Name: 高分辨率法监测IRF3的磷酸化依赖性激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 了解高分辨率SDS-PAGE和Native-PAGE结合磷酸化特异性抗体免疫印迹技术，用于分析IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活。该方法可区分不同激活形式的IRF3，为研究病毒感染和先天免疫应答提供经济灵敏的工具。

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作者感谢实验室以往和现任成员对实验方案的开发工作。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）[资助号 MOP-130527] 和加拿大自然科学与工程研究理事会 [NSERC-355306-2012] 的资金支持。NG 获得了加拿大研究主席计划（Tier II）的资助。AR 获得了魁北克卫生研究基金会（FRQS）呼吸健康研究网络培训项目的研究生奖学金。

注意：本实验方案以感染仙台病毒（SeV）的 A549 细胞为例进行描述。然而，截至目前测试的所有人类和小鼠细胞类型（尤其是经多种可激活 IRF3 的刺激物处理的髓系细胞）均适用该 SDS-PAGE 和天然 PAGE 实验方案9,15,19,24,25。
1. A549 细胞的感染
<ol>
	<li>在含有20 ml添加10%热灭活胎牛血清（HI-FBS）和1% L-谷氨酰胺的完全F12K/Ham培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，在15 cm培养皿中培养A549细胞。 
	注意：所有用于细胞培养和处理的溶液必须无菌。</li>
	<li>感染前24小时，吸除培养基，并在室温下用10 ml蒸馏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>向每块培养皿中加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖细胞，于37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>一旦细胞开始从培养皿脱离，立即停止孵育，方法是用手轻轻敲击培养皿。每皿加入10 ml预热的完全F12K/Ham培养基以终止胰蛋白酶作用，并将细胞转移至15 ml锥形管中。</li>
	<li>在室温下以350 × g离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于8 ml完全F12K/Ham培养基中，获得均一的单细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每60 mm培养皿4 ml预热的完全F12K/Ham培养基接种1 × 106个细胞的密度接种细胞。于37 °C、5% CO2条件下孵育20–24小时。20–24小时后，细胞形成约90%汇合的单层（相当于1.5 × 106个细胞）。</li>
	<li>吸除培养基，并用2 ml无血清F12K/Ham培养基（SFM）洗涤细胞。每60 mm培养皿加入2 ml新鲜SFM。</li>
	<li>将一份储存于-80 °C的仙台病毒（SeV）分装样品置于冰上解冻，并短暂涡旋混匀。</li>
	<li>用预热的SFM稀释病毒，使浓度为60 HAU/100 µl。通过轻柔吹打混匀，每皿加入100 µl稀释后的病毒，使感染剂量为40 HAU/106个细胞。非感染对照组培养皿中不加病毒。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。在感染开始的第一个小时内，手动轻摇培养皿3至4次，或使用置于培养箱内的自动轨道摇床或往复式摇床进行振荡。</li>
	<li>感染后2小时，加入2 ml含20% HI-FBS的F12K/Ham培养基，使最终HI-FBS浓度为10%。</li>
	<li>继续在37 °C、5% CO2培养箱中孵育细胞，分别额外孵育1、4和7小时，使总感染时间分别达到3、6和9小时。在每个时间点，进行步骤2.1的操作。</li>
</ol>
2. 全细胞提取物（WCE）的制备
<ol>
	<li>移除感染培养基。用 1 ml 冰冷的 D-PBS 刮取细胞，将细胞悬液转移至预冷的 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 20 秒，使细胞沉淀，小心弃去所有残留的 D-PBS。 
	注意：此步骤中，细胞沉淀可直接用于蛋白提取，或在液氮或干冰/乙醇浴中快速冷冻后于 -80 °C 保存，直至裂解。</li>
	<li>配制裂解缓冲液：在去离子水（ddH2O）中加入 50 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、10% 甘油和 1% Nonidet P-40。临用前加入蛋白酶抑制剂（1 µg/ml 亮抑蛋白酶肽和 2 µg/ml 抑肽酶）及磷酸酶抑制剂（5 mM 氟化钠、1 mM 活化正钒酸钠、2 mM 对硝基苯磷酸盐和 10 mM β-甘油磷酸钠，pH 7.5）。 
	注意：不含抑制剂的裂解缓冲液可在 4 °C 保存。正钒酸钠的活化具体步骤见“特定试剂/设备”表格。</li>
	<li>用 70 µl 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。通常裂解液的蛋白浓度约为 2 µg/µl。</li>
	<li>冰上孵育 20 分钟。将裂解液置于液氮中孵育 15 秒进行快速冷冻，然后在室温下解冻至完全融化，涡旋振荡 10 秒。重复冻融-涡旋循环 3 次。
	<ol>
		<li>或者，可在乙醇/干冰浴中冷冻 1 分钟完成冷冻步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 20 分钟。将上清液（即全细胞裂解液，WCE）转移至新的预冷 1.5 ml 离心管中。全程保持 WCE 处于冰上。</li>
	<li>使用与裂解缓冲液兼容的任何蛋白定量方法（如 Bradford 法蛋白定量法26）对蛋白进行定量。</li>
</ol>
3. 通过高分辨率 SDS-PAGE 分离 WCE
<ol>
	<li>制备三块变性电泳凝胶。
	<ol>
		<li>为检测IRF3的不同形式，制备两块长度至少为16 cm的凝胶，分离胶成分为7.5%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5:1）、375 mM Tris-HCl pH 8.8（室温）、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、1%过硫酸铵和0.1% TEMED，溶于ddH2O中；浓缩胶成分为4%丙烯酰胺、62.5 mM Tris-HCl pH 6.8（室温）、0.05% SDS、1%过硫酸铵和0.1% TEMED，溶于ddH2O中。 
		注意！丙烯酰胺、TEMED和SDS具有毒性或刺激性。操作时需佩戴防护手套，并在通风橱中进行。</li>
		<li>为检测SeV蛋白，制备一块长度至少为8.5 cm的凝胶，其组成与步骤3.1.1中所述凝胶相似，但分离胶含12%丙烯酰胺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入1:4（v/v）的5×上样缓冲液（含125 mM Tris-HCl pH 6.8（室温）、10% SDS、20%（p/v）甘油、0.0005%溴酚蓝和25% β-巯基乙醇的ddH2O溶液），将步骤2.6中获得的全细胞提取物（WCE）变性，随后在100 °C加热10分钟。短暂离心以收集管盖内形成的冷凝液。 
	注意！β-巯基乙醇吸入后有毒。操作时需佩戴防护手套，并在通风橱中进行。</li>
	<li>将凝胶安装至电泳装置中。上下槽加入电泳缓冲液，缓冲液成分为25 mM Tris碱、0.1% SDS和192 mM甘氨酸，溶于蒸馏水（dH2O）中。</li>
	<li>在每块16 cm凝胶的一个加样孔中加入14 µl分子量标准品，在8.5 cm凝胶的一个加样孔中加入7 µl分子量标准品。在步骤3.1.1制备的两块凝胶的每个加样孔中加入30 µg变性WCE（按步骤3.2所述方法制备），用于检测IRF3的不同形式。在步骤3.1.2制备的凝胶的每个加样孔中加入8–10 µg变性WCE（按步骤3.2所述方法制备），用于SeV蛋白分析。</li>
	<li>以30 mA恒定电流进行电泳，直至前沿迁移至凝胶底部。 
	注：16 cm凝胶的电泳时间通常约为3小时，8.5 cm凝胶约为45分钟。</li>
	<li>继续进行转膜至硝酸纤维素膜（步骤5）。</li>
</ol>
4. 通过非变性PAGE分析IRF3二聚化
注意：此方法最初由藤田 T. 博士的研究团队描述27。
<ol>
	<li>配制上层（-）和下层（+）电泳缓冲液。上层缓冲液包含 25 mM Tris-HCl pH 8.4（室温）、192 mM 甘氨酸和 1% 脱氧胆酸钠（DOC），溶于 ddH2O 中。下层缓冲液包含 25 mM Tris-HCl pH 8.4（室温）和 192 mM 甘氨酸，溶于 ddH2O 中。 
	注意：上层和下层电泳缓冲液可于 4 °C 保存至使用前。但使用前必须预热至室温。</li>
	<li>倒入至少 8.5 cm 长的非变性分离胶，其中包含 7.5% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5:1）、375 mM Tris-HCl pH 8.8（室温）、1% 过硫酸铵和 0.1% TEMED，溶于 ddH2O 中。</li>
	<li>在冰浴中以 40 mA 恒定电流预电泳 30 分钟。将电泳装置压入冰中，高度约与下层电泳缓冲液齐平。注意凝胶本身不应接触冰。</li>
	<li>预电泳期间，将冰上保存的 WCE 与 2× 非变性 PAGE 上样缓冲液按 1:1（v/v）混合，上样缓冲液包含 125 mM Tris-HCl pH 6.8（室温）、30% 甘油和 0.1% 溴酚蓝，溶于 ddH2O 中。</li>
	<li>预电泳结束后，立即上样 8 – 10 µg WCE（按步骤 4.4 所述方法制备）。</li>
	<li>在冰浴中以 25 mA 恒定电流进行电泳，方法同上述预电泳步骤，直至前沿迁移至凝胶底部（约 40 分钟）。</li>
</ol>
5. IRF3 蛋白的免疫印迹分析
<ol>
	<li>配制转膜缓冲液，其中含有 25 mM Tris-Base 和 192 mM 甘氨酸，溶于 ddH2O 中。使用前将转膜缓冲液在 4 °C 冰箱中预冷。</li>
	<li>在盛有转膜缓冲液的塑料或玻璃容器中，将三张硝酸纤维素膜（尺寸略大于凝胶）浸湿。通过剪去膜的一角来标记其方向。转膜缓冲液可重复使用 3 次。每次使用之间应于 4 °C 保存。</li>
	<li>脱去凝胶（SDS-PAGE 和 native-PAGE）并剪去每个凝胶的一角以标记正确方向。
	<ol>
		<li>对于 native-PAGE 凝胶，在转膜前，将其在 SDS-PAGE 电泳缓冲液中室温下轻轻振荡孵育至少 30 分钟，以去除脱氧胆酸（DOC）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将凝胶（SDS-PAGE 和 native-PAGE）在转膜缓冲液中孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>每块凝胶组装一个转膜“三明治”结构，放入转膜夹中，确保膜朝向正极（顺序为：海绵垫/滤纸/膜/凝胶/滤纸/海绵垫）。注意仔细排除各层之间的所有气泡。</li>
	<li>根据所用转膜装置制造商的建议进行转膜操作。 
	注意：后续所有孵育和洗涤步骤均应在摇床或轨道振荡器上进行。</li>
	<li>转膜结束后，将膜在固定液（含 7% 乙酸、40% 乙醇和 3% 甘油的 ddH2O 溶液）中孵育 15 分钟。随后用 PBS（含 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10.2 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4 的 dH2O 溶液）洗涤 3 次，每次 5 分钟。 
	警告！乙酸具有毒性、刺激性和易燃性。操作时需佩戴防护手套，并在通风橱中进行。 
	注意：固定液可多次重复使用。</li>
	<li>对于 native-PAGE 膜，直接进入步骤 5.11。</li>
	<li>将三张 SDS-PAGE 膜在 dH2O 中快速漂洗，然后在红染料ponceau溶液（含 6.57 mM 红染料ponceau 和 1% 乙酸的 ddH2O 溶液）中孵育 1 分钟。 
	注意：红染料ponceau 溶液可重复使用多次。</li>
	<li>用 dH2O 漂洗膜，直至背景呈白色，能够清晰看到被染成红色的蛋白条带。用铅笔标记蛋白 Marker，并裁去蛋白区域周围的多余膜。在 PBS 中振荡孵育 5 分钟以脱色。</li>
	<li>将膜在封闭液（含 0.05% Tween 20 和 5% 脱脂奶粉的 PBS 溶液，即 PBS-T-脱脂奶粉）中室温孵育 1 小时，或在 4 °C 过夜&#160;。随后用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 
	注意：PBS-T 洗涤为可选步骤，仅在下一步中使用以含 5% 牛血清白蛋白的 PBS-T（PBS-T-BSA）稀释的一抗时才必须进行（图 1 和表 1）。</li>
	<li>将四张膜（来自 SDS-PAGE 和 native-PAGE）按照 图 1 和表 1 中详细列出的顺序依次与一抗孵育。随后用 PBS-T 洗涤 5 次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> 
图1. 免疫印迹分析的流程示意图。 该示意图描述了用于检测不同IRF3磷酸化形式以及单体/二聚体形式所需的各个SDS-PAGE和天然PAGE凝胶。图中说明了每块凝胶经免疫印迹后，抗体在膜上的具体使用顺序。请注意，首先使用抗肌动蛋白（anti-actin）抗体，以确保在应用其他特异性抗体前各样品上样量相等。另一种顺序（即在抗磷酸化IRF3抗体之后再使用抗肌动蛋白抗体）同样有效。由于信号分子大小重叠，在使用抗肌动蛋白抗体与抗SeV抗体之间，或在抗磷酸化IRF3抗体与抗IRF3抗体之间需进行膜剥离（stripping）处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>一抗</td>
			<td>稀释比例</td>
			<td>稀释缓冲液</td>
			<td>孵育条件</td>
			<td>二抗</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗肌动蛋白抗体（Anti-Actin）</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>PBS-T-BSA</td>
			<td>室温孵育15分钟</td>
			<td>抗小鼠抗体</td>
			<td>SDS-PAGE后使用&#160; 
			若在含0.02%叠氮化钠的条件下于4 °C保存，稀释后的抗体可重复使用多次。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗IRF3-Ser386磷酸化抗体（Anti-IRF3-P-Ser386）</td>
			<td>1/200</td>
			<td>PBS-T-BSA</td>
			<td>4 °C过夜孵育</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>Native-PAGE后使用。&#160; 
			不建议重复使用稀释后的抗体&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗IRF3-Ser396磷酸化抗体（Anti-IRF3-P-Ser396）</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>PBS-T-BSA</td>
			<td>4 °C过夜孵育</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>SDS-PAGE后使用。&#160; 
			不建议重复使用稀释后的抗体。抗IRF3-P-Ser396抗体亦可由Cell Signaling公司提供。该抗体的最佳稀释比例为1/1,000，但不同批次间可能存在差异。&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗IRF3-Ser398磷酸化抗体（Anti-IRF3-P-Ser398）</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>PBS-T-BSA</td>
			<td>4 °C过夜孵育</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>SDS-PAGE后使用。&#160; 不建议重复使用稀释后的抗体&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>全长抗IRF3抗体（Anti-IRF3 full length）</td>
			<td>1/7,500</td>
			<td>PBS-T-脱脂奶粉</td>
			<td>室温孵育3小时</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>SDS-PAGE后使用。&#160;&#160; 全长抗IRF3抗体也可用于Native-PAGE，但检测单体的灵敏度较低。若在含0.02%叠氮化钠的条件下于4 °C保存，稀释后的抗体可重复使用多次。&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗IRF3核输出信号抗体（Anti-IRF3-NES）</td>
			<td>0.5&#160; μg/ml</td>
			<td>PBS-T-脱脂奶粉</td>
			<td>室温孵育3小时</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>Native-PAGE后使用。若在含0.02%叠氮化钠的条件下于4 °C保存，稀释后的抗体可重复使用多次。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗仙台病毒抗体（Anti-SeV）</td>
			<td>1/14,000</td>
			<td>PBS-T-BSA</td>
			<td>室温孵育3小时</td>
			<td>抗兔抗体</td>
			<td>SDS-PAGE后使用。若在含0.02%叠氮化钠的条件下于4 °C保存，稀释后的抗体可重复使用多次。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">注意：HRP标记的二抗所用的稀释比例和缓冲液需根据不同的生产厂家进行优化。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 免疫印迹实验中所用抗体的规格。
<ol start="13">
	<li>将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗共同孵育，具体操作如下： 图1与表1. 将膜清洗 5 次&#160;在 PBS-T 中孵育 5 分钟，随后用 PBS 清洗两次&#160;在 PBS 中浸泡 5 分钟，以彻底去除残留的 Tween。</li>
	<li>将膜置于足量增强化学发光试剂中孵育1分钟，确保试剂完全覆盖膜表面。使用滤纸吸干膜片。</li>
	<li>将膜置于化学发光成像分析仪中，以观察免疫反应条带。
	<ol>
		<li>或者，也可使用高灵敏度X射线胶片进行免疫反应条带的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。 
	注意：在此步骤中，膜可保持干燥状态。但若需进行进一步剥离，则最好在干燥膜之前完成剥离操作。膜也可在磷酸盐缓冲盐水中短期保存。</li>
	<li>对于无需在抗体孵育之间进行剥离处理的膜（参见 图 1) 则直接进行步骤 5.20。</li>
	<li>当需要在抗体之间进行剥离时（参见 图 1将膜置于预热的重剥离溶液中孵育，该溶液含 2% SDS、62.5 mM Tris-HCl pH 6.8（室温）和 0.7% &#946;-巯基乙醇于 ddH2氧原子 50 &#176;C 在常规振荡条件下处理 20 分钟。用 PBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。 
	注意：剥离过程中的振荡是关键步骤。剥离可在杂交炉中进行。或者，也可将膜密封于塑料袋中，浸入水浴进行剥离。在此情况下，孵育期间需将膜振荡4至5次。</li>
	<li>将膜在室温下孵育 1 小时或在 4°C 下孵育过夜。 4 &#176;C 于PBS-T-脱脂奶粉溶液中。</li>
	<li>根据 图 1.</li>
</ol>

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<li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+%28SOCS1%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).</li>
<li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li>
<li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+I%7Bkappa%7DB+Kinase+%28IKK%29-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1%2FIKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方案结合了高分辨率SDS-PAGE与天然PAGE，并联合使用多种磷酸化特异性抗体，以区分IRF3的单体/二聚体形式及其磷酸化修饰形式I-IV。在特定实验条件下，对这些IRF3形式的准确检测对于全面表征IRF3的活化状态至关重要。例如，LPS刺激活化的巨噬细胞可诱导形成二聚化的IRF3，其Ser396/398位点发生磷酸化，在SDS-PAGE中表现为低度磷酸化（形式II），但不表现为高度磷酸化（形式III和IV）的条带模式15。利用本方案，可将此模式与病毒感染诱导的高度磷酸化形式区分开来，后者除Ser386和Ser396磷酸化外，还需额外的Ser339磷酸化10。重要的是，该方法还可区分那些虽发生Ser396磷酸化但未形成二聚体、却仍具有转录活性的IRF3形式10。需要特别指出的是，IRF3磷酸化形式I-IV的分类模式适用于人源IRF3；小鼠IRF3不呈现类似的电泳迁移模式，因此其活化状态的鉴定仅能依赖于SDS-PAGE后免疫印迹中磷酸化特异性抗体的检测以及天然PAGE分析。
通过SDS-PAGE实现IRF3不...

干扰素调节因子3（IRF3）是一种普遍且组成型表达的转录因子，在抵御病原体的第一道防线中起关键作用，主要通过诱导干扰素β（IFNβ）的表达实现，同时也通过诱导趋化因子（C-C模体）配体5（CCL5）以及多种抗病毒蛋白（包括含四肽重复序列的干扰素诱导蛋白IFIT1/2/3）发挥作用1-3。已有研究报道，多种病毒感染，或暴露于聚胞苷酸-聚肌苷酸（poly I:C）或脂多糖（LPS）后，均可引发IRF3的活化4。重要的是，大多数已被研究的病毒已进化出逃逸IRF3介导免疫应答的机制，从而逃避宿主的天然免疫防御5。因此，监测IRF3的活化不仅对于理解宿主天然抗病毒防御的分子机制至关重要，也有助于揭示病毒对抗该免疫应答所采用的策略。
然而，许多已发表的研究仅对IRF3的激活进行了有限的分析，通常通过监测IRF3靶基因的诱导（IFNB1 和 IFIT1）和/或荧光素酶报告基因检测，并结合低分辨率的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对IRF3进行分析。然而，大量生化研究、对多种IRF3突变体行为的分析以及IRF3晶体结构的解析6-11已证实，IRF3会经历一系列复杂的、按顺序发生的翻译后磷酸化修饰，涉及多个位点。参与IRF3激活的磷酸化模式似乎依赖于刺激类型，且极有可能也依赖于细胞类型。在未感染的细胞中，IRF3以非磷酸化和低磷酸化形式共存，其中低磷酸化形式在N端1-198个氨基酸区域内含有磷酸化残基，包括Thr135和Ser1736,12-14。这种低磷酸化形式的IRF3可在应激诱导剂、生长因子和DNA损伤剂的作用下积累6。在病毒、聚肌胞苷酸（poly I:C）或脂多糖（LPS）刺激后，IRF3 C端转录激活域区域的丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化，该过程具有细胞类型依赖性15-17。IRF3 C端的磷酸化涉及不少于7个不同的磷酸受体位点，分为两个主要簇：Ser385/Ser386 和 Ser396/Ser398/Ser402/Thr404/Ser405，这些位点通过促进IRF3二聚化、核内聚集、与CREB结合蛋白（CBP）/p300共激活因子的结合、与干扰素敏感反应元件（ISRE）共识序列的DNA结合以及靶基因的转录激活，共同参与IRF3的激活过程9,10,17-19。Thr390的磷酸化也被认为有助于病毒诱导的IRF3激活20。对IRF3的质谱分析表明，Ser386、Thr390、Ser396和Ser402残基可直接被IκB激酶ε（IKKε）/TANK结合激酶1（TBK1）直接磷酸化9,10。 C端残基的磷酸化还介导了IRF3激活的终止过程，即通过多聚泛素化及蛋白酶体途径导致其降解10。该过程还依赖于Ser339的磷酸化，后者对于促脯氨酸异构酶Pin1的招募至关重要10,11。含有至少磷酸化Ser339/386/396残基的IRF3形式被视为高磷酸化形式。各个位点磷酸化的精确顺序及其功能目前仍存在争议10,21。目前明确的是，激活状态的IRF3并非均一状态，而是存在多种具有不同磷酸化或二聚化特征的激活形式10,22。
为了全面理解干扰素调节因子3（IRF3）在应对特定病原体时的激活机制，有必要明确哪些活化形式的IRF3被诱导产生。研究表明，检测IRF3下游靶基因IFNB1和IFIT1的表达可作为评估IRF3激活的可靠指标。然而，监测这些基因的表达水平无法区分IRF3的不同激活状态。对特定条件下IRF3激活状态的全面分析，依赖于对其磷酸化水平和二聚化状态的详细表征10。非磷酸化（形式I）、低磷酸化（形式II）以及高磷酸化（形式III和IV）的IRF3形式6,18,23可通过高分辨率SDS-PAGE中迁移率的降低而有效分离。单体与二聚体形式的IRF3则可通过非变性PAGE分析高效鉴定。当这些方法与针对IRF3特异性磷酸化位点的磷酸化位点特异性抗体联合使用时，分析效果将显著提升。
标准方案对蛋白质的分辨率较低，难以有效分离不同的IRF3磷酸化形式。本文详细描述了一种通过SDS-PAGE与非变性PAGE联用，并结合总抗体和磷酸化特异性抗体的免疫印迹技术，以实现对病毒激活的不同IRF3蛋白形式进行最高分辨率检测的实验方法。体内不同活化形式的IRF3可通过其在SDS-PAGE中的迁移率变化加以区分。此外，IRF3单体与二聚体可通过非变性电泳进行分辨。将这两种互补技术与免疫印迹相结合，是一种经济且灵敏的方法，可获得磷酸化介导的IRF3活化过程完整分析所需的全部信息。

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>用于细胞培养。</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>仙台病毒 Cantell 株</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>由于黏度很高，需剪去吸头尖端并缓慢移液。</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>注册商标，对应辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Nonidet P-40）去垢剂</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>0.2 M 正钒酸钠活化步骤：1) 使用 1 N NaOH 或 1 N HCl 将 pH 调至 10.0。正钒酸钠溶液的初始 pH 可能因不同批次试剂而异。2) 溶液在 pH 10.0 时呈黄色。3) 煮沸至无色。4) 冷却至室温。5) 重新调节 pH 至 10.0，并重复步骤 3–4，直至溶液保持无色且 pH 稳定在 10.0。将活化后的正钒酸钠分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>对硝基苯基磷酸二钠盐六水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>β-甘油磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&amp;nbsp;</td><td>具有细胞毒性</td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (37.5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&amp;nbsp;</td><td>具有细胞毒性</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&amp;nbsp;</td><td>需在通风橱中操作。有毒且具刺激性。</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&amp;nbsp;</td><td>具刺激性。</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>有毒且具刺激性。</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>需在通风橱中操作。对神经系统和黏膜有毒，可能对上呼吸道、眼睛及中枢神经系统有毒性。</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&amp;nbsp;</td><td>具刺激性。</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜 (0.45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>需在通风橱中操作。有毒、具刺激性且易燃。</td></tr><tr><td>丽春红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&amp;nbsp;</td><td>用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&amp;nbsp;</td><td>用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>用于免疫印迹实验中 PBS-T-BSA 的配制。</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>由于黏度很高，需剪去吸头尖端并缓慢移液。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>分装后于 -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。避免反复冻融。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>自制&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>分装后于 -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。避免反复冻融。</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4947s</td><td>于 -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>自制&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>分装后于 -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。避免反复冻融。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-全长</td><td>Actif motif</td><td>39033</td><td>分装后于 -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。避免反复冻融。</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>分装后于 -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。</td></tr><tr><td>Western Lightning 化学发光试剂 Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini CCD 相机装置</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 广谱分子量标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>分装后于 -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。</td></tr></tbody></table>

一种监测irf3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

IRF3 转录因子在抵御病原体的第一道防线中至关重要，主要通过诱导干扰素 β 和抗病毒基因的表达发挥作用。对 IRF3 激活的详细分析对于理解病原体如何诱导或逃逸先天性抗病毒反应具有重要意义。根据其磷酸化状态和单体形式的不同，可区分出多种不同的 IRF3 激活形式。 与 二聚体状态 体内 通过SDS-PAGE中IRF3磷酸化形式的迁移率变化，可实现对IRF3不同活化状态的区分。此外，可利用非变性电泳监测IRF3单体与二聚体的水平。本文详细描述了一种获得最高分辨率以全面获取IRF3活化状态信息的实验方法。该方法结合高分辨率SDS-PAGE与非变性PAGE，并联合使用多种全蛋白及磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析。这一实验策略经济且灵敏，可提供磷酸化介导的IRF3活化过程完整分析所需的全部信息。

图2显示了通过高分辨率SDS-PAGE分离WCE后，使用IRF3总抗体以及针对Ser396和Ser398的IRF3磷酸化特异性抗体检测到的典型免疫印迹图像。在未受刺激的A549细胞中，IRF3在SDS-PAGE上表现为50和53 kDa的两条条带，分别对应于非磷酸化的（形式I）和低磷酸化的（形式II）IRF3。A549细胞经SeV处理3–9小时后，出现时间依赖性的迁移减缓的高磷酸化形式III和IV，这些形式与形式I和II有明显区分。高磷酸化条带迁移至55–57 kDa。形式III和IV也可通过针对Ser396和Ser398的磷酸化特异性抗体特异性地检测到。肌动蛋白（actin）的免疫检测用于各泳道上样量一致性的对照。SeV感染的对照通过病毒核衣壳蛋白（N）的累积来显示，该蛋白迁移至60 kDa。
在图3中，展示了通过非变性PAGE分离WCE后，使用抗IRF3-NES抗体和针对Ser38...

本文介绍了一种能够对IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活进行详细分析的实验方法。该方法结合了高分辨率SDS-PAGE和天然PAGE，并利用多种磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析，从而实现对IRF3活化状态的精确检测。

一种监测IRF3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

转录因子IRF3主要通过干扰素β和抗病毒基因的表达，在抵御病原体的第一道防线中发挥关键作用。

本实验的总体目标是实现对IRF3转录因子磷酸化依赖性激活的详细分析。因此，该方法有助于回答有关干扰素介导的先天免疫应答的关键问题，例如病原体如何激活或诱导依赖IRF3的干扰素β表达。该技术的主要优势在于，它提供了一种经济且灵敏的方法，用于区分不同刺激后产生的不同IRF3活化形式。尽管该方法可用于研究病毒感染人细胞的过程，但也同样适用于经其他病原体或病原体相关分子模式处理的小鼠或人组织。本实验操作将由我实验室的两位细胞Simulink专家Alexa Robitaille和Melissa Mariani进行演示。本实验所用的 A549 细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，于 15 厘米培养皿中的完全 F-12K Ham 培养基中进行培养。感染前 24 小时，按照方案文本所述方法用胰蛋白酶消化细胞，并将细胞转移至 15 毫升锥形管中。在室温下以 350 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 8 mL 完全 F-12K Ham 培养基中，以获得均一的单细胞悬液。使用血细胞计数板计数细胞后，按每 60 mm 培养皿 1 × 10⁶ 个细胞的密度接种，并加入 4 mL 预热的完全 F-12K Ham 培养基。于 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育 20 至 24 小时。培养20至24小时后，细胞应形成90%融合的单层。弃去培养基，用2毫升无血清F-12K Ham培养基或无血清培养基（SFM）洗涤细胞。每60毫米培养皿加入2毫升新鲜SFM。将仙台病毒的冻融分装液用预热的无血清培养基（SFM）稀释，使每100微升中含有60血凝单位（HAU）。轻轻吹打混匀，然后将100微升稀释后的病毒液逐滴加入每块培养板中，使感染剂量为每10的6次方个细胞40 HAU。非感染对照组培养板中不加病毒。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。在感染开始的前1小时内，手动摇晃培养板三到四次。感染后2小时，加入2毫升含20%经热灭活并激活的FDS的F-12K Ham培养基，以获得终浓度为10%经热灭活并激活的FDS。将细胞分别在培养箱中继续孵育1小时、4小时和7小时，以达到总感染时间分别为3小时、6小时和9小时。在每个时间点收集细胞，用于制备全细胞提取物，具体方法见下一个视频片段。开始此操作时，首先移除感染培养基。用一毫升预冷的DPBS刮取细胞。将细胞悬液转移至预冷的1.5毫升离心管中。在4°C下以16,000 × g离心20秒，使细胞沉淀。小心倾去所有 DPBS 残留液。将细胞沉淀重悬于 70 µL 裂解缓冲液中，在冰上孵育 20 分钟。将裂解液置于液氮浴中孵育15秒，进行速冻。然后在室温下解冻裂解液，直至完全融化。涡旋振荡10秒。重复此冻融-涡旋循环三次。在4°C条件下，以16,000 × g离心20分钟。将上清液（即全细胞提取物）转移至新的预冷的1.5毫升离心管中。必须始终将全细胞提取物置于冰上。为了通过高分辨率SDS-PAGE分离全细胞提取物，需制备三块变性电泳凝胶：两块16厘米凝胶用于检测IRF3的不同形式，一块8.5厘米凝胶用于检测仙台病毒蛋白。在每块16厘米凝胶的一个加样孔中加入14微升分子量标准品。然后在每块16厘米凝胶的每个泳道中加入30微克变性的全细胞提取物。在8.5厘米凝胶的一个泳道中加入7微升分子量标准品。在8.5厘米凝胶的每个泳道中加入8至10微克变性的全细胞提取物。以30毫安的恒定电流电泳，直至溴酚蓝迁移前沿到达凝胶底部。对于16厘米长的凝胶，电泳时间大约为3小时；对于8.5厘米长的凝胶，则约为45分钟。开始本分析前，需按照方案文本中的步骤，制备长度至少为8.5厘米的非变性分离胶。将运行装置压入冰中，直至接近下层电泳缓冲液的水平位置，但确保凝胶不接触冰。在冰上以40毫安恒定电流预电泳30分钟。预电泳期间，将置于冰上保存的全细胞提取物与Two-X Native-PAGE上样缓冲液按1:1体积比混合。预电泳结束后立即在凝胶上样孔中加入8至10微克的全细胞提取物。加样时应将样品加至加样孔底部附近，以避免条带变形。将凝胶置于冰上，以25毫安的恒定电流进行电泳，方法同预电泳所述，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。这大约需要40分钟。所有凝胶电泳完成后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜并进行固定。转移步骤详见配套的实验方案文本。三张SDS-PAGE膜（而非Native-PAGE膜）用红色Ponceau溶液染色，以识别分子量标记物。将SDS-PAGE和Native-PAGE的四张膜均在封闭液中孵育后，根据本图所示的顺序，将膜与一抗孵育。在与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育之前，膜必须在PBS-T中进行五次、每次五分钟的洗涤。用 PBS 去除 tween 残留后，将膜置于足量的增强型化学发光试剂中孵育一分钟，确保试剂完全覆盖膜。用滤纸将膜表面液体吸干，随后放入化学发光图像分析仪中以检测免疫反应性条带。在与下一种一抗孵育之前，用 PBS 洗涤膜三次，每次五分钟。当需要在不同抗体之间进行洗脱时，将膜置于预热的洗脱液中，在50摄氏度下振荡孵育20分钟。有关免疫印迹分析的详细信息，请参见随附的实验方案文本。此处展示的是在高分辨率分离全细胞提取物后，使用IRF3总抗体以及针对Ser396和Ser398位点的IRF3磷酸化特异性抗体检测IRF3的典型免疫印迹图像。在未受刺激的细胞中，IRF3 呈现为两条带，分别对应于非磷酸化和低磷酸化的 IRF3 形式。细胞经仙台病毒处理后，会随时间推移逐渐转变为迁移较慢的高磷酸化形式三和形式四，这些形式也可通过针对 Ser396 和 Ser398 的磷酸化特异性抗体特异性地检测到。下图显示了通过非变性 PAGE 分离全细胞提取物后，使用抗 IRF3 NES 抗体以及针对 Ser386 的磷酸化特异性抗体进行免疫印迹所获得的 IRF3 检测图谱。在未受刺激的细胞中，IRF3表现为对应于单体形式的一条单一条带。当细胞感染仙台病毒后，IRF3单体水平下降，同时出现一条迁移较慢的条带，对应于IRF3的二聚体形式，该二聚体也可通过针对Ser386位点的磷酸化特异性抗体特异性地免疫检测到。在进行此实验操作时，需注意不同凝胶的组成和长度对于实现IRF3磷酸化异构体的良好分辨至关重要。完成此操作后，还可采用其他方法（如DNA结合实验或基因报告酸实验）来评估IRF3的活性。观看本视频后，您应能够充分理解如何区分IRF3的不同活性形式。请务必注意，操作病原体可能存在生物安全风险，相关操作应严格遵循所在机构的生物安全指南进行。

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