直流电刺激与多电极阵列记录小鼠脑片中类癫痫样活动

本实验方案的总体目标是，通过多电极阵列记录小鼠脑片中癫痫样活动，研究记录室中电极的排布方式，以实现对脑片施加直流电刺激并观察其效应。该方法有助于深入解答直流电刺激以及利用多电极阵列记录小鼠脑片癫痫样活动中的关键科学问题。该技术的一个优势在于，可在小鼠脑片的特定神经通路中评估直流电刺激的作用效果。

本实验操作将由本实验室的技术人员 Hsiang Chin 和 Wei-Jen Chang 演示。在该操作中，实验前先用 75% 乙醇溶液对所有手术器械进行灭菌处理，然后暴露动物的颅骨并清除残留的肌肉组织。

接下来，使用咬骨钳剥离颅骨的背侧表面，并修剪两侧。随后，用解剖刀沿脑腹侧表面切断嗅球及神经连接，然后取出脑组织。迅速将脑组织转移至一个装有冰冷且充氧的ACSF的烧杯中。

为制备包含MT-ACC通路的脑切片，先在每侧半球距中线外侧2 mm处进行矢状切，以暴露皮层下解剖结构。随后，沿纹状体内可见的纤维束平行方向进行一次倾斜的横切。第二次倾斜横切的路径应从小脑与视觉皮层的连接处延伸至前连合与视束之间的中点，该路径位于丘脑扣带通路的腹侧并与其平行。

之后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将脑组织块固定在角度板上。在通路转折点稍上方处进行切割。随后展开角度板并将其展平，粘附至振动切片机的样品台中。

随后将脑切片切成500微米厚度，并将其保存在冰冷的含氧人工脑脊液（ACSF）中。将一片切片转移至32摄氏度的记录室中，并持续灌注含氧ACSF，孵育一小时。确认多通道系统上MEA探针的放置位置。

使用一根管路将ACSF导入MEA腔室，另一根管路将ACSF导出腔室。以30摄氏度的温热含氧ACSF持续灌流组织样本。用湿润的棉签将脑片转移至MEA上。

小心移动脑切片，使前扣带回（ACC）位于电极上方，然后使用切片固定锚稳定脑切片，以确保切片与电极之间良好的电接触。随后，将阳极电极置于靠近前扣带回的位置，阴极电极置于远离前扣带回的位置。通过MEA的两种电场方向记录场强。

然后使用刺激器施加电流。调节两个氯化银电极之间的距离约为1.5至2 cm，并调节刺激器的电流强度，使直流电刺激（DCS）介于0.5至2毫安之间。在此步骤中，将一根钨电极置于MT区域，并通过刺激器向脑片的丘脑区域输送电脉冲。

接下来，使用不同的电流强度，确定引发前扣带回（ACC）反应的阈值。沿丘脑-扣带回通路移动钨电极，以获得最佳反应曲线。记录1-20次ACC反应，并利用软件自动对由MT刺激诱发的所有ACC反应进行平均。

为诱导类似癫痫的活动，向灌流液中加入 250 微摩尔 48P 和 5 微摩尔荷包牡丹碱，并持续灌流脑片两至三小时。保持泵以相对较快的灌流速度运行，这有助于防止 pH 梯度的形成。接下来，将钨电极置于 MT 处，施加电刺激以获得前扣带皮层（ACC）的反应谱型。

记录10-20次扫描并平均反应结果。随后，将预融合溶液替换为新鲜的ACSF，以洗去药物。在此过程中，通过置于MEA腔室内的两根平行的镀氯化银银丝之间传递电流，确保产生均匀的电场。

若无异常情况，直流电刺激（DCS）的电流应保持在0.5至2毫安之间。接下来，关闭直流电刺激，使用钨电极刺激丘脑。为获得前扣带皮层（ACC）中的最大突触反应，记录10-20次反应后取其平均值。

然后，开启直流电刺激（DCS）并同时刺激丘脑。在 DCS 期间评估丘脑刺激诱发的前扣带皮层（ACC）反应的幅度变化。现在，关闭 DCS，向灌流液中加入 250 微摩尔 48P 和 5 微摩尔荷包牡丹碱（bicuculline），孵育 2-3 小时。

如果药物对脑片产生作用，脑片应出现皮层癫痫样反应。随后，采集10-20次前扣带皮层反应，并测量电刺激诱发的皮层癫痫样反应的幅度和持续时间。接着，打开直流电刺激（DCS）并同时刺激丘脑。

评估在DCS应用期间诱发皮层癫痫样反应的振幅和持续时间的变化。之后，用新鲜ACSF更换灌流液，以洗脱药物。该图显示了不同的诱发反应，包括前扣带皮层（ACC）中由丘脑刺激诱发的反应、药物诱导的癫痫样活动，以及由丘脑刺激和药物共同诱导的癫痫样活动。

该图显示了不同方向的直流电刺激（DCS）所产生的影响，例如电场中不同方向、丘脑刺激诱发的反应以及阴极直流电刺激对类癫痫样活动的影响。在此图中，15分钟的阴极直流电刺激可有效诱导长期抑制，并降低诱发反应。与未施加直流电刺激相比，15分钟阴极直流电刺激后，癫痫样放电持续时间显著缩短。

如果操作得当，这一过程理论上可在四小时内完成。采用该方法后，还可进行经颅磁刺激等其他操作，以回答更多问题，例如提供控制耐药性癫痫发作的非侵入性方法。该技术的建立为非侵入性治疗领域的研究人员探索动物模型中的癫痫发作治疗铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用电流刺激来评估脑片中的类癫痫样活动。