小鼠脑切片准备扣押样活性的直接电流刺激和多电极阵列记录
June 7th, 2016
研究表明，阴极经颅直流电刺激可对耐药性癫痫发作产生抑制作用。在这项研究中，设计了一种体外实验装置，其中在小鼠脑切片制备中评估了直流电刺激和癫痫发作样活动的多电极阵列记录。评估直流电刺激参数。
该实验程序的总体目标是访问记录室中电极的排列，以直流电刺激脑切片，以及它对用多电极阵列记录的癫痫样活动的影响。这可以更好地帮助回答直流电刺激中的关键问题，并且多电极阵列记录了小鼠脑切片中的癫痫样活动。该技术的一个优点是可以在小鼠脑切片的特定通路中评估直流电刺激的效果。
演示该程序的是我实验室的技术人员 Hsiang Chin 和 Wei-Jen Chang。在此过程中，实验前用 75% 乙醇溶液对所有手术器械进行消毒。然后，露出动物的头骨并修剪掉剩余的肌肉。
接下来，用 Leneurs 剥去头骨的背面，并修剪掉侧面。随后，使用抹刀，在取出大脑腹侧表面之前，先切开大脑腹侧表面的嗅球和神经连接。快速将大脑转移到装满冰冷、含氧 ACSF 的烧杯中。
为了制备含有 MT-ACC 通路的切片，在每个半球中线外侧 2 mm 处进行矢状切割，以显示皮层下解剖结构。然后，在纹状体中平行于可见纤维束做一个倾斜的横切。从小脑和视觉皮层之间的连接处开始，到前连合和视束之间的中点，在腹侧，平行于丘脑扣带回通路，做第二个有角度的横切。
之后，用氰基丙烯酸酯粘合剂将脑块连接到角板上。在路径的转折点上方做一个切口。之后，展开板，将其压平，然后将其粘在颤音机的腔室舞台上。
随后将脑切片切成 500 微米厚，并将它们保存在冰冷的含氧 ACSF 中。将切片转移到 32 摄氏度的记录室中，连续注入含氧 ACSF 一小时。确认 MEA 探头在多通道系统上的位置。
使用一根管将 ACSF 引导到 MEA 腔室中，使用另一根管将 ACSF 引导出腔室。在 30 摄氏度下用温暖的含氧 ACSF 连续灌注制剂。使用湿棉签，将脑切片转移到 MEA。
小心地移动脑切片，使 ACC 位于电极上方，然后用切片锚稳定脑切片，以确保切片和电极之间有良好的电气连接。之后，将阳极电极放置在 ACC 近端，将阴极电极放置在 ACC 远端。通过 MEA 的两个磁场方向记录场强。
然后使用刺激器输送电流。将两个氯化银电极之间的距离调整到大约 1.5 到 2 厘米，并调整刺激器电流强度，使 DCS 在 0.5 到 2 毫安之间。在此过程中，将钨电极放入 MT 中，并将脉冲从刺激器传递到切片的丘脑区域。
接下来，使用各种电流强度来确定引发 ACC 响应的阈值。沿丘脑扣带回通路移动钨电极以获得最佳响应曲线。记录 1-20 个 ACC 反应，并使用该软件自动平均所有引起我 MT 刺激的 ACC 反应。
为了诱导癫痫样活动，向灌注溶液中加入 250 微摩尔 48P 和 5 微摩尔双胞苷，并继续大量切片 2 到 3 小时。将泵保持在相对较快的灌注速率，这有助于防止 pH 梯度的积累。接下来，将钨电极放在 MT 上并施加电刺激以获得 ACC 响应曲线。
记录 10-20 次扫描并平均响应。之后，用新鲜的 ACSF 替换预融合溶液以洗出药物。在此过程中，通过在放置在 MEA 室内的两根平行的氯化银涂层银线之间传递电流，确保产生均匀的电场。
如果没有问题，DCS 应保持在 0.5 到 2 毫安之间。接下来，关闭 DCS 并用钨电极刺激丘脑。为了在 ACC 中获得最大的突触反应，记录 10-20 个反应，然后平均它们。
然后，打开 DCS 并同时刺激丘脑。评估 DCS 期间丘脑刺激诱发的 ACC 反应的振幅变化。现在，关闭 DCS，在灌注溶液中加入 250 微摩尔 48P 和 5 微摩尔双尖晶，并等待 2-3 小时。
如果药物影响脑切片，该切片应产生皮质癫痫发作反应。随后，收集 10-20 个前扣带回皮质反应，并测量电诱发的皮质癫痫发作反应的幅度和持续时间。筑巢，打开 DCS 并同时刺激丘脑。
评估 DCS 应用期间诱发的皮质癫痫发作反应的幅度和持续时间的变化。之后，用新鲜的 ACSF 替换灌注溶液以洗出药物。该图显示了不同的诱发反应，包括 ACC 中的丘脑刺激诱发反应、药物诱导的癫痫样活动，以及丘脑刺激和药物诱导的癫痫样活动。
该图显示了 DCS 中不同方向的影响，例如电场的不同方向、丘脑刺激诱发的 DCS 反应，以及阴极 DCS 对癫痫发作样活动的影响。在该图中，显示 15 分钟的阴极 DCS 已有效诱导长期抑郁和抑郁诱发反应。与未应用 DCS 相比，阴极 DCS 15 分钟后癫痫发作持续时间显着缩短。
更快，如果执行得当，这在技术上可以在四个小时内完成。在此程序之后，可以执行其他事项，例如经颅磁刺激，以回答其他问题，例如提供控制抵抗性癫痫发作的无创方法。在此发展之后，这项技术为无创治疗领域的研究人员探索动物模型中的癫痫发作治疗铺平了道路。
看完这个视频，你应该对如何使用当前的刺激来评估脑切片中的癫痫样活动有一个很好的了解。
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概述
本研究使用体外小鼠脑切片模型，探讨阴极经颅直流电刺激对耐药性癫痫发作的影响。通过多电极阵列评估电极的排列及其对癫痫样活动的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经刺激
背景
- 阴极经颅直流电刺激对癫痫有潜在的治疗作用。
- 了解刺激机制有助于开发耐药性癫痫的治疗方法。
- 体外模型允许对神经元活动进行精确控制和观察。
- 多电极阵列提供了对脑切片中电活动的详细记录。
研究目的
- 评估直流电刺激对小鼠脑切片中癫痫样活动的影响。
- 评估记录室中电极的排列。
- 增强对受刺激影响的通路的理解。
所用方法
- 准备小鼠脑切片以进行实验。
- 应用阴极经颅直流电刺激。
- 使用多电极阵列记录癫痫样活动。
- 评估刺激参数及其效果。
主要结果
- 直流电刺激对癫痫样活动产生了抑制作用。
- 特定的电极排列影响了刺激的结果。
- 该研究提供了关于癫痫调节所涉及通路的见解。
- 结果支持直流电刺激在治疗应用中的潜力。
结论
- 阴极经颅直流电刺激可以有效地调节体外癫痫活动。
- 研究结果有助于理解神经科学中的刺激技术。
- 需要进一步的研究将这些发现转化为临床应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neuromodulation strategies for seizure disorders by evaluating direct current stimulation effects on thalamocingulate pathway plasticity and seizure-like activity in an in vitro mouse model. It supports target validation and predictive confidence in preclinical neurotherapeutic development by quantifying amplitude and duration changes in electrically evoked cortical responses. The approach provides a reproducible platform for screening stimulation parameters prior to in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding neuromodulation of thalamocingulate circuitry in seizure suppression.
- Operational Value: Enables biological de-risking of direct current stimulation targets through pathway-specific electrophysiological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated brain slice preparations for standardized assessment of stimulation parameters including orientation, field strength, and duration.
- Operational Value: Delivers quantitative, multi-channel electrophysiological outputs that support assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity in anterior cingulate cortex.
- Operational Value: Supports translational continuity from mechanistic discovery to preclinical evaluation of neuromodulation interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization in neuromodulation, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of thalamocingulate circuitry as a modifiable target for seizure control.
- Screening: Enables assay readiness through standardized multi-electrode array recording of stimulation-evoked and seizure-like responses.
- Analytics: Generates quantitative measurements of response amplitude and duration that allow comparative analysis across stimulation conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by modeling drug-resistant seizure phenotypes in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating diverse neuromodulation paradigms beyond direct current stimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by demonstrating suppression of seizure-like activity through cathodal stimulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled perfusion, electrode placement, and multi-channel recording protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parameter optimization in vitro before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuromodulation candidates based on electrophysiological de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slice preparation, and multi-electrode array handling.
- Dependent on vibratory microtomes, perfusion systems, stimulators, and multi-electrode array acquisition units.
- Necessitates standardization of slice orientation, electrode positioning, and perfusion timing across experimental replicates.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require validation of pathway preservation and stimulation efficacy.
- Practical limitations include slice viability duration and the need for precise control of current density and field orientation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Preparation of Medial Thalamus-anterior Cingulate Cortex Brain Slice
3:01
Preparation of Perfusion Chamber for Multielectrode Array Recording and Electric Field Generation
4:23
Electrically-induced Cortical Synaptic Responses and Seizure-like Activity
5:58
Testing Effect of DCS on Evoked Cortical Responses
7:37
Results: Testing of Evoked Responses and Effect of DCS on Seizure Activity
8:37
Conclusion
