Name: 一氧化氮和超氧化物歧化酶恩的人脸检测在完整的动脉内皮细胞层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习使用DAF-2DA和DHE荧光染料在小鼠完整主动脉中同时检测一氧化氮和超氧化物阴离子的方法。该技术可用于研究内皮功能障碍和eNOS解偶联等心血管生理学问题。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由瑞士国家科学基金会（310030_141070/1）、瑞士心脏基金会和瑞士国家能力研究中心（NCCR-Kidney.CH）资助。余毅受到中国国家留学基金管理委员会的支持。

动物实验已获得瑞士弗里堡州兽医办公室伦理委员会的批准。本方案遵循本机构关于动物护理和实验的指导方针。
1. 分离动脉孵育装置的准备
<ol>
	<li>构建一个可加热至 37 °C 并能从二氧化碳气罐中通入 95% O2 和 5% CO2 进行充气的器官浴系统。</li>
	<li>根据以下成分浓度配制所需量的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液：（118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、0.026 mM EDTA 和 11.1 mM D-葡萄糖）。</li>
	<li>将储备缓冲液置于冰上保存，并用 95% O2 和 5% CO2 对缓冲液进行持续充气。</li>
	<li>开启器官浴系统，将温度设定为 37 °C，向每个腔室中加入 5 ml 即用型缓冲液，并持续用 95% O2 和 5% CO2 对缓冲液进行充气。</li>
	<li>用克雷布斯-林格缓冲液清洗腔室一次，持续 30 分钟。</li>
	<li>向每个腔室中加入 5 ml 克雷布斯-林格缓冲液，并覆盖腔室以防止蒸发。</li>
</ol>
2. 小鼠主动脉的分离
<ol>
	<li>以150 mg/kg的剂量将戊巴比妥钠溶解于0.9% NaCl溶液中，通过腹腔注射以处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术板上。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒胸部区域的毛发，以达到消毒和湿润的目的。</li>
	<li>沿肋骨剪开胸腔，暴露心脏和肺，并取出肺组织。</li>
	<li>用纸巾轻轻吸除胸腔内的血液。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住心脏，用手术剪刀剪除主动脉与脊柱之间的血管周围脂肪组织，分离胸主动脉。</li>
	<li>立即将全部组织浸入冰浴（4 °C）的Krebs-Ringer缓冲液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下分离心脏和主动脉弓，并将胸主动脉节段保留在缓冲液中。</li>
	<li>在显微镜下使用手术剪刀和镊子将主动脉从附着的血管周围组织中仔细剥离。</li>
	<li>用镊子夹住主动脉末端，使用26 G × 1/2ʺ注射器轻轻冲洗Krebs-Ringer缓冲液，以清除血管腔内的血液。</li>
	<li>将清洗后的主动脉环切成3 mm长的节段。 
	注意：此步骤需注意避免损伤内皮层。</li>
</ol>
3. DHE 和 DAF-2DA 染色
<ol>
	<li>用镊子将清洗干净的主动脉节段转移至盛有 Krebs-Ringer 缓冲液的器官浴槽中，缓冲液温度维持在 37 °C，并以 95% O2 和 5% CO2 混合气体持续通气。 
	注意：仅可用镊子接触主动脉环的外膜侧，切勿夹压血管。</li>
	<li>将动脉在器官浴槽中平衡孵育 30 分钟。</li>
	<li>向器官浴槽中加入乙酰胆碱（ACh），使其终浓度为 1 µM，继续孵育动脉 10 分钟。</li>
	<li>在 1.5 ml 微量离心管中，用预热的 Krebs-Ringer 缓冲液配制 1 ml DHE/DAF-2DA 溶液（每种染料终浓度为 5 µM，由 1,000× 储液稀释而来）。用铝箔包裹微量离心管以避光。</li>
	<li>刺激完成后，将主动脉环从器官浴槽转移至含 DHE/DAF-2DA 溶液的微量离心管中，在 37 °C 下以 95% O2 和 5% CO2 混合气体通气，孵育 30 分钟。 
	注意：从本步骤开始，始终将主动脉置于避光环境中。</li>
	<li>将主动脉环转移至另一新的含 Krebs-Ringer 缓冲液的微量离心管中进行清洗，1 分钟内重复清洗三次。</li>
	<li>将主动脉环转移至 4% 多聚甲醛溶液中固定 30 分钟。</li>
	<li>在 1.5 ml 微量离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制 1 ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（终浓度 300 nM，由 1,000× 储液稀释而来）。对主动脉进行复染，染色时间为 3 分钟。</li>
	<li>将主动脉转移至另一新的含 PBS 缓冲液的微量离心管中清洗 1 分钟，重复清洗三次。 
	注意：操作时注意避免夹压主动脉环或损伤内皮层。</li>
</ol>
4. En Face 封片
<ol>
	<li>在载玻片上加一滴封片剂。</li>
	<li>在显微镜下用显微手术剪将主动脉环纵向剪开，使卷曲的主动脉展平并固定 正面 将主动脉置于载玻片的封片介质上，内皮面朝下。不要来回移动主动脉。</li>
	<li>用盖玻片覆盖载玻片，并用指甲油密封。</li>
	<li>避光干燥后，数小时内直接用于成像，或于-20 °C保存数天后使用。</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜检测荧光信号。打开仪器，并优化成像参数，如放大倍数、扫描速度、分辨率和Z轴步进。
	<ol>
		<li>本方案中，使用200 Hz的扫描速度、分辨率为1,024 × 1,024像素，Z轴步进为0.25 µm。使用488 nm氩激光激发DAF-2DA的荧光，并在515 nm处检测信号；使用514 nm激光激发DHE的荧光，并在605 nm发射波长处检测信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>先用10倍物镜对样品进行聚焦，直至在紫外光下观察到清晰的DAPI信号，然后将物镜调整至40倍放大。</li>
	<li>通过调节控制面板上的Z轴位置，确定内皮层的范围。DAPI染色的细胞核在内皮层中呈现为椭圆形或圆形的点状信号。</li>
	<li>从样品顶部（管腔边界处的内皮层）开始，贯穿整个内皮信号的厚度进行扫描并记录图像。每个样品至少选择3个不同的视野进行扫描。</li>
</ol>
6. 图像分析
<ol>
	<li>使用软件打开共聚焦显微镜扫描的数据。每视野选择三张连续图像进行分析，每个样本至少分析三个不同的视野。导出所选图像并保存为 JPEG 文件。</li>
	<li>使用图像处理软件对 DAF-2DA、DHE 和 DAPI 染色的图像进行定量分析。对于 DAPI 染色图像，选择“Plugins”→“Analyze”→“Cell Counter”来计数 DAPI 阳性细胞核的数量。
	<ol>
		<li>对于 DAF-2DA 和 DHE 染色的图像，选择“Analyze”→“Measure”分析信号强度，并以“Mean”值作为相对信号强度。结果以 DAF-2DA 与 DAPI 阳性细胞核的比值或 DHE 与 DAPI 的比值表示。对每个样本，取每张图像和每个视野的平均值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个样本的结果除以对照组的平均值，得到倍数变化。统计分析采用非配对 Student t 检验或 ANOVA 结合 Dunnett 或 Bonferroni 事后检验。数据以均值±标准误（mean±SEM）表示。当 p&#60;0.05 时，认为均值差异具有统计学显著性14。</li>
</ol>

<ol><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase%3A+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149(2013).</li>
<li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthases%3A+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+endothelial+dysfunction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis.</a> Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).</li>
<li>Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+endothelial+dysfunction+by+modulating+NOS+uncoupling%3A+new+insights+into+its+pathogenesis+and+therapeutic+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).</li>
<li>Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nitrate%2C+nitrite%2C+and+%5B15N%5Dnitrate+in+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids.</a> Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).</li>
<li>Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+nitric+oxide+from+L-arginine+in+the+central+nervous+system%3A+a+transduction+mechanism+for+stimulation+of+the+soluble+guanylate+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).</li>
<li>Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+bioassay+method+for+detection+of+EDRF+with+RFL-6+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).</li>
<li>Guo, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+C-type+natriuretic+peptide+on+spontaneous+contraction+in+gastric+antral+circular+smooth+muscle+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat.</a> Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).</li>
<li>Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cells+synthesize+nitric+oxide+from+L-arginine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine.</a> Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).</li>
<li>Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+L-arginine+and+its+significance+for+the+biosynthesis+of+endothelium-derived+relaxing+factor%3A+cultured+endothelial+cells+recycle+L-citrulline+to+L-arginine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).</li>
<li>Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nitric+oxide+production+from+a+perfused+organ+by+a+luminol-H2O2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system.</a> Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).</li>
<li>Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+nitric+oxide+generation+in+the+ischemic+heart+using+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).</li>
<li>Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurement+using+electrochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurement using electrochemical methods.</a> Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).</li>
<li>Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+mitogen-activated+protein+kinase+is+involved+in+arginase-II-mediated+eNOS-Uncoupling+in+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity.</a> Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113(2014).</li>
<li>Nakatsubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+nitric+oxide+production+from+bovine+aortic+endothelial+cells+using+new+fluorescence+indicators%3A+diaminofluoresceins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins.</a> FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).</li>
<li>Hink, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+endothelial+dysfunction+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus.</a> Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).</li>
<li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glutaredoxin+in+human+coronary+arteries%3A+its+potential+role+in+antioxidant+protection+against+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).</li>
<li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+red+blood+cells+at+work%3A+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li>
<li>Nunez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+between+nitroglycerin+and+NO-releasing+drugs+on+mitochondrial+oxygen+consumption%2C+vasoactivity%2C+and+the+release+of+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO.</a> Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus%3A+role+of+NAD%28P%29H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li>
<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling%3A+the+molecular+interface+connecting+metabolic+stress%2C+aging+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases.</a> Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).</li>
<li>Yepuri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+crosstalk+between+arginase-II+and+S6K1+in+vascular+endothelial+inflammation+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging.</a> Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).</li>
<li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox1+is+involved+in+angiotensin+II-mediated+hypertension%3A+a+study+in+Nox1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice.</a> Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

一氧化氮或氧气的检测2.− 使用荧光染料的方法在培养的内皮细胞以及组织冰冻切片的多项研究中经常被采用23在此，我们将该方法拓展应用于完整且存活的血管组织， 即, 正面 一氧化氮与氧气的检测2.− 分别使用 DAF-2DA 和 DHE 检测内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子水平，该方法有效、相对简便且直观。与血管冷冻切片法相比，该方法背景信号更低，定量性更佳，因为动脉中膜（尤其是主动脉冷冻切片）中的弹性纤维会产生强烈的自发荧光信号，可能干扰特异性的 NO 或 O₂⁻ 检测。2.− 内皮细胞中产生的信号。此外，特定的O2.− 由血管中膜平滑肌细胞中的NADPH氧化酶或其他酶产生的活性氧可能干扰血管节段内皮细胞中的信号，这是使用血管冷冻切片方法的一个缺点。相比之下， 正面 染色方法可特异性检测完整血管节段内皮层的信号，因而可提供更精确的分析。用于制备冷冻切片的恒冷切片机也是一笔昂贵的投入。与其他生物...

血管内皮细胞通过释放血管活性因子维持血管的功能和结构完整性1在这些因素中，由L-精氨酸通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在内皮细胞中生成的一氧化氮（NO），是心血管生理学中最为重要且研究最为清楚的因素。2一氧化氮（NO）可引起平滑肌松弛，抑制细胞增殖，抑制血小板聚集以及炎症细胞向内皮下区域的黏附和浸润，从而预防血管疾病的发生。3在多种生理和病理条件下，包括衰老、高血压、糖尿病、高脂血症， 等等。，以内皮功能障碍为特征，表现为一氧化氮（NO）生物利用度降低和超氧阴离子（O₂⁻）生成增加2.- 存在并促进动脉粥样硬化的发病机制2近年来的研究表明，eNOS解偶联是内皮功能障碍的重要机制，其中eNOS酶生成O2.- 而非NO，在上述各种条件下1,4因此，内皮功能的分析，特别是内皮一氧化氮（NO）的生成和O2.- 生成对于心血管疾病及其并发症的实验研究至关重要。
已开发出多种方法学手段用于分析和测定生物样本中的一氧化氮（NO）生成。由于NO化学性质极不稳定，极易被氧化为亚硝酸根（NO2-）和硝酸根（NO3-），其半衰期仅为3至6秒，因此直接检测NO非常困难。因此，通常通过测定液体样本中NO2-/NO3-的含量作为细胞或组织释放NO的指标5。尽管该方法操作相对简便，但易受溶液中原本存在的稳定态NO2-/NO3-背景值较高的干扰。由于NO可激活可溶性鸟苷酸环化酶，促进环磷酸鸟苷（cGMP）的生成6，因此也常通过测定细胞内cGMP水平来间接评估NO的释放7。然而，这种方法同样是间接估算，且特异性较差，因为某些内皮源性因子（如C型利钠肽，CNP）也可通过激活颗粒型鸟苷酸环化酶来升高cGMP水平8。NO由L-精氨酸生成，同时产生L-瓜氨酸作为副产物9，因此测定L-瓜氨酸的生成量也被用作间接评估NO生成的方法之一。该方法的主要缺点在于其具有放射性，且无法反映生物活性NO的实际水平，因为释放出的NO可能迅速被超氧阴离子（O2.−）灭活；此外，L-瓜氨酸还可被重新转化为L-精氨酸10。其他化学检测方法，如化学发光法11、电子自旋共振法12或电化学卟啉类NO传感器13，也被部分研究者所采用。这些方法通常操作复杂，检测过程繁琐，并需要特殊仪器设备。还需指出的是，许多研究采用离体血管灌流实验（organ bath实验），利用带有或不带内皮的离体血管来评估内皮功能，并间接测量内皮源性NO介导的血管舒张反应。然而，尽管该方法在生理相关性上较为接近真实情况，但严格来说并不直接测定NO的功能，而是总体评估由内皮介导的血管舒缩反应，其结果反映了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）功能、其他内皮源性舒张因子与收缩因子的生成、超氧阴离子（O2.−）的产生以及平滑肌细胞对这些因子反应性的综合效应。因此，通常仍需对eNOS功能或NO生成进行特异性分析3。
近年来，包括我们研究组在内的许多科研团队均采用荧光染料法检测细胞内一氧化氮的生成14-19. 在该方法中，采用细胞可渗透的荧光指示剂二氨基荧光素-2 二乙酸盐（DAF-2DA）来检测活细胞和组织中的游离一氧化氮及一氧化氮合酶功能 体外 或 离体其原理是：在活细胞内，DAF-2DA 被细胞内酯酶去乙酰化生成无荧光的 4,5-二氨基荧光素（DAF-2），后者再与一氧化氮（NO）反应生成具有荧光的 DAF-2 三唑（DAF-2T）。DAF-2T 的荧光可在荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜下观察。 14因此，细胞内荧光强度反映了细胞或完整血管内皮中的细胞内一氧化氮（NO）生成水平。结合使用特定荧光染料如二氢乙啶（DHE），可同时评估细胞内NO和O₂⁻水平。2.− 细胞或血管中的生成14同样，DHE 也是一种可渗透细胞的化合物，可被 O2.− 细胞内，其氧化产物随后与核酸嵌插结合，发出明亮的红色荧光，可通过荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜进行定量检测。DHE 是一种用于检测 O₂⁻ 的高度特异性染料2.− 从生物样本中检测超氧阴离子自由基时具有优势，因其几乎专一性地检测超氧阴离子自由基，细胞保留效果良好，甚至可耐受轻度固定处理20该荧光染料方法的优点之一在于能够检测并可视化一氧化氮（NO）和/或超氧阴离子（O₂⁻）2.− 正面 直接作用于活体血管的完整内皮层。
本文中，我们描述了一种用于检测一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O2.−）的荧光染料方法，该方法已被我们改进，适用于高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠模型完整主动脉中NO和O2.−的内皮面（en face）检测。我们证明，该方法能够成功且可靠地测量肥胖状态下新鲜分离的小鼠完整主动脉内皮层中的NO和O2.−水平，并评估内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的功能状态（正常或功能障碍）。

<table><tbody><tr><td>二氢乙啶（DHE）</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>用DMSO溶解至5&amp;nbsp;mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>二乙酸二氨基荧光素-2（DAF-2DA）</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>用DMSO溶解至5&amp;nbsp;mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>用水溶解至300&amp;nbsp;&amp;micro;mol/L作为1,000倍储存液，储存于4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Vector labor. (reactolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&amp;#969;&lt;/sub&gt;-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>多通道肌张力测定系统&amp;nbsp;</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DM6000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>Image J&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术剪&amp;nbsp;</td><td>S&amp;T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>显微外科剪&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>S&amp;T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片，直径15&amp;nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>1 ml吸头</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;l吸头</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf安全锁扣管，1.5 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>乙酰胆碱氯化物</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的内皮源性一氧化氮（NO）是心血管生理中最重要的血管保护分子之一。eNOS功能障碍（如eNOS解偶联）会导致NO生物利用度下降以及超氧阴离子（O₂⁻）生成增加。2.−）的生成，进而促进心血管疾病的发生。因此，对NO和O₂⁻进行适当的检测至关重要。2.− 内皮细胞中的一氧化氮（NO）和氧自由基水平对心血管疾病及其并发症的研究至关重要。由于NO和O2.−，很难测量NO和O2.− 直接进入血管。目前已开发出多种方法用于检测NO和O2.− 生产。然而，该方法要么灵敏度低，要么缺乏特异性，要么技术要求高且需要特殊设备。本文中，我们介绍了一种对荧光染料法的改进方案，用于 正面 同时检测与可视化细胞内一氧化氮和氧2.− 使用细胞膜通透性探针二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢溴化乙啶（DHE），分别检测高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型完整主动脉中的细胞内一氧化氮和超氧阴离子水平。我们证实了细胞内一氧化氮减少，同时超氧阴离子增加2.− 与对照组瘦鼠相比，肥胖小鼠新鲜分离的完整主动脉中NO和O₂⁻水平的变化。我们证明，该方法是一种简便的技术，可用于直接检测和可视化NO与O₂⁻2.− 在完整的血管中进行研究，并可广泛应用于各种（生理）病理条件下内皮功能（失调）的探究。

肥胖是缺血性冠心病的重要危险因素，且与内皮一氧化氮（NO）生物利用度降低相关，后者是动脉粥样硬化性血管疾病的标志性特征21。已有研究表明，eNOS 去偶联是在多种生理和病理条件下导致内皮功能障碍的重要机制，这些条件包括衰老22、动脉粥样硬化和肥胖14。因此，本研究通过比较瘦型与肥胖小鼠，展示其主动脉中 NO 和 O2.− 水平的代表性结果。
从7周龄开始，雄性小鼠（C57BL/6J）分别自由摄取正常饲料（NC；能量组成：10.6%脂肪、27.6%蛋白质、57%碳水化合物，纤维4.8%）或高脂饮食（HFD，能量组成：55%脂肪、21%蛋白质、24%碳水化合物），持续14周。HFD喂养14周后，处死小鼠并分离胸主动脉，清除附着组织。在进行DAF-2DA和DHE染色前，向孵育 chamber 中加入eNOS抑制剂L-NG-硝基精...

本文介绍了一种改良的相对简便的方法，利用荧光染料二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE），对肥胖小鼠模型新鲜分离的完整主动脉进行内皮表面（en face）同时检测和可视化细胞内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O2.−）。

En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的内皮源性一氧化氮（NO）是心血管系统中最重要的血管保护分子之一……

本实验的主要目标是利用荧光染料 DAF-2DA 和 DHE，在 freshly isolated intact mouse aortas 中同时检测细胞内一氧化氮和超氧阴离子。该方法有助于实验室研究人员在心血管生理学领域（如内皮功能障碍和eNOS去耦联）的案例研究。该技术的主要优势在于，能够在离体条件下对完整血管中的一氧化氮和超氧阴离子进行简单、精确的直接检测与同步可视化。本方案中，构建一个可加热至 37°C 并由二氧化碳气罐提供 95% 氧气和 5% 二氧化碳气体进行通气的器官浴系统。首先，配制足量新鲜的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液，用于浸泡目标组织。例如，一次实验中主动脉需要 200 毫升缓冲液。打开器官浴槽系统，并将温度调节至37摄氏度。用克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液冲洗浴槽后，向每个浴槽中加入5毫升克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液，并打开气体，用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气30分钟。保持浴槽加盖。同时，准备一瓶冰冻的含通气装置的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液。取出胸主动脉后，立即将整个组织浸入盛有冰冻克雷布斯-林格缓冲液的培养皿中。在解剖显微镜下，去除心脏和主动脉弓，同时保持胸主动脉节段处于缓冲液中。然后，使用手术剪和镊子将主动脉从附着的血管周围组织中分离出来。接着，用镊子夹住组织边缘，利用注射器注入冰冻的 Krebs-Ringer 缓冲液，轻轻冲洗血管腔内的血液。必须彻底冲洗掉血管腔内的血凝块，因为它们可能产生人为信号，干扰荧光信号；同时，冲洗力度应加以控制，以免损伤内皮层。现在，将清洗后的主动脉环切成三毫米长的节段。在准备好清洗后的主动脉环后，对其进行染色。用镊子仅夹住主动脉环的外膜侧，避免夹紧血管，将清洗后的主动脉节段转移至已准备好的器官浴槽中。将动脉在缓冲液中平衡30分钟。半小时后，向器官浴槽中加入乙酰胆碱，使其终浓度为1微摩尔，并与动脉共同孵育10分钟。同时，在1.5毫升微量离心管中，用预热的Krebs缓冲液配制1毫升染色工作液。然后用锡箔纸包裹试管，以减少光照，并在37摄氏度下孵育。乙酰胆碱刺激后，将主动脉环从器官浴槽转移至染色液试管中，在避光且通气的条件下孵育30分钟。自此步骤之后的所有操作均应尽量避免光照。接下来，将主动脉环转移至盛有克雷布斯缓冲液的新管中，孵育1分钟。重复此洗涤步骤共三次。然后，在室温下用4%多聚甲醛溶液固定主动脉环30分钟。固定步骤完成后，将血管环转移至 DAPI 溶液中，在室温下染色三分钟以进行复染。随后用 PBS 洗涤主动脉血管环三次，每次洗涤一分钟。操作过程中移动血管环时，须始终注意其内皮组织的脆弱性。在显微镜下，将载玻片上的主动脉环用显微外科剪刀沿纵轴剪开。然后，在保持主动脉湿润的同时，去除多余的液体。使用两把显微外科镊子将卷曲的主动脉展平，使其内皮面朝下紧贴载玻片表面。在此过程中，切勿来回

en-face-detection-nitric-oxide-superoxide-endothelial-layer-intact

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一氧化氮和超氧化物歧化酶恩的人脸检测在完整的动脉内皮细胞层

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)2 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物...

使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基

关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

一氧化氮（NO）的内源性生成调控着多种生物学功能。越来越多的研究表明，基于NO的信号传导发生中断或失调与许多人类疾病相关。定量检测相关NO代谢物的方法可能为人类疾病提供新的诊断或预后生物标志物。...

用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

血管细胞功能依赖于细胞内信使的活性。本文描述了一种 离体 一种双光子成像方法，可用于检测离体主动脉中单个内皮细胞和血管平滑肌细胞在生理及药理刺激下细胞内钙离子和一氧化氮水平的变化。...

离体大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中细胞内Ca2+调控与一氧化氮生成的双光子成像

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。...

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

本文描述了一种制备小鼠颈动脉和主动脉内皮面标本的方法。此类标本经特异性抗体免疫荧光染色后，可通过共聚焦显微镜观察整个血管壁内蛋白质的定位以及细胞类型的鉴定。...

En Face 小鼠血管制备

本手稿介绍了利用新型基因编码的一氧化氮（NO•）探针（geNOps）结合荧光显微镜实时监测单细胞内NO•动态变化的实验方案。通过将geNOps与化学钙离子（Ca2+）传感器结合，实现了对单个内皮细胞水平上由Ca2+触发的NO•生成过程的可视化观测。...

应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。...

利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。...

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

超氧阴离子的生成对于血小板的活化至关重要，若调控失常，则在血栓性疾病中具有关键作用。本文介绍了三种选择性检测超氧阴离子及研究氧化还原依赖性血小板调控的方法。...

血小板中超氧阴离子生成的替代检测方法

核小体ELISA（NU-ELISA）是一种灵敏且定量的方法，用于检测天然完整核小体制备物中翻译后修饰的全局模式。这些修饰包括组蛋白特定氨基酸残基上的甲基化、乙酰化和磷酸化，因此NU-ELISA可提供一种全局蛋白质组学检测手段，用于分析特定细胞类型的总体染色质修饰状态。...

通过ELISA检测天然完整核小体上的翻译后修饰

学习使用DAF-2DA和DHE荧光染料在小鼠完整主动脉中同时检测一氧化氮和超氧化物阴离子的方法。该技术可用于研究内皮功能障碍和eNOS解偶联等心血管生理学问题。

En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

探索更多视频