然后对角线切成正方形，制成两把刀。验证两把刀是否都有锋利的边缘。将块安装到支架中。
然后，使用单刃工业刀片从根尖去除最多 1 毫米的多余块状材料，以获得金字塔形状。将成型的块切成 2 至 3 微米宽的切片，然后将切片转移到标记的载玻片上。然后在切片上加入水滴。
准备宽度均匀的部分以最大限度地减少分析数据的可变性非常重要。将载玻片放在加热块上，设置为低热，直到水蒸发。为了准备在偏光显微镜下观察的载玻片，将 Richardson 溶液稀释至原始溶液的 2%，并使用约 1ml 覆盖切片。
然后将样品放在加热块上 5 秒钟，并使用蒸馏水清洗。在热板上干燥载玻片后，在解剖显微镜下观察切片，并使用记号笔标记载玻片的背面以指示感兴趣切片的位置。在盖上盖玻片之前加入 100 微升封固剂。
根据文本协议进行成像和分析。这里显示的是拟南芥主根的横截面，其组成细胞和组织（包括非毛细胞、毛细胞和皮层）具有放射状组织。该共聚焦图像显示了 BRI1-GFP 在 BRI1 突变体背景下非毛细胞中的表达，该突变体抑制了相邻细胞的单向扩增和全根生长。
如图所示，从野生型和在非毛细胞中表达 BRI1 的品系获得的根的纵向切片显示出与纤维素微纤维相似的方向，与过渡区的细胞相比，分生组织细胞中存在的角度变化很大。这使得能够比较两种遗传背景的相应分生组织和伸长细胞中纤维素中晶体的相对积累，如此处的横截面所示，并揭示了非毛细胞中 BRI1 表达与纤维素中晶体的高局部积累之间的相关性。通常，在视频中，这种方法的新手会很困难，因为在嵌入过程中获得定向良好的根是具有挑战性的。
因此，应准备几个块进行切片。一旦掌握，可以在 2 到 3 小时内完成单个块切片。在尝试此过程时，重要的是要记住，如果细胞的纤维素微纤维具有相似的方向，则晶体在细胞中的积累是可比的，由纵切面确定。
观看此视频后，您应该对如何固定拟南芥幼苗以及如何将它们嵌入块中以及如何准备纵向和横向根横截面有很好的了解。您还应该对使用偏振光显微镜可以获得的数据有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种使用偏振光技术在细胞分辨率下量化植物细胞壁中的结晶纤维素的方法。该方法允许对拟南芥主根细胞壁组成进行详细分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生理学
- 细胞生物学
- 植物学研究
背景
- 结晶纤维素是植物细胞壁的关键组成部分。
- 在细胞水平上量化纤维素在技术上具有挑战性。
- 了解细胞壁组成对研究植物生长至关重要。
- 本研究重点分析拟南芥主根。
研究目的
- 量化植物组织中的结晶和纤维素积累。
- 使得可以在根部不同细胞类型之间进行比较。
- 解决与植物发育和生理学相关的问题。
使用的方法
- 拟南芥根的解剖横断面的制备。
- 使用偏振光技术进行分析。
- 应用Richardson溶液进行染色。
- 在受控条件下发芽拟南芥种子。
主要结果
- 成功在细胞分辨率下量化纤维素。
- 深入了解不同组织中的细胞壁组成。
- 方法论允许对细胞组成进行直接比较。
- 研究结果有助于理解植物器官的生长。
结论
- 该方法为研究植物细胞中的纤维素提供了可靠的方法。
- 获得的见解可以为植物生理学和发育研究提供信息。
- 未来的研究可以在此方法基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution quantification of crystalline cellulose in Arabidopsis roots enables precise mapping of cell wall modifications at cellular resolution, supporting mechanistic de-risking in plant-based bioproduct pipelines. This approach provides actionable insights into tissue-specific cell wall architecture, informing early discovery and target validation for traits affecting growth and mechanical properties. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in plant biotechnology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell wall composition and its impact on organ growth at single-cell resolution.
- Supports functional validation of genetic modifications affecting cellulose deposition in specific tissues.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking cellular behavior to whole-organ development.
- Improves predictive confidence for selecting targets influencing plant structural traits.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue sections for quantitative imaging workflows using polarized light microscopy.
- Standardizes measurement of crystalline cellulose accumulation across different cell types and genetic backgrounds.
- Enables reproducible, quantitative outputs for downstream screening of cell wall-modifying interventions.
- Supports assay scalability and platform reuse for comparative studies in plant R&D.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular-level cell wall data with whole-organ growth phenotypes for translational continuity.
- Provides a framework for risk-adjusted advancement of engineered plant lines based on tissue-specific cell wall metrics.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to cell wall composition and mechanical properties.
- De-risks preclinical decisions by enabling direct comparison of engineered and wild-type tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This polarized light-based quantification method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant biotechnology, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the relationship between cell wall composition and organ growth.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for tissue-specific cellulose accumulation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements enabling statistical comparison across genotypes and tissues.
- Translational Research: Connects cellular metrics to phenotypic outcomes, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical capability for diverse plant R&D programs targeting cell wall traits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall research.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging for reproducible, scalable analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for genetic modifications impacting plant structure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant lines based on quantitative cell wall metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue preparation and polarized light microscopy.
- Demands access to specialized imaging instrumentation and analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Orientation and uniformity of tissue sections are critical for data comparability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Plant Growth and Fixation
2:17
Dehydration and Infiltration
3:25
Block Preparation
5:10
Sectioning and Slide Preparation for Polarized Microscope
7:11
Results: Cell-type Specific Responses to Brassinosteroids in the Arabidopsis Root System
8:21
Conclusion
