En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

本实验的总体目标是利用荧光染料 DAF-2DA 和 DHE，在 freshly isolated intact mouse aortas（新鲜分离的完整小鼠主动脉）中同时检测细胞内一氧化氮和超氧阴离子。该方法可协助实验室研究人员在心血管生理学领域（如内皮功能障碍和eNOS解偶联）开展相关研究。该技术的主要优势在于，能够在离体条件下对完整血管中的一氧化氮和超氧阴离子进行简单、精确的直接检测与同步可视化。

本实验方案中，构建一个可加热至 37 摄氏度并用来自二氧化碳气罐的 95% 氧气和 5% 二氧化碳混合气体进行通气的器官浴系统。首先，配制足量的新鲜克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液，用于浸泡目标组织。例如，一次实验中主动脉需要 200 毫升缓冲液。

开启器官浴槽系统，并将温度调节至37摄氏度。用克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液清洗浴槽后，向每个浴槽中加入5毫升克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液，并打开气体供应，用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气30分钟。保持浴槽加盖。

同时，准备一瓶经通气的冰冻克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液。切除胸主动脉后，立即将整个组织浸入盛有冰冻克雷布斯-林格缓冲液的培养皿中。在解剖显微镜下，去除心脏和主动脉弓，同时保持胸主动脉节段处于缓冲液中。

然后，使用手术剪和镊子将主动脉从附着的血管周围组织中分离出来。接着，用镊子夹住组织边缘，利用注射器注入冰冻的 Krebs-Ringer 缓冲液，轻轻冲洗血管腔内的血液。必须彻底冲洗掉血管腔内的血凝块，因为它们可能产生人为信号，干扰荧光信号；但同时应控制冲洗力度，避免损伤内皮层。

现在，将清洗后的主动脉环切成三毫米长的节段。准备好清洗后的主动脉环后，对其进行染色。用镊子仅夹住主动脉环的外膜侧，避免夹紧血管，将清洗后的主动脉节段转移至已准备好的器官浴槽中。

将动脉在缓冲液中平衡30分钟。半小时后，向器官浴槽中加入乙酰胆碱，使其终浓度为1微摩尔，并在乙酰胆碱中孵育动脉10分钟。同时，在1.5毫升微量离心管中，用预热的克列布斯缓冲液配制1毫升染色液。

然后用锡箔纸包裹试管，以尽量减少光照，并将其置于 37 °C 环境中。乙酰胆碱刺激后，将主动脉环从器官浴槽转移至染色液试管中，在避光且通气的条件下孵育 30 分钟。自此步骤之后的所有操作均应尽量避免光照。

接下来，将主动脉环转移至盛有 Krebs 缓冲液的新离心管中，孵育 1 分钟。此洗涤步骤重复进行三次。然后，在室温下用 4% 多聚甲醛溶液固定主动脉环 30 分钟。

固定步骤完成后，将环状组织转移至DAPI溶液中，在室温下孵育三分钟以进行复染。随后，用PBS洗涤主动脉环三次，每次一分钟。在移动环状组织时，务必注意内皮组织的脆弱性。

在显微镜下，将主动脉环置于载玻片上，用显微外科剪刀沿纵轴剪开。然后，在保持主动脉湿润的同时，去除其表面多余的液体。使用两把显微外科镊子将卷曲的主动脉展平，使其内皮面朝下紧贴载玻片表面。

在此过程中，不要来回移动主动脉。此步骤非常关键，但操作难度较大，建议在正式实验前充分练习。

然后，将封片剂滴加到主动脉上。盖上盖玻片，并用指甲油封固。在避光条件下空气干燥后，使用共聚焦显微镜对切片进行成像。

使用200赫兹的扫描速度、1024 × 1024像素的分辨率以及0.25微米的z轴步进厚度。观察DAF-2DA时，使用氩离子激光器，激发荧光设为488纳米，发射光检测设为515纳米。观察DHE时，激发荧光设为514纳米，检测波长设为605纳米。

在使用10倍物镜聚焦后，将物镜调整至40倍放大倍数。接着，以DAPI染色的细胞核作为解剖标志，通过调节控制面板上的z轴位置，确定内皮层的范围。随后，从管腔边界处的内皮层开始，扫描穿过整个内皮层的厚度，并记录图像。

对每个样本至少扫描三个不同的视野。通过给予高脂饮食喂养14周，使年轻的C57黑6小鼠变得肥胖。对照组则喂食正常饲料。

14 周后，检测了它们的胸主动脉。染色前，组织在 1 纳摩尔的 eNOS 抑制剂 L-NAME 中孵育一小时。绿色显示的 DAF-2T 信号是由一氧化氮将无荧光的 DAF-2 转化而来。

因此，染色表明细胞中存在一氧化氮。类似地，当二氢乙啶（DHE）被超氧阴离子氧化时，会发出红色荧光信号。因此，红色越明显的样本，其细胞内的超氧阴离子含量越高。

对共聚焦荧光图像进行定量分析显示，饲喂高脂饮食的小鼠主动脉内皮层中一氧化氮生成减少，而L-NAME敏感性超氧阴离子生成增加。这些数据支持肥胖可导致eNOS解偶联的观点。观看本视频后，您应能够充分理解如何检测一氧化氮和超氧阴离子，以及如何在完整血管中使用荧光染料。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在六小时内完成。在进行该操作过程中，重要的是始终注意保持内皮层在整个操作过程中的完整性，并且在固定步骤之前，务必始终将血管浸没于克雷布斯-林格缓冲液中，以维持内皮细胞的活性。

结合该操作流程，还可进行其他检测，例如分析血管的血管运动反应，以回答更多问题，如内皮细胞在调节血管张力中的生理功能。