原位表征水溶液中水合蛋白质的 SALVI 与 ToF-SIMS 方法

本实验的总体目标是利用液体-真空界面分析系统（System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface）和飞行时间二次离子质谱法，对水溶液中吸附的蛋白质膜进行表征。该方法有助于回答有关生物分子及其生物界面的关键问题，例如，对固体表面吸附的蛋白质进行表征。

该技术的主要优势在于，生物分子可以在液体环境中原位启动，并可结合分子定位分析。尽管该方法能够提供固体-液体界面处生物分子的信息，但也可应用于其他体系，包括单个癌细胞的研究、药物相互作用以及生物膜的附着过程。取一支5 mL注射器，吸取2 mL的70%乙醇溶液。

将注射器连接到SALVI装置的入口端，在10分钟内缓慢注入1毫升液体。注射结束后，取下注射器，并使用聚醚醚酮接头连接SALVI的入口和出口。在室温下保持SALVI微通道充满70%乙醇溶液，持续4小时。

然后，用无菌去离子水填充第二支注射器。将其连接到SALVI的入口，并在10分钟内缓慢将去离子水注入装置中。移除注射器，并将装置的入口和出口重新连接在一起。

为了固定蛋白膜，首先用注射器吸取两毫升纤连蛋白溶液。将注射器连接至 SALVI 装置的入口，缓慢注入一毫升液体，持续 10 分钟。随后取下注射器，重新连接入口和出口。

将装置置于洁净的培养皿中，在室温下孵育12小时。孵育结束后，在10分钟内缓慢注入1毫升无菌去离子水，然后将入口与出口重新连接。首先，将飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）样品台放置在平坦、洁净的表面上。

将SALVI装置放置在载物台上，使硅晶圆和氮化硅膜朝上。使用四个金属夹具将SALVI装置固定在载物台上，并通过四颗螺丝将固定装置角落的金属件拧紧至金属板上。接着，轻轻卷起连接至微流控通道的PTFE管。

使用四个金属件和四个螺丝固定刚性部分。确保装置放置在样品台的空旷区域，以免在分析过程中干扰一次离子束。接下来，使用螺丝将法拉第杯安装到样品台上。

然后，打开飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）的负载锁门，将样品台水平放置在装载平台上，随后关闭舱门。启动真空泵，使负载锁腔室抽真空至约10⁻⁶毫巴。约30分钟后，待真空度稳定，再将SALVI装置移入主腔室。

根据制造商推荐的方案，调节飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）的初级离子束和分析器，以获得约400纳米的空间分辨率。接下来，使用光学显微镜找到微流控通道。以光学图像中心为参考，将其与二次离子图像中心对齐，确保两者一致。

此步骤的可视化演示至关重要，因为样品比常规固体样品更厚，难以调节参数以找到通道的最佳焦距。每次测量前，使用1 keV的氧束在氮化硅窗口上扫描约15秒，以去除表面污染。在所有测量过程中，还需使用电子漫射枪来补偿表面电荷积累。

接下来，在开始数据采集之前选择正离子模式或负离子模式。所有测量中均使用25 keV的铋三正离子（Bi³⁺）作为一次离子束。进行深度剖析时，将一次离子束扫描在直径约2微米的圆形区域上，扫描分辨率为32像素 × 32像素。

为了尽量缩短穿透氮化硅膜所需的时间，应使用长脉冲宽度的初级离子束。在完成氮化硅膜的穿透后，保持相同的电流约200秒，以获取足够的数据用于二维图像重建。在数据采集过程中，将脉冲宽度减小至80纳秒，以便获得具有更高质谱分辨率的谱图。

继续采集约另外200秒。使用SALVI微流控接口，一次离子束可直接轰击水合纤连蛋白薄膜。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）数据表明存在多种水团簇和氨基酸片段。

这为水分子在水合蛋白质分子周围及内部的性质提供了直接证据。此处可以观察到水合纤连蛋白薄膜以及去离子水的深度分布时间序列。在氮化硅膜被穿透之前，所选二次离子的强度可忽略不计。

一旦氮化硅膜被穿透，次级离子的强度会显著增加。短脉冲宽度模式用于获取具有更佳质量分辨率的数据，以进行图像和谱图重建。来自水合纤连蛋白薄膜和去离子水的二维图像，代表了样品中选定次级离子的计数。

图像越亮，二次离子计数越高。这些直观的图像可清晰比较不同样品间选定的二次离子，有助于数据分析。在进行此操作时，需注意微反应器在安装到真空腔室之前必须确保无泄漏。

该技术为生物学和生物界面领域的研究人员探索蛋白质吸附、生物膜附着、表面自组装单分子层以及许多其他现象铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用SALVI和液体飞行时间二次离子质谱（liquid ToF-SIMS）来研究各种液体样品。