Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

该梯度应变芯片的总体目标是提供一种简单的方法，在 3D 水凝胶上生成非连续梯度静态应变，用于研究一系列应变条件下的细胞行为。该方法可以帮助回答生物工程领域的关键问题，例如干细胞分化的刺激和人工组织器官发育的细胞排列调节。该技术的主要优点是可以在同一微环境中将各种菌株应用于细胞层和水凝胶，以比较细胞行为。

这种方法的视觉演示至关重要，因为芯片制备步骤很难学习，因为光应在三到四个小时内完成，以确保高细胞变异性。称取 10 克明胶粉，将其添加到装有 100 毫升 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 的玻璃瓶中。将磁力搅拌棒放入烧瓶中，然后将烧瓶放在搅拌热板上。

用铝箔盖住烧瓶，以避免水分蒸发。将热板温度设置为 50 至 60 度，搅拌器以 100 RPM 的速度放置 1 小时以溶解明胶粉。明胶溶解后，用移液管非常缓慢地加入 8 毫升甲基丙烯酸酐。

让它在 60 摄氏度下反应三个小时。然后将预热的 DPBS 加入培养瓶中，最终体积为 500 mL。让溶液充分混合 15 分钟以终止反应。

同时将透析膜切成几根 25 毫米长的管子。将它们浸入去离子水中 15 分钟。打一个结以关闭透析管的一端。

适量的聚合物溶液装入透析管中，然后关闭另一端。然后将装满的试管放入装有去离子水的 5 升塑料烧杯中一周。每天更新去离子水两次，并在透析过程中将溶液保持在 40 至 50 摄氏度。

透析后，将试管中的溶液收集到 500 毫升玻璃瓶中。将大约 450 至 500 毫升溶液倒入 500 毫升滤杯中。并施加真空，迫使溶液通过滤膜进行灭菌。

然后将灭菌后的聚合物转移到几个 50 mL 的灭菌管中。将灭菌后的聚合物转移到几个 50 毫升的灭菌管中，并在零下 80 摄氏度的冰箱中存放 3 到 5 天。使用冷冻干燥机将零下 80 摄氏度的聚合物冷冻干燥一周，形成 GelMA，然后可以储存在零下 80 摄氏度的冰箱中。

对于芯片制造，首先准备聚甲基丙烯酸酯或 PMMA，按照文本协议中的描述进行播放和成型。然后适当混合 30 克 PTMS 弹性体和 3 克 PTMS 固化剂，准备 PTMS 盖和 PTMS 塞子。在真空室中对混合物脱气 1 小时。

1.8 至 2 克混合物浇注到 PTMS 盖板的 PMMA 模具中。还要使用适量填充 PTMS 插头的 PMMA 模具的每个型腔。此外，将 10 克未固化的 PTMS 混合物浇注在 10 厘米的空白塑料板中。

将这些模具放入真空室中脱气 30 分钟。在 80 摄氏度下固化 PTMS 两个小时。冷却模具上固化的 PTMS 后，从 PMMA 模具上拆下 PTMS 盖和 PTMS 塞子。

接下来，在 PTMS 盖板的流道末端打两个直径约为 3 毫米的孔。将 10 厘米塑料板模制的 PTMS 片材切割成许多 1 厘米 x 1 厘米的立方体。并在每个 PTMS 立方体上打一个 3 毫米的孔。

将两个未固化的 1 厘米 x 1 厘米 PTMS 立方体粘在 PTMS 盖的开口上，以用作培养基储液器，并帮助梯度圆形水凝胶图案的固化过程。然后在 80 摄氏度下固化 1 小时。接下来，将带有两个 PTMS 储液槽的 PTMS 盖粘合到 TMSPMA 涂层玻片上。

为此，在氧气等离子体机器下对 PTMS 盖和 TMSPMA 涂层载玻片的粘合面进行 90 秒的氧气等离子体处理。接触 PTMS 盖板和 TMSPMA 滑块的等离子体处理表面，并将它们紧密按压，通过形成硅氧硅键实现永久粘合。通过在透明胶片上打印已建立的布局来打印光掩版。

然后将打印的光掩模切割成 25 毫米 x 37.5 毫米的大小。称取 25 毫克冻干 GelMA 放入 1.5 mL 黑色微量离心管中的 0.3 mL 预热细胞培养基中。将微量离心管放在实验室搅拌器热板上，直到 GelMA 溶解在培养基中。

微量离心管中将 50 毫克光引发剂加入 1 毫升 DPBS 中。并将其放入 80 摄氏度的烤箱中 15 分钟或直到光引发剂溶解。向微量离心管中加入 25 微升 10% 光引发剂。

移液数次以充分混合。接下来，使用自动细胞计数器计数 300 万个 NIH3T3 细胞。以 200 G 离心悬浮液 5 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 175 μL 细胞培养基中。

将细胞溶液添加到微量离心管中，以获得每毫升 5% GelMA、0.5% 光引发剂和约 600 万个 3T3 细胞的预聚合物细胞溶液。混合后，将 100 μL 细胞预聚物加载到 100 μL 微量注射器中。手动将一块光掩模对准灭菌梯度应变芯片的底部载玻片。

只需在两者之间使用一小滴去离子水来固定位置。将装有预聚物细胞溶液的 100 微升微量注射器连接到芯片的入口。然后使用微量注射器将 50 μL 预聚物池溶液放入流道中，并使用 PTMS 插头塞住出口。

额外注入 40 μL 溶液，在圆形 PTMS 膜中形成凸起。将带有光掩模、微量注射器和 PTMS 插头的芯片移至紫外线灯下。并将其暴露 30 至 45 秒，以交联流体室中的同心圆水凝胶。

交联后，取下 PTMS 塞子和微量注射器以释放液体压力。使用装有预热 DPBS 的 1 毫升注射器，从入口冲洗到出口冲洗未交联树脂 3 次。接下来，用约 100 微升的细胞培养基填充流道。

将芯片放入消毒的培养皿中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳气氛中培养一周。每天刷新培养基。作为对照组，孵育 4 小时后，在第 0 天拍摄 3 个芯片的图像。

并在第 3 天作为实验组使用具有 20 倍物镜的显微镜。使用软件测量从第 1 行到第 12 行的每个水凝胶的线宽，以计算压缩染色。此处显示的是 UV 交联和 4 小时孵育后，0 μL 和 40 μL 过量注射的水凝胶模式的代表性结果。

非过度注射对照中 3D 水凝胶的线宽看起来与预期一致。然而，过度注射 40 μL 的水凝胶模式给出了水凝胶的梯度线宽，从第 1 行减小到第 12 行。孵育 3 天后，水凝胶中的细胞向不同方向延伸。

由于水凝胶伸长的刺激，第一行中的细胞沿径向排列。相反，第 12 行中的细胞沿着水凝胶形状排列，其中几何线索主导细胞排列。第 7 行中没有特定的细胞对齐，其中第 1 行和第 12 行的两个细胞对齐线索相互平衡。

一旦测量了 3D 水凝胶上梯度应变的微观环境，如果作得当，可以通过梯度应变芯片在两小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住在加载细胞预聚物溶液之前对梯度应变芯片进行消毒。在将芯片放入细胞培养箱之前，还要用 75% 乙醇彻底擦拭芯片表面。

看完这个视频后，您应该对如何生成梯度菌株芯片来研究不同菌株下的细胞行为有很好的了解。