直流电刺激与多电极阵列记录小鼠脑片中类癫痫样活动

本实验方案的总体目标是，通过在记录室中设置电极排列，对脑片施加直流电刺激，并利用多电极阵列记录其对类癫痫样活动的影响。该方法有助于深入解答直流电刺激以及小鼠脑片中多电极阵列记录的类癫痫样活动相关的关键科学问题。该技术的一个优势在于，能够评估直流电刺激对小鼠脑片特定神经通路的作用效果。

本实验操作将由本实验室的技术员 Hsiang Chin 和 Wei-Jen Chang 演示。在该操作中，实验前需用 75% 乙醇溶液对所有外科手术器械进行灭菌处理。随后，暴露动物的颅骨，并清除残留的肌肉组织。

接下来，使用咬骨钳剥离颅骨的背侧表面，并修剪两侧。随后，用解剖刀沿脑腹侧表面切断嗅球及神经连接，然后取出脑组织。迅速将脑组织转移至一个盛有冰冷且充氧的ACSF的烧杯中。

为制备包含MT-ACC通路的脑片，需在每侧半球距中线外侧2 mm处进行矢状切面切割，以暴露皮层下解剖结构。随后，沿纹状体内可见的纤维束平行方向进行一次斜向横切。第二次斜向横切应从小脑与视觉皮层的连接处延伸至前连合与视束之间中点，该切线位置位于丘脑扣带通路腹侧且与其平行。

随后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将脑组织块固定在角度板上。在通路转折点稍上方进行切割。然后，展开角度板并将其展平，粘附于振动切片机的样品台中。

随后将脑片切成500微米厚度，并将其保存在冰冷的含氧人工脑脊液（ACSF）中。将一片脑片转移至32摄氏度的记录室中，持续灌注含氧ACSF，孵育一小时。确认多通道系统上MEA探针的放置位置。

使用一根管路将ACSF导入MEA腔室，另一根管路将ACSF导出腔室。以30摄氏度的温热含氧ACSF持续灌流脑片。用湿润的棉签将脑片转移至MEA上。

小心移动脑切片，使前扣带皮层（ACC）位于电极上方，然后使用切片固定锚稳定脑切片，以确保切片与电极之间形成良好的电连接。随后，将阳极电极置于靠近前扣带皮层（ACC）的位置，阴极电极置于远离前扣带皮层（ACC）的位置。通过MEA的两种场方向记录场强。

然后使用刺激器施加电流。调节两个氯化银电极之间的距离至约1.5到2 cm，并调节刺激器的电流强度，使直流电刺激（DCS）介于0.5至2毫安之间。在此步骤中，将一根钨电极置于MT区域，并从刺激器向脑片的丘脑区域传递电脉冲。

接下来，使用不同的电流强度，确定引发前扣带皮层（ACC）反应的阈值。沿丘脑-扣带回通路移动钨电极，以获得最佳反应曲线。记录1-20次ACC反应，并使用软件自动平均所有由MT刺激诱发的ACC反应。

为诱导类似癫痫的活动，向灌流液中加入 250 微摩尔 48P 和 5 微摩尔荷包牡丹碱，并继续灌流脑片两到三小时。保持泵以相对较快的灌流速度运行，这有助于防止 pH 梯度的形成。接下来，将钨电极置于 MT 处，施加电刺激以获得 ACC 反应谱型。

记录10-20次扫描并平均反应结果。随后，用新鲜的ACSF替换预融合溶液，以洗去药物。在此过程中，通过置于MEA室内的两根平行的氯化银涂层银丝之间传递电流，确保产生均匀的电场。

若无异常情况，直流电刺激（DCS）应保持在0.5至2毫安之间。接下来，关闭DCS，并使用钨电极刺激丘脑。为获得前扣带皮层（ACC）中的最大突触反应，请记录10至20次反应，然后取其平均值。

然后，打开直流电刺激（DCS）并同时刺激丘脑。在 DCS 期间评估丘脑刺激诱发的前扣带皮层（ACC）反应的幅度变化。现在，关闭 DCS，在灌流液中加入 250 µM 48P 和 5 µM 荷包牡丹碱（bicuculline），并等待 2–3 小时。

如果药物对脑片产生作用，脑片应产生皮层癫痫样反应。随后，采集10-20个前扣带皮层反应，并测量电刺激诱发的皮层癫痫样反应的幅度和持续时间。接着，开启直流电刺激（DCS）并同时刺激丘脑。

评估在直流电刺激（DCS）应用期间诱发皮层癫痫样反应的幅度和持续时间的变化。随后，更换灌注液为新鲜的人工脑脊液（ACSF），以洗脱药物。该图显示了不同的诱发反应，包括前扣带皮层（ACC）中由丘脑刺激诱发的反应、药物诱导的癫痫样活动，以及由丘脑刺激和药物共同诱导的癫痫样活动。

该图展示了不同方向的直流电刺激（DCS）的影响，例如电场中不同方向、丘脑刺激诱发的反应以及阴极直流电刺激（DCS）对类癫痫样活动的作用。在此图中，15分钟的阴极直流电刺激显示出可有效诱导长期抑制，并降低诱发反应。与未施加直流电刺激相比，15分钟阴极直流电刺激后，癫痫样发作持续时间显著缩短。

如果操作得当，这一过程理论上可在四小时内完成。通过该方法，还可进一步开展经颅磁刺激等其他研究，以探索控制耐药性癫痫发作的非侵入性策略，回答更多相关科学问题。该技术的建立为非侵入性治疗领域的研究人员提供了重要基础，推动了在动物模型中探索癫痫治疗方案的发展。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何利用电流刺激来评估脑片中的类癫痫样活动。